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尼康显微镜物镜的景深和焦深

2014-02-25  发布者:admin 

 当考虑到在光学显微镜的分辨率,大部分的重点放在上的点至点在垂直于光轴的横向分辨率(图1)。 向分辨率的另一个重要方面是在轴向(或纵向)拆分的物镜,即测量平行于光轴,并且最经常被称为景深的分辨能力

轴向分辨率,如水平分辨率,仅通过物镜的数值孔径(图2)决定的,与目镜仅仅放大镜解决,投影到中间像平面的细节。 正如在传统的摄影,景深是通过从在焦点最近的物体面到最远的平面也同时在焦点的距离来确定。 在现场的显微镜深度很短,通常以微米为单位计量。术语的焦点深度,这是指图像的空间,往往是交替使用的景深,这是指对象的空间。

命名这个交换可能会导致混乱,特别是当术语都来特指景深在显微镜的物镜。 几何图像平面预期可能代表一个无限薄的试样部分,但即使在没有像差的,每个图像点被扩大成一个衍射图中上面和下面该平面延伸。 艾里斑,由显微镜物镜产生的衍射图案的一个基本单元,表示通过所述中间图像平面的中心部分。 这增加了有效的在焦深度穿过略微不同的试样的平面的Z轴的艾里斑的强度分布的。

景深和图像深度
放大 数值孔径 景深 
(μm)
图像深度 
(毫米)
4X 0.10 55.5 0.13
10X 0.25 8.5 0.80
20X 0.40 5.8 3.8
40X 0.65 1.0 12.8
60X 0.85 0.40 29.8
100X 0.95 0.19 80.0
表1

焦点深度与物镜的数值孔径和放大率而变化,并且在某些条件下,高的数值孔径系统(通常是具有更高的放大倍率)有更深的焦点深度比低数值孔径的那些系统中,即使在景深是少(见表1)。 这是特别重要的,因为显微摄影胶片乳剂或数码相机传感器必须暴露或照明系统中落在焦点区域内的平面上。 由集中在高放大倍率的小误差并不至关重要的,因为那些具有非常低倍率物镜进行。 表1给出了计算出的变型中字段和图像深度在一系列物镜随数值孔径和放大的中间像平面的深度。

在显微镜的高数值孔径,景深由波动光学初步确定,而在较低的数值孔径, 混乱的几何光学占主导地位的现象。 使用各种不同的标准来确定当图像变得锐利得令人无法接受,一些作者提出了不同的公式来描述在显微镜景深。 场的总深度由下式给出的波和场几何光学厚度的总和

其中,d(TOT)表示的景深,λ是照明光的波长,n为介质的盖玻片和物镜前透镜元件之间(通常是空气(1.000)或浸没油(1.515))的折射率,和NA等于物镜的数值孔径。 变量 e的是,可以由被放置在显微镜的物镜,其横向放大率是M的图像平面上的检测器来解决的最小距离。 使用此公式中,景深(TOT))和波长(λ)必须以类似的单元。 例如,如果D(合计)为以微米来计算的,λ也必须以微米配制(700纳米的红色光被输入到方程为0.7微米)。 注意,字段的衍射限制的深度(在方程中的第一项)成反比收缩与数值孔径的平方,而分辨率的横向限制减少的方式,是成反比的数值孔径的第一功率。 因此,轴向分辨率和可以实现光学切片厚度是通过系统的数值孔径的影响更与其说是比显微镜的横向分辨率。

 

人眼能正常容纳从无穷远到约25厘米,使景深可通过上面的方程比大得多时给予1通过目镜观察的显微镜图像。 另一方面,视频传感器或照相乳剂在于一个薄的固定的平面,以便利用这些传感器场和轴向分辨率的深度是由方程式中的参数给出。 在这些情况下,轴向分辨率由惯例定义为四分之一的第一极小值,上面和下面焦点之间的距离,沿着由物镜产生的三维衍射像的轴线。

对景深​​,和强度的三维衍射图案的分配这些值,基于非相干照明系统(或发射)点光源,其中所述聚光镜的数值孔径大于或等于该物镜。 在一般情况下,字段的增加,最多为2倍,作为照明的增加一致性的深度(作为聚光镜的数值孔径接近零)。 然而,该三维点扩散函数(PSF)与部分相干照明可以以复杂的方式从当光圈功能是不均匀到目前为止讨论出发。 在许多基于相位,对比度产生显微镜模式,场的深度可以变成是出乎意料比从上面的方程预测较浅,并且可以得到非常薄的光学部分。

在数字视频显微镜,在摄像管或CCD的物镜浅焦平面,高对比度达到的高物镜和聚光镜的数值孔径,并且图像的高放大倍数显示在监视器都有助于减少的深度上场。 因此,具有视频,可以得到非常尖锐而薄的光学部分 ,并能以非常高的精度限定的薄样品的聚焦程度。