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尼康显微镜数码影像色彩平衡

2014-01-21  发布者:admin 

 光学显微镜采集准确的色彩平衡的影像都可以甚至经验丰富的显微镜,不管他们是否采用传统的感光胶片乳剂或较新的固态数字相机系统的挑战。电子图像捕捉技术的运用依赖于同一个熟悉的属性的光一样传统的基于胶片的显微摄影,但执行白平衡调整色彩平衡的能力是电子图像传感器的独特功能,是不是所有直观地寻求调查从显微镜捕获的数字图像。

当拍摄的数字图像看房相比,通过显微镜目镜观察,或在计算机显示器上实时观看图像,色彩变化往往是相当惊人的,并试图调和两者之间的差异,可令人沮丧。 一个因素造成这种差异是,在成像过程中,发生在成像条件相当的住宿人的视觉系统对变化下意识的,并且通常没有意识到,直到图像被记录和静态版本进行评估,通常在彩色再现的问题不同的观看环境。

示于图1是一系列视场在不同的照明色温度条件记录在相同的显微镜的数字图像。 试样是在比较低的(二十分之一波长的)偏差相位差观察在微分干涉对比(DIC)的粘附印度麂鹿皮肤成纤维细胞的单层培养物。 在目镜中,细胞培养中出现的颜色中性灰色时诺马斯基棱镜被调整,以实现图1所示的光程差,以及颜色转换滤光器被添加到光路径,以提高卤钨灯的色温灯从3200K到5500K左右(日光值)。

未经色彩转换过滤器,DIC样品在图1中出现的中性灰色,但表现出明显的全局黄色色调,白炽灯照明的特性,当通过显微镜目镜观察。 如果数码相机的白平衡功能没有被激活,并且施加到电流镜配置,在这些条件下拍摄的图像也出现有一个整体黄色的(图1(a))。 插入一个彩色转换滤光器插入光通路呈现的图像与目镜轻微蓝色调,和相应未经白平衡校正拍摄的数字图像保持或放大该颜色偏移(图1(c))。 应用白平衡算法来无论是与钨或日光平衡照明拍摄的图像消除阴影,由于色温度的影响,如图1(b)所示。 注意,不同的颜色校正的值由算法来平衡图像的色调的质量,取决于照明的色温。 钨丝灯照明需要修正值增加蓝色和减少红色,而相反是真实的日光照明。

实现在与耦合到光学显微镜数码照相机系统获得的图像适当的色彩平衡取决于多种因素,首先是建立正确的照明条件和精确显微镜光学对准,并最终在图像捕获阶段。 在获得所希望的图像的白平衡调节中的作用是特别重要的,而这种控制功能可以用于任何捕获的样品的最忠实再现,或试样的目的是纠正不必要的色偏通过生成一个故意修改的表示编制文物。

从概念上讲,在白平衡粗调整是必需的,使图像传感器的响应到适当的范围内为一般照明的条件(类似于选择一个类别的电影),而细微的修改是有点类似于在电影中使用的色彩补偿滤镜基于摄影。 照射源和检测器响应的匹配,即使,光通过显微镜通常被修改,有些不可预测的,通过在光路中的检体和任何其它部件。 因此,得到的最终图像可以从所希望的结果的色彩平衡而变化。 这是极为重要的要明白,不同的试样,和一个试样或许局部区域,施加于成象光的独特效果。 因此,如果需要精确的色彩平衡,变量诸如白平衡调整,必须仔细控制。

的色彩平衡图像一般概念

在光学显微镜图像的形成是根据光的基本特性,包括强度和产生的视觉感知的颜色,以及相关的色温度值的光谱特性。 色温的特性可以精确地定义为与一个标准的参考光源,并且是可衡量的工具性,但是不可靠的预测如何每个样品将在一个给定的成像情况进行渲染。 此外,具有相同色温的光源,可具有显着不同的光谱组成和同样的条件下观察时,产生显着不同的图像。 除了这种情况的影响差异很大的反差增强辅助组件可以引入到显微镜的光学系统。 明场,暗场,相衬,DIC,偏光,霍夫曼调制对比度和荧光照明所有在场的不同表现色彩平衡校正,必须经常考虑在个人基础上的样品和光照条件加以解决。

