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奥林巴斯显微镜,标准分辨率和性能问题

2014-02-14  发布者:admin 

 分辨率在光学显微镜通常由光学单元称为瑞利判据,它最初是制定确定的二维望远镜的图像分辨率的方法进行评估,但已蔓延到在光学许多其他领域。

瑞利准则是在光从样本生成的,并且是不依赖于用于产生所述图像的放大率两个点源之间的最小可分辨的距离来定义。 在一个二维图像,两个点源是可解析的,如果他们的艾里斑的衍射图案是不同的。 根据瑞利准则,两个紧密间隔的艾里磁盘是不同的,如果他们是距离大于在其中的一个艾里斑的主要最大值与该第一最小值,第二艾里斑(如图1所示)相一致的距离。 如果该点光源是相等的波长的话,他们的艾里盘具有相同的直径,并瑞利准则就等于一个艾里斑的半径,从它的点的最大强度的测量,以最小强度的第一环。 对于给定的荧光波长的单色图像,瑞利判据可以使用在许多光学和显微镜教科书中的标准公式进行估算

D =0.61λ/NA

其中d是瑞利准则,λ是发射光的波长,NA是物镜的数值孔径。 请注意,d值越小,分辨率越高。

如图1所示,是在数学上由光的两个点源产生的光强度分布(蓝线)。 该配置文件可以被认为是通过艾里斑(实际上,在焦点的点扩散函数的xy图像)来表示像素强度沿一条线。 时的1点扩散函数的最大强度的第一极小的另一个重叠的瑞利准则进行解析得到满足。 对于两点发射在同一波长,此间隔距离对应于一个单一的点扩散函数的中央亮区域的半径(或峰的最小距离)。

上面概述的分辨率公式是用于评估在图像平面分辨率有用的,但不沿光轴的显微镜,信息是成功的分析通过反卷积技术关键(z轴)。 然而,适当的公式用于轴向瑞利准则可以使用类似的推理来推导。 当他们的轴向衍射图案是不同会产生光的两个点源之间的最小可分辨轴向距离。 这是通过一个事实,即一个点源的轴向衍射图案不是圆盘状,但具有沙漏形状的点扩展函数的图像的光斑或在xz或YZ平面复杂。 然而,这种沙漏形状有一个明亮的中心区域,一样的艾里斑。 因此,轴向瑞利准则可以通过利用从最大强度的点的距离,以沿着z轴方向的中央亮区域的最小强度的第一点来定义。 这个值可以使用下面的公式来估算

=2λη/(NA)2

注意,公式包括η,所述安装/浸没介质的折射率,在分子中。 安装和浸没介质被假定具有相同的折射率,否则,球面像差导致的分辨率的降低。 读者也应该注意,所有的讨论的标准假设无像差的成像条件下,一种不切实际的方案在实践中。 上面列出的轴向分辨率方程的仔细研究表明,降低了液浸介质的折射率可以提高Z轴分辨率。 然而,这种情况不会发生,因为物镜的数值孔径(也取决于折射率值)被引入具有低的折射率的成像介质时降低。 因为轴向分辨率随数值孔径的平方,在物镜的数值孔径的减少远远超过通过减少在成像介质的折射率来实现的增益和分辨率受到损害。 通知还在xy平面中的分辨率而变化仅与数值孔径的第一电源,而轴向(或z轴)的分辨率与数值孔径的平方而变化。 这个重要的区别意味着,XY分辨率和z轴分辨率都与增加数值孔径提高,但Z轴分辨率更可显着提高。

Z-分辨率是密切相关但不完全相同的景深的概念。 景深是经典定义为标本,在焦点显微镜的特定焦点设置出现在最终图像的厚度区域。 当检查的二维图像中,试样的某一部分被聚焦到一个单一的平面。 出现同样的作用聚焦在图像中的功能可驻留在样品的不同深度。 焦点的定义是有些主观,但是字段“单元”的一个标准深度通常被定义为一半轴向瑞利单元

=λη/(NA)2

这是偶尔使用,而不是在轴向瑞利准则另一个标准是在点扩散函数的中央亮区的半最大值(FWHM)的整个宽度。 公式估算全宽半值在共聚焦显微镜中出现几个显微镜评价和是相同的,上述的瑞利准则在宽视场显微镜。 应该强调的是,这些都是粗糙的表情,让实际的估计。 它们不是严格的分析公式,这需要矢量波理论。

还应当理解的是,任何分辨率的标准是不分解的绝对指标,而是任意的标准是用于比较不同的成像条件是有用的。 瑞利准则特别适用于其中两个自发光的物体必须区分开来的情况。 在其他情况下,如微分干涉对比(DIC),明场,暗场或显微镜,其他条件都将适用。 在一些应用中,如移动物体的定位,下面的瑞利极限分辨率是可能的。 这凸显了一个事实,即分辨率是任务相关的,不能随意定义适用于所有情况。

另外,分辨率也取决于在很大的程度上图像的对比度,或对从背景区分样品产生的信号的能力。 相反在很大程度上取决于诸如固定品质,抗渗透,染色均匀度,荧光褪色,和背景荧光样品制备技术。 优化的试样制备方法,可以更为显着,并以较低的成本比光学或计算机提高分辨率。 然而,假设一个高质量的制剂,适用于任何应用的分辨率的限制总是依赖于点扩散函数和瑞利准则产生至少在该值的大小的基本处理。

分辨率和对比度的改进

内时其解卷积算法是基于原则的框架,它是合理的质疑的图像质量何种程度的定量的改进可以从迭代解卷积可以预料的,以及如何最好地评估和比较各种算法的性能。 作出这种评估的一种方法是测量的大小和亮度,前后反褶积,已知大小的测试对象。 图2给出了从一个subresolution(0.1微米)与利用油浸物镜(1.4数值孔径)一个宽视场成像系统中获取的荧光珠的图像堆栈数据。 所有像差进行了仔细最小化数据收集之前,并且因为有离焦的没有从任何其他对象信号,该微小珠子代表一个接近理想的样本用于此目的。

