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徕卡显微镜,简介冷冻置换

2014-02-10  发布者:admin 

 冷冻取代是脱水的过程中,在温度足够低的执行,以避免冰晶的形成和规避后常温脱水观察到有害的作用。 在冷冻取代的“冻结”的水是由一种有机溶剂,它通常还含有化学固定剂溶解。细胞成分(冷冻固定)和树脂包埋的冷冻替代链接的即时物理固定。 一旦置换完成后,样品被逐步回暖,并进一步作为常规方法制备的样品进行处理。 成功的低温定影接着FS表示微细结构的优异保存相比,化学固定技术在有机溶剂中和水合层周围的生物分子的变化的大分子聚合可以在非常低的温度下发生,即使,但它是合理的假设,FS在温度低于特定阈值保留水化壳

该技术还提供了检查厚(200-300纳米的部分)的样本由ET,使得相对大的细胞量可以在3D进行研究的可能性。 这种方法是非常有益的不同细胞器和随机发生的事件之间的复杂关系的理解。

图 1:酵母(酿酒酵母)。 礼貌面包车Donselaar EG,Humbel兽王,乌得勒支大学,荷兰;插槽JW,大学医疗中心,乌得勒支,荷兰。

高压电子显微镜冻结,冻结取代拟南芥根尖细胞

礼貌:德RyckeŘ

协议HPF - AFS的形态分析

拟南芥根(突变PIN1pro:PIN1-GFP; bex5-1)切下,浸渍于20%(重量/体积)BSA和在高压冷冻机(Leica EM PACT)立即冷冻。

冷冻置换进行中含1%双蒸2 O,1%的OsO 4和0.5%戊二醛在4天期限如下干丙酮使用Leica EM AFS2:

  • -90℃下放置24小时,
  • 每小时增加2℃,15小时,
  • -60℃下放置24小时,
  • 每小时增加2℃,15小时,和
  • -30℃下放置24小时。

然后将样品洗涤3次,在纯丙酮在-30℃,0℃,并缓慢升温至4℃,渗透逐步3天以上,在4℃中的Spurr的树脂和嵌入在胶囊中。 在70℃下进行16小时的聚合反应。

超薄切片用超薄切片机(Leica EM UC6)在20℃下制成和后染色中的Leica EM AC20进行40分钟的醋酸双氧铀在20°C和柠檬酸铅10分钟 网格被看作用JEM 1010透射电子显微镜( 日本电子 ,东京,日本)使用成像板技术从80千伏运行Ditabis (德国Pforzheim)。

 

 2:超微结构拟南芥拟南芥主根细胞PIN1pro :: PIN1 =绿色荧光蛋白; bex5-1治疗50 uM的博鳌亚洲论坛1小时。

 

高压免疫电镜冷冻和冷冻取代的小鼠心脏

礼貌:德RyckeŘ

协议HPF - AFS小鼠心脏IEM

从野生型(WT)和αT-连环KO(KO)小鼠的小鼠心脏组织中切下,浸渍于20%(重量/体积)BSA和在高压冷冻机(Leica EM PACT)立即冷冻。 冷冻置换进行中含有2%双蒸2 O和0.1%戊二醛在4天期限如下干丙酮使用Leica EM AFS:

  • -90℃下放置24小时,
  • 每小时增加2℃,15小时,
  • -60℃下放置24小时,
  • 每小时增加2℃,15小时,和
  • -30℃下放置24小时。

然后将样品洗涤3次,在纯丙酮在-30℃,0℃,并缓慢升温至4℃,渗透逐步3天以上,在4℃在LR-White和嵌入在胶囊中。 用紫外灯超过​​6天,开始于20°C和37°C。在结束徕卡EM AFS进行聚合

超薄切片用超薄切片机(Leica EM UC6)在20℃下制成和后染色中的Leica EM AC20进行40分钟的醋酸双氧铀在20°C和柠檬酸铅10分钟

网格被看作用JEM 1010透射电子显微镜( 日本电子 ,东京,日本)使用成像板技术从80千伏运行Ditabis (德国Pforzheim)。

免疫标记和标签进行量化如前所述进行

以下主要抗体用于免疫EM:

