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徕卡显微镜,GSDIM显微镜的原理

2014-03-04  发布者:admin 

 超高分辨率显微镜,如受激发射损耗(STED)和类似基态耗尽单分子基础的技术其次是个别分子报表(GSDIM / dSTORM),PALM或STORM显微镜依赖于相同的原则,打破了衍射极限:不需要荧光信号在图像采集过程中关闭。 因此,GSDIM显微镜采用荧光团的亚稳暗态的单分子的时空分离。 为了提高进入黑暗状态的概率,特别嵌入介质在GSDIM显微镜的基础性作用。 他们的优化和替代标签和嵌入方法的发展将让我们有机会进一步利用这一激动人心的超分辨方法的巨大潜力。 在这里,我们测试了安装介质的Vectashield®双染色标本进行三维GSDIM适用性,这是此前证明了由Olivier等STORM显微镜

GSDIM显微镜的原理

的关键在于克服〜200nm的衍射极限与GSDIM显微镜是打开和关闭的荧光基团,因此其时间间隔的连续闭。 在这种情况下,荧光团的电子积聚在亚,非荧光暗态(三重态和其他)应用程序由一个高功率激光束的。从暗状态,分子返回随机到基态,进入这是由显微镜检测荧光的周期 - 即所谓的“闪烁”。 这些荧光事件被捕获,然后随着时间的推移。 为了获得高分辨率的图像,受衍射限制的事件是通过施加一个合适的算法读出。 最后,最终的高分辨率图像是通过绘制数千记录事件(图1)的测量位置的再现。

1A

 

1B

1:(A)在GSDIM成像过程数以百计的单帧图像,他们每个人不同的显示闪烁的事件,被捕获随着时间的推移,产生一个高解析度GSDIM形象。 该GSDIM单分子本地化过程(二)简化插图。 为了打破衍射极限,每个闪烁事件的质心具有通过施加一个合适的算法,以位于具有纳米精度。一个明显的衍射受限情况下,以一个高斯函数;详细地说,统计算法拟合的点扩散函数(红色圆锥PSF)确定单个分子的质心坐标。 中的一个,并且在同一分子中的n个闪烁事件的捕获后,计算出的坐标(插图)作图以重构超分辨率GSDIM图像投影(彩色编码圆锥)。 越质心重合,它们将出现在GSDIM图像投影和更好他们会反映单个荧光团的实际位置的更亮。
 

荧光团之间的相互作用和包埋剂:影响定位精度的因素

与GSDIM技术的横向分辨率降低到20纳米,可以实现。在实践中,最终的分辨率取决于单个荧光团,它是依次由荧光团的性质和包埋介质确定的定位精度。 下面的等式[3]表明,定位的精度依赖于由一个单独的荧光发射收集的光子数量:

 

ΔR表示显微镜/物镜的衍射极限,正由一个单独的本地化荧光团和ΔR发出的光子的数目短信的独特荧光团的定位精度。

最后,获得最佳的定位精度的目的是直接关系到一个)最大化每荧光团/事件发射的光子的数目和b)最大限度地提高荧光周期的最小光漂白的数量(=)的努力。 这些特性是由荧光团的性质的相互作用,影响暗状态,因而闪烁性能的周围嵌入介质基本上影响。

在3D GSDIM更高的要求

在三维GSDIM系统的柱面透镜被引入到显微镜的光路中。 所得到的光学散光导致那些闪烁事件不属于在焦平面的椭圆。 这是上面的焦平面事件的点扩散函数(PSF)是竖直细长的,而那些事件所下的焦点的PSF是水平伸长。 该软件终于把每一个闪烁的事件具有鲜明的z坐标。 显而易见的是,这种方法需要一个良好校准的采集每个闪烁事件和高定位精度。 因此,令人印象深刻的三维数据可以与一个优化的嵌入方法(图2)来获得。

2A:微管广角

微管广角概述 
微管广角
 
 

2A:微管GSD

 

2B:线粒体广角

线粒体广角概述 
线粒体广角
 
 

2B:线粒体GSD

 

2:微管和线粒体的三维GSDIM高分辨率图像 
COS-7细胞(A)和假彩色编码的MDCK细胞(B)的线粒体指示z位置0-800纳米的微管。 细胞染色对αTubulin或ATP5B,都与AlexaFluor®647,并嵌入的Vectashield®/甘油三。为了进行比较,宽视场图像中所描绘的相应三维超分辨率图像的上方。 比例尺为10μm。

