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尼康显微镜的图像亮度

2014-02-22  发布者:admin 

 不论在光学显微镜中使用的成像模式的,图像的亮度是由物镜,即数值孔径的函数的聚光功率管。 正如照明亮度被聚光的工作数值孔径的平方确定,试样图像的亮度正比于物镜的数值孔径的平方。

不像在显微镜的照明系统的情况,但是,图像的放大倍率也起着决定图像亮度的重要作用。事实上,图像亮度是成反比的横向放大率的平方

图像亮度∝ (NA/M)2

其中,NA是物镜的数值孔径,M为放大倍数。 公式中给出的比例高于表达了透的目的(注:与落射照明的情况有些不同,如下面讨论)的聚光能力。 具有不同程度的光学校正的选定尼康物镜聚光功率的实例列于表1。 在一般情况下,具有高数值孔径的物镜也更好为像差校正。因此,对于相同的放大倍率,高数值孔径物镜收集更多的光线,产生一个更加光明美好校正后的图像(见表1),而整体形象比较好解决。

它是从检查数据在表1中,当一个物镜是用在透照,图像亮度倍率增大迅速减小明显。 用于落射照明特定物镜的利用率产生越来越明亮的图像,提高放大率,而情况往往相反与透射光相同的物镜。 术语F(反式)F(外延)是指一种物镜的聚光能力,并根据下列公式计算

F(trans) = 104 × NA2/M2
F(epi) = 104 × (NA2/M)2

从理论上讲,照明的强度取决于聚光镜的数值孔径和光源的图像的缩小倍率的平方的平方(实际上,视场光阑的图像变得明亮,因为它是由更小,根据该方法)。 其结果是,试样图像的亮度成正比的物镜的数值孔径的平方作为其到达目镜(或相机系统),并且还成反比的物镜放大倍率。 因此,在透射光下检查标本时,改变物镜,而不改变聚光镜影响图像的亮度响应于变化的数值孔径和放大倍数。

选定物镜的聚光能力
校正 放大 数字的 
光圈
F(trans F(EPI)
Plan Achromat 10X 0.25 6.25 0.39
Plan Apo 10X 0.45 20.2 4.10
Plan Fluorite 20X 0.50 6.25 1.56
Plan Apo 20X 0.75 14.0 7.90
Plan Achromat 40X 0.65 2.64 1.11
Plan Apo 40X(oil) 1.30 11.0 18.0
Plan Fluorite 60X 0.85 2.01 1.45
Plan Apo 60X(oil) 1.40 5.4 10.6
Plan Apo 100X(oil) 1.40 1.96 3.84
Plan Apo 100X(oil) 1.45 2.10 4.42
表1

在落射照明的情况下,同样的考虑也适用,但该目的也作为聚光镜,而这必须考虑图像的亮度时,必须考虑到。 作为物镜放大倍数增大时,光源图像缩小(缩小的)由具有同等量,从而导致亮度水平,是较少依赖于物镜放大倍率,更依赖于数值孔径(亮度是由数值孔径的四次方管反射照明)。 在实践中,图像的亮度号码可能有所不同(见表1)由于物镜后孔大小的差异。

当光线水平限制,最高的数值孔径的物镜应该采用,但的放大倍率双方的物镜和目镜应保持在最低水平所需的分辨率兼容。 在许多情况下,制造商正在提供油浸物镜具有较高的数值孔径,并且相应地更高的图像的亮度值,比同类倍率高干燥同行。 例如,表1中的40倍计划复消色差物镜具有消色差透镜40X干物镜规划的数值孔径的两倍,并且产生4倍的图像亮度在透射光。 这些物镜产量下的落射荧光照明图像亮度的16倍的差距,与高数值孔径的油浸产版本最亮的图像。

在通过显微镜的光学元件,传输作为入射光强度的函数的光的量,是在荧光显微镜下尤其重要。 在高分辨率荧光成像需要高放大倍率与图像的亮度损失最小的情况下,具有透光性,最大程度最高的数值孔径物镜应该被采用。 如上所述,图像的整体亮度急剧减小放大率的增加,所以在荧光显微镜的部件应仔细选择通过光学列车最大化的光通过量。