呈现在图2中不同的照明色温和对比度增强方法的条件下拍摄的几个数字图像。 人类睾丸癌(精原细胞瘤)的钨 - 卤素照明的曙红和苏木精染色薄切片示于图2(a)所示。 注意整体偏黄弥漫整个图像时相比,正确的色彩平衡的图像(图7(b)所示),使染色部分折色。 这是发生在明场显微术时,日光色转换滤光器没有被插入到光路径中的常见错误。 另外,蓝色的日光过滤器,而无需校正的数字照相机的白平衡的光路可能会导致整体偏蓝的色调为数字图像,如图2(b)所示。 在单层培养活HeLa细胞的这种形象揭示了当相机不能正确色彩平衡所发生的偏蓝。 应用白平衡算法来捕获软件将渲染的图像中在显微镜的目镜中观察到的灰度值。

与其它对比增强技术获得的图像产生类似的问题,当显微镜照明的日光的色温不均衡和照相机系统不具有的白平衡调整正确。 在图2(c),2(d)和2(e)所示,用微分干涉对比(DIC),偏振光,霍夫曼调制对比捕获的图像,分别都已经色彩平衡值移位到较暖(黄色)的色调。 在DIC图像(图2(c)),功能出现浑浊和正常的灰阶色调以棕色和红色的各种色调渲染。 同样,重结晶尿素的偏振光图像(图2(d))也出现绿色,而放射的霍夫曼调制对比度的图像(图2(e))具有决定性的绿色背景(和亮点)。 荧光图像(图2(f)),通常不会从色彩平衡问题受到影响,主要是因为它们是由一个小的波长范围内占主导地位。

变化的色彩平衡或彩色再现的现象是公由大多数人在日常活动中确认,通常被接受为天然发生不需要任何干预。 例如,近黄昏日光的黄金质量是非常熟悉的,因为是颜色,而不是荧光灯的办公室照明出现截然不同的烛光中的事实。 人类视觉系统的功能由眼睛的感官反应与由大脑解释的信号组合,以适应变化的光的颜色和强度。 其结果,白色物体被解释为白色广泛变化的照明条件下进行。 通常情况下,如果白色被认为正确,其他颜色和色​​调落入地方为好。与此相反,图像传感器,传统的胶片或现代数码相机是否产生对照明的响应被固定在曝光的时刻。 所产生的图像的颜色质量取决于设计成片彩色感光层,或固态传​​感器的各个颜色感测元件(像素)的灵敏度的具体响应。 与任一捕获方法,该图像的颜色平衡可通过引入彩色滤光片修改成的照明或成像光的路径,但该数字方法具有使传感器响应的电子,精密调整的鲜明额外的优势。

数码相机白平衡基础

来记录图像,不论是传统的照相胶片或数码成像装置,通常被设计或调节,使得它的基线响应匹配照明的广泛的一般类别的传感器。 照相胶片,例如,最常用的有两种主要类别,适合于在任一日光或与钨的照明光源使用制造,并且精细的调​​整,以膜反应为关键应用是通过使用适当的过滤器进行。 固态传感器,这是典型的电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)光电二极管检测器,能够被调整的电子以匹配他们的响应特性,以各种照明源。

CCD的单个光感测元件或CMOS检测器是固有的单色,要么通过依次传递入射光通过红色,绿色和蓝色滤光器到整个传感器(产生对每个颜色,它们随后合并分离的图像实现其色灵敏度),或通过被放置在一个镶嵌图案在阵列的每个像素的微型聚合物薄膜过滤器。 最常见的过滤器装置是红色,绿色和蓝色的彩色滤光片的排列拼接阵列,重复整个传感器阵列的GRGB图案。 这样的安排,称为拜耳过滤模式(参见图3(a)),集成了两倍多的绿色元素,红色或蓝色。 额外的绿传感器的像素允许成像设备更接近人类视觉系统,其特征峰在灵敏度在绿色光谱区的颜色反应(约550纳米的波长;图3(b)),因此,方便了输出具有目视可接受的色彩平衡的影像。 来自传感器阵列的对应像素(或单色图像)的单独的红色,绿色和蓝色信号幅度的调整是通过白平衡控制功能实现的,以允许所获取的图像的色彩平衡。 一些相机系统通过软件来代替或附加于硬件控制执行这些调整。