在图2中,黄线表示的原始图像数据,而红色线表示由受约束的迭代解卷积恢复从图像数据。 为了结垢特性图中,各强度值已被归一化到其自身的图像堆栈的最大值。 如果没有这样的归一化,从原始图像数据也只是勉强地是在图上可见,因为近焦点像素强度是如此的亮得多的恢复图像比原始图像。 每个图像堆栈的总积分强度,但是,在这两种情况下是相同的。

量化的迭代解卷积来实现分辨率的提高,像素强度测定在平行于光轴的线穿过胎圈的中心,前后恢复。 每个像素的强度进行作图(图2(a)),归一化后,如沿z轴从胎圈(0微米)的中心的距离的函数。 于z轴的强度分布的半最大值(FWHM)处的全宽度取为胎圈的直径,并测量0.7微米中的原始图像和0.45微米的恢复图像(实际的对象测量0.1微米)。 由于这个恢复温和增长的分辨率只会很少露出一个生物标本结构,这不是在原始图像中可见。

从恢复所产生的图像中的一个主要的变化是明显的,在图2所示的数据(b)中,它表示所有的像素值中的每个焦平面的总和(积分像素强度)为焦点深度的函数。 对应于原始数据的曲线(在处理之前)示出了显著外的聚焦强度在距胎圈2微米的距离。 恢复迭代反卷积转移大部分失焦的强度恢复到局灶性起源的飞机。 其结果是在图像的对比度显著改善,使其更容易解决和图像中的辨别特征。 在绘制该数据,在原料和恢复图像栈的每个焦平面上的像素相加的强度进行归一化到平面的图像堆栈的最大值和最小值。 求和强度绘制为焦点(Z轴)从胎圈中心(0微米)的距离的函数。 信号强度从外的焦点样品体积在焦恢复到产生主要对比度改进,以及增加了信号 - 噪声比。 应当注意,然而,在整个图像的积分强度(实际上,各平面的求和强度之和)是在原料和恢复的图像是相同的。

前面的讨论概括评估的迭代解卷积算法的性能的一种手段。 的许多可用测定其中的算法,产生最佳的恢复带来了另外一个问题了显微镜 一些网站的应用比较不同算法的结果,但这种比较可以被误导的原因有多种。首先,算法通常由执行这些还原合成的球形物体,如用来收集在图2中给出的数据,或理论的对象甚至计算机生成的图像的珠的图像进行比较。 性能之间的关系,评价利用测试对象和与实际生物标本表现并不简单。 此外,除非该比较是定量进行,与已知大小的物体,这是难以评估更赏心悦目结果是否确实更准确。 例如,该算法可能侵蚀的特征的边缘,这使它们更清晰,但混杂测量。

另外一个问题是,算法的比较,通常由出版方有兴趣(通常金融)的比较,这使得它们潜在偏见的结果。 通常情况下,这些政党比较反卷积算法,其实现他们已经开发和完善多年,具有即在其最根本的形式实现非优化算法,最初发表。 然而,如前面所讨论的,在速度,稳定性和分辨率的改善大的差异可以归因于一个算法的实现和优化的细节。 因此,唯一公平的比较是认识软件包之间,而不是基本的算法之间。

强烈建议去卷积软件的任何潜在买家比较对自己数据的各种软件包的性能。 这可能需要一定程度的确定,因为许多公司的销售代表将定期保存图像的一种专有的文件格式,它往往不能被竞争对手所开'的软件。 为了比较不同的软件包复原后的图像,有必要做出一定的图像保存在一个共识文件格式。 目前与最广泛流通的格式是一个堆栈中的标记的图像文件格式(TIFF)的顺序编号的文件,每个代表该三维图像的焦平面(未突起)。 优选的是,有一组可以由各种软件包被评估被处理示例图像文件和点扩散函数的文件。 采用的算法的评价自己的图像和点扩散函数的优点在于,特定的样品制备方案中,目标,放大,噪声电平,信号强度,球面像差的存在程度,和其他变量会影响反褶积的质量极大。

电脑速度和内存使用情况

越来越多的计算机处理器速度,安装的随机存取存储器(RAM),和总线速度的量都增加卷积速度的手段。在去卷积,一个数字,代表不同形式的图像的大数据阵列被同时存储在RAM中,并通过总线周围移动的计算机内。 其结果是,RAM的容量是用于三维图像的快速处理关键的,因为是总线速度。 作为一个经验法则,图像处理计算机应配备至少3倍的RAM作为被去卷积的图像的大小。 此外,具有快速总线速度的计算机性能要好得多,即使名义上较慢的中央处理器。

图像文件的大小通常报告的计算机的操作系统。 然而,如果这是毋庸置疑的,大小可通过像素的图像中的总数量由每像素的字节数(被称为位深度 )来计算。 本机的位深度的图像的原本由数字成像捕捉系统,它可以产生每像素8,10,12,或16比特置位。 一旦图像被获取时,位深度由软件包和计算机系统(; 8比特等于1个字节,这是几乎总是8位或16位)来确定。 在彩色图像中,每种颜色必须被单独存储和去卷积,所以必须小心,以确定比特深度的完整图像,而不是仅仅为一个颜色通道。 该计算是如本例所示三维图像的堆栈,其中每个面是512×512个像素,含64的光学面,用三种颜色的每像素8位(或每像素1字节)测量512×512的×64×3×1 = 50兆字节(MB)。 图像文件头数据可能略有增加这个计算大小。