,利用落射照明荧光显微镜配备有服务于这两个聚光镜和物镜的双重目的的物镜。 光通过激发滤光片和从过滤器中的立方体的二色镜表面反射,通过物镜第一传递,以形成必要的照明的一个锥形激发样品。 通过安装在试样的荧光基团发射的次级荧光,然后通过同一物镜系统被投影到目镜或成像系统之前收集并通过二色镜和屏障过滤器传回。 作为聚光镜的高数值孔径的物镜将增加信号(光)的强度的方式,是成正比的数值孔径的平方。 因为物镜的聚光功率也成比例的数值孔径的平方,图像的亮度会随着物镜的数值孔径的四次方根据公式变化

图像亮度(荧光)λNA 4 / M 2

注意,在荧光显微镜下,亮度也成反比的物镜放大倍率的平方。 因此,对于相同的放大倍率,这两个照明场的图像的亮度,并与物镜的数值孔径,这是主要的原因厂家生产设计为荧光显微镜非常高的数值孔径的物镜的荧光图像显着地增大的物镜。

来观察标本的目镜进一步放大投影到显微镜的中间图像平面中的衍射限制图像,并且也有助于减少试样的整体观察到的强度。 事实上,图像的亮度成反比,目镜倍率的平方,因此需要使用具有所需的最低放大率方便地观察标本的荧光目镜。 因此,有可能通过使用耦合到所述功率最低的目镜可用的最高的数值孔径的物镜,以最大化图像的亮度在荧光显微镜(尽管10×目镜是最常用的)。 这些言论主要适用于具有均匀度照明的大样本区域。 中的光(例如,微小荧光球)的锐聚焦的点源的情况下,粒子的图像应该是受衍射限制的,并具有这样的尺寸,是独立的倍率。

在荧光显微镜中,图像的亮度是由照明的强度,所述荧光团的量子产率,并且在显微镜的聚光能力来确定。 的照明的强度和较高的量子产率,更大的荧光信号和图像变得直到所有的荧光团的明亮饱和更大。 同样,在偏振光,图像的亮度是由照明强度和试样的双折射相位差管。在值高达四分之一波长相位差的,更大的相位差产生更大的双折射率,因而更强的信号。

在这两种情况下,图像的亮度是由从试样的信号,这是照明的强度和由试样中引入光的变化的产品管。 在发光,其中,所述样品本身发射光的情况下,图像的亮度由光的幅度,或信号,由试样发出的光明显地制约。

在其他模式下的显微镜,如相位对比,微分干涉对比(DIC),暗场,霍夫曼调制对比等,照明和图像对比度的强度可以独立地变化。 然而,从图像信号,即每单位变化的光学参数的图像的亮度的增量(例如,在路径长度差),仍然会通过光照​​强度和每个所产生的对比度的乘积来确定单位变化的光学参数。 为了检测在任何光学参数的微小变化,在显微镜应最大限度地从变化的特定参数产生的信号。

对于给定的聚光镜和物镜的数值孔径,放大和照明亮度,在显微镜产生的图像的亮度仍然可以变化取决于光透射通过光学元件。 传输取决于几个因素,包括吸收由透镜元件和水泥,反射损耗在光学接口,和灯套的透射率,漫射屏,过滤器,偏振器,以及其它的辅助光学元件。对于高数值孔径物镜选定的一组典型的传输曲线被示于图1。 这些值都或多或少地代表任何类别从一个特定的制造商的物镜,但是,即使在该特定类型的测定对于这些曲线,确切的传输值可以有所变化取决于,例如,抗反射涂层和该批次的玻璃用在个别镜头。

一些光学元件的透射率(亮度传输作为入射强度的百分比)可以是波长相关的,即使在可见光范围内,如图1所示。 另外,在外面可见的波长范围内,透镜,棱镜,幻灯片,和安装介质的样品的透射率可下降明显。 这个事实是通过在图1中,示出的20×平面图氟物镜传输曲线,它示出了在透射率稳步下降的波长400和700纳米之间增加了举例说明。 在该系列的其他物镜不表现出波长依赖性的这种显着的程度。