  • Cx43蛋白多克隆兔(1:50; Sigma)和
  • 结蛋白多克隆兔(1:50; Abcam公司)。

在Li等人的文章还有其他的图像显示,为鞭策'的树脂和HM20(与徕卡HPM010)处理(与徕卡EM PACT与leica EM AFS),但是这是没有问题的,我们的协议在这里说明一下的是为显示图像。

3:Cx43蛋白银扩增从αT-catenin的KO小鼠心脏的闰盘(ICD)的代表缝隙连接单免疫标记。 
4:Cx43蛋白银扩增从野生型小鼠心脏的闰盘(ICD)的代表缝隙连接单免疫标记。 
 5:结蛋白在从αT-catenin的KO小鼠心脏一桥粒单免疫标记。 
6:结蛋白在从αT-catenin的KO小鼠心脏一桥粒单免疫标记。
 

Hep-2细胞感染了肺炎衣原体

礼貌:Kaech一

协议

Hep-2细胞感染了肺炎衣原体的培养在碳包覆6毫米蓝宝石光盘。 细胞呈高压使用6毫米CLEM中板与下面的设置冻结在徕卡EM HPM100:蓝宝石光盘细胞,垫片200微米,裸蓝宝石圆盘,2垫片200微米。 乙醇被用作同步液在室温下冷却之前的压力传递。 冷冻后,将蓝宝石圆片从中间板的无水丙酮除去在-90℃,并立即转移到含有2%的OsO 4的无水丙酮2ml的Eppendorf管中,预冷至-90℃的徕卡EM AFS2冻结 - 替换单元。

样品被取代

  • 在-90°C 8 H,
  • 在-60℃下8小时,
  • 在-30℃下8小时,并
  • 在0℃下1小时

与周期性温度变化30℃/ h的梯度。 然后将样品洗涤两次,用无水丙酮在4℃下,浸渍于33%的Epon /爱牢达在无水丙酮中,在4℃过夜,然后66%的Epon /爱牢达在无水丙酮中,在4℃下进行6小时,最后在100%的Epon /爱牢达在室温下搅拌2聚合之前小时60℃下在1.5ml的Eppendorf管中至少24小时。 切片进行染色后,用醋酸铀和柠檬酸铅。

注意:使用乙醇作为在高压冷冻同步流体是没有必要的蓝宝石圆盘细胞培养单层。 一个简化的夹层结构可用于通过将蓝宝石圆盘中的CLEM中间板与细胞面朝上覆盖有铝试样载体浸渍在1 - 十六碳烯与100μm的空腔面向所述细胞以提供类似的结果。

图。 7:Hep-2细胞感染了肺炎衣原体,概述的薄截面。 N,核,怒族,核仁;在,包容。 比例尺为5μm。
 
图。 8:高倍列入细胞在图1所示。 C,肺炎衣原体细胞,G,糖原颗粒;去,高尔基体,M,线粒体;山,微管,R,核糖体,V,囊泡。 比例尺为500nm。
 
图。 9:Hep-2细胞感染了肺炎衣原体的薄截面。 概述。 N,核,怒族,核仁,NP,Nucleopores,Z,闭锁小带adhaerens。 比例尺为2μm。
 
图。 10:Hep-2细胞感染了肺炎衣原体的薄截面。 更高的放大倍率在图3中选择区域。 A,肌动蛋白细丝; MB,Mulitvesicular体;万吨,微管,N,核,NP,Nucleopores,R,核糖体,Z,闭锁小带adhaerens。 比例尺为1μm。
 
图。 11:Hep-2细胞感染了肺炎衣原体的薄截面。 更高的放大倍率在图4中选择区域。 CP,网格蛋白包被坑,山,微管,R,核糖体,Z,闭锁小带adhaerens。 比例尺为200nm。
 

更多应用程序映像

礼貌:面包车Donselaar EG,Humbel兽王,乌得勒支大学,荷兰;插槽JW,大学医疗中心,乌得勒支,荷兰

图。 12-14:鼠标软骨

 

 

图。 15:肝HepG2细胞 
图。 16:酵母