优点和局限性 - 在GSDIM显微镜嵌入介质

在GSDIM显微镜最重要的一步是让几乎所有的荧光团进入长期黑暗的状态,这是依赖于特殊的嵌入介质。 一些目前已知的介质,如葡萄糖氧化酶混合或聚乙烯醇(PVA),降低的倾向在试样分子氧的量。 氧作为一个三线态猝灭剂,从而减少了在三线态的荧光团的量。 这是GSDIM绝对适得其反,因为三重态的一个重要途径黑暗状态。 因此,在三重态荧光人口减少间接导致的定位精度和最终解决一个损失,因为更多的荧光处于“开”的状态与超分辨率图像采集过程中的干扰。

相对于其他高解析度技术,GSDIM显微镜的一大优势是其受聘于普通光学显微镜方法标准的荧光基团和常规染色方法的用法。荧光和包埋剂的只有结合导致的局限性。 然而,目前使用的GSDIM介质已经允许的范围非常广泛不同的荧光团,甚至荧光蛋白的应用。然而,他们都有各自的优点和缺点(图3) 。 例如最常使用的介质半胱胺或β-巯基乙醇胺(MEA)是适用于大量不同的荧光基团,但不幸的介质,必须用新鲜的和它的效率下降之后显著6小时用量,从而导致减小的闪烁性能。 因此,寻找其他嵌入介质和合适的荧光团是要充分挖掘这一超高分辨率显微镜方法的巨大潜力的重要一步。

 3:在GSDIM显微镜不同的嵌入方法及其优缺点概述。
 

Vectashield® -一种另类的3D GSDIM镜包埋剂

在这种情况下奥利弗等人 能够识别安装介质的Vectashield®(Vectorlabs™)作为dSTORM显微镜足够嵌入介质。在这里,我们测试了,如果这个新的嵌入方法可以为3D GSDIM显微镜采用和搜索优势相比,目前使用的介质。 此外,我们进行了系统的屏幕在使用的Vectashield®结合工作的其他荧光团。

值得注意的是,我们发现,荧光团对AlexaFluor®647AlexaFluor®555(Life Technologies公司™)显示,该包埋剂优异的性能与最高的定位精度在3D GSDIM优良的闪烁性能。 这与奥利弗等人的研究结果一致。AlexaFluor®647AlexaFluor®555,我们能够产生令人印象深刻的3D GSDIM数据(图5)。 同的Vectashield®,AlexaFluor®647和AlexaFluor组合相比,目前使用的荧光团配对像AlexaFluor®647AlexaFluor®488在MEA或葡萄糖氧化酶混合®555甚至表现出卓越的性能闪烁。 这可以通过使用的Vectashield®或MEA分别为(图4)进行,并强调这种包埋剂的巨大潜力事件列表两个闪烁的图像的对比进行可视化。

事实上,荧光一双闪烁的性质是不是这种媒介的唯一大优势:拥有的Vectashield处理标本®/甘油三可在4℃存放数月没有任何损失其优良的闪烁性能(图6)。

像它的相对强的自体荧光和由此产生的背景,尤其是在532 nm激光范围的缺点,可以通过混合的Vectashield被削弱®与含缓冲甘油和50mM的Tris pH值8以1:10的比率。 以405nm的波长,它是用于增加荧光团的荧光的周期数所谓backpumping激光,通常不是必需的,因为其具有优异的的Vectashield®闪烁特性的任一AlexaFluor®647AlexaFluor®555。 这也可以防止背景形成。

在我们进一步的研究,以确定其他合适的荧光团,我们发现,有趣的是,荧光蛋白EYFP可接受的闪烁性能堪比中葡萄糖氧化酶混合物的性能。

不幸的是,我们没能找到其他的荧光团,尤其是在488纳米范围内,其中AlexaFluor®488和阿托®488没有表现出预期的闪烁性能没有。 至于仍然未经测试的考生和越来越多的荧光基团被特别设计用于超高分辨率显微镜的巨大数量,荧光团的数量有限的缺点,肯定会被削弱的未来。 作为MEA的情况下,与的Vectashield®组合闪烁荧光团的名单是肯定随时间而不断检测生长。

激光

染料/荧光基团

闪烁

488纳米

AlexaFluor®488

-

 

阿托®488

-

532纳米

AlexaFluor®532

-

 

AlexaFluor®546

-

 

AlexaFluor®555

+

 

AlexaFluor®568

-

 

阿托®532

-

 

罗丹明6G

-

 

EYFP

+

647 nm处

AlexaFluor®647

+

 

标签1:验证荧光团(也比较奥利维尔等人,列出的荧光团是在COS-7细胞中嵌入的Vectashield®/甘油-三(1:10)通过ATP5B和αTubulin的免疫染色测试。 与Leica SR GSD 3D系统的闪烁行为进行了评价。

答:MEA 
B:Vectashield®/甘油三

 4:MEA和的Vectashield®/甘油-三包埋标本的单帧图像比较。 AlexaFluor的事件列表中的单帧图像®488染色ATB5B标本在100毫米MEA在PBS pH值7.4(A)和AlexaFluor®555染色ATB5B标本在1:10的Vectashield®/甘油三(B)。 相对于(A),AlexaFluor®中的Vectashield 555®/甘油三(B)具有大量的明亮,层次分明,互不重叠的闪烁事件。 这是一个先决条件,较高的定位精度。

 

5A:GSD(右)/广角(左)对比

 

5B:GSD(左)/广角(右)的比较

 

5:3D GSDIM高分辨率图像 - 线粒体和微管的双重染色。 COS-7细胞进行染色对αTubulin和ATP5B与AlexaFluor®647AlexaFluor®555分别。 标本嵌入的Vectashield®/甘油三。 GSDIM的比较和卷积广角3D堆栈。 微管(αTubulin)以红色显示为绿色和线粒体(ATP5B)。

6A

微管 
线粒体
 
 
 

6B

微管 
线粒体
 
 
 

6:三维高分辨率图像比较:新鲜(A)与两个月大(B)标本。 在绿色微管和分别为红色或假彩色编码线粒体(A)3D GSDIM图像,说明z位置。 如在图5中,试样中嵌入的Vectashield /甘油-TRIS。 (B)在图5和图6A中所用的试样,在4℃保存2个月,然后再次成像,仍然嵌入的Vectashield®/甘油-TRIS。

染色方法

COS-7细胞培养一天,在精度盖玻片(Marienfeld的-高级™),然后固定用冰冷的甲醇中。 用PBS含1%奶粉的1小时的块后,将细胞温育在1:100在PBS中的比率是针对ATP5B(圣克鲁斯™)和α-微管蛋白(Sigma公司™)初级抗体2小时/奶粉。 标注与AlexaFluor®647AlexaFluor®555分别与第一抗体,第二抗体在PBS中稀释度为1:200孵育1小时。 除非奶粉块中的每个步骤是伴随着由四个洗涤步骤用PBS。

嵌入过程

如描绘在图7中,细胞包埋在的Vectashield®/甘油-TRIS-缓冲液(的Vectashield®和甘油-Tris-缓冲液中以1:10的比例;甘油以50mM的Tris pH值8),如下所示:75-100μL培养基被放置在凹部滑动的空腔。 然后将盖玻片放置在低气压滑动朝向介质和抑郁症的细胞。 在此步骤中,以避免任何气泡是很重要的。 过量的介质必须由滤纸去除,以确保双组分硅氧烷Twinsil®是能够正确地干燥。 Twinsil的黄色和蓝色分量®为1:1混合,然后施加到盖玻片的边缘。 10分钟后,聚硅氧烷硬化和试样准备好GSDIM成像。

 7:嵌入程序
 

 

展望

由单个荧光事件的区域或时间间隔打破了衍射障碍已经彻底改变了光镜。 在未来,不会有由于衍射极限更高的分辨率的限制,但显微镜与不断减少的限制分辨率的发展揭示了新的挑战,比如GSDIM显微镜的情况下,标签或嵌入介质。 正如前面提到的,在所有的超分辨率方法的关键步骤是获得荧光在黑暗的一面,这是基础,良好的定位精度。 在GSDIM显微镜,这个过程主要是由包埋剂的存在所影响。 这里,嵌入介质和荧光团的性质之间的相互作用是成功的高分辨率成像的决定性因素。

如今,我们拥有强大的荧光团配对像AlexaFluor®647AlexaFluor®488在MEA或AlexaFluor®647和AlexaFluor中的Vectashield®555®/甘油-三,允许收购令人印象深刻的3D超分辨率图像的两种颜色。 在不久的将来我们与包埋剂的Vectashield®结合高效的荧光基团的剧目是一定要通过不断试验和实践经验进行扩展。 再加上像STED显微镜等高分辨率技术,这会给我们细胞生命和它的生化调控的一个全新的观点。