用于通用应用的数码相机所熟悉的许多显微镜和正越来越多地适于连接到显微镜作为一种经济的替代致力于研究级的成像系统,虽然他们的能力通常较为有限。 由于涉及在利用数码相机进行常规用途的技术可扩展到理解的因素,例如在显微镜应用白平衡调节,它最初考虑的非技术的情况是有用的。 支配白平衡调整的基本概念是相同的一般的拍照应用和成像显微镜。

常规的数字相机通常向用户提供许多不同的白平衡设置是可选的为“预设”。 这些可对应广泛的照明类,如白天(晴天或阴天条件下),钨丝灯,荧光灯,或其他各种照明场景。 很多相机都允许预设值进行微调,以达到图像更精确的色彩平衡。 一些摄像机具有附加功能通过参考一个白色卡片上,墙上,或者如果包括在图像中应表示为白色另一个目的是调整白平衡。 在实践中,摄像机的位置,使白色物体充满视场,以及白平衡调整是由开关设定或在操作菜单(取决于特定的相机)选择启动后,该相机进行适当的传感器的调整渲染目标为白色。

参照定义的白色物体调整收购图像时使用的,并能提供高度精确的色彩平衡校正相同的光照条件下进行的。 该过程必须然而,应当光照变化重复。 高级摄影师往往会选择通过使用比那些匹配的照明,以达到理想的美学效果等白平衡设置来修改自己的形象。 例如,图像可出现比它如果获得了“正确的”白平衡色调较冷或较温暖。 这样的效果,当然,考虑错误,如果准确的现场演绎的用意,类似于钨丝灯照明采用日光平衡片,反之亦然。

色彩平衡,这一般应避免在关键应用的流行的技术,通常是指在消费相机的自动白平衡调整 此方法的目的是要施加到所述图像场作为图像获取和功能通过评估的视图的整体字段均存在相对于色调的光值,以及试图进行平均,或零输出,任何整体颜色偏。 自动平衡技术的缺点是存在于任何视场的颜色值表示一个“平均”分配的色调,这相结合,产生中性灰色或白色。实际上,如果总的像素响应不相似的编程(预期)整体平均,白平衡调整相机发出不会产生准确的色彩再现。

显微镜下观察到的典型标本有很大的不同颜色分布,往往表现出单一的主色调(尤其是在荧光)。 这很可能是一个自动白平衡调整的试样表现出主要是红组织染色将产生比施加到蓝染色的制备相同的过程实质上不同的色彩平衡进行。 既不是可能导致一个准确的样品表示。 试图通过相机电路以平衡检测器的响应输出一个整体的平均颜色值将在不同的样本产生非常不同的结果,特别是如果一个给定的视场具有很强的或主导的色彩。 还有,当然,为产生具有自动白平衡(最有可能的那些的白色或灰色的区域很大比例)可以接受的结果的标本的例子,但该技术缺乏必要使其常规有用的重现性。

在显微镜白平衡调整

在考虑用于优化白平衡讨论了不同的方法,这是明显的,有些技术不适合自己以光学显微镜的约束和要求。 对于特定类型的照明,利用预先设定的值,假定光源的特性是固定的,有颜色的温度和其他光谱质量的标准值。 当钨卤灯被采用,它是在显微镜通常的做法是改变灯电压来控制光的强度或减少热量的产生。 这样产生的照明色温度,这会导致不正确的色彩平衡,如果钨型照明的标准的预设值被用于在数码相机上的变化。 色彩还原变化的另一种原因从发生在彩色输出作为其使用寿命期间灯具时代的变化。

与那些最佳的日光(约5500K)色温区域平衡的光源也存在类似的问题。 不仅是“日光”变量的色温,但很少有人工光源准确地模拟日光的光谱特性。 这些困难可能,在理论上,可以至少部分地通过允许自动电路来校正次要照明波动克服,但是其他的问题往往使这种方法不可取。与像场的自动评估的,局部的试样的变化可以在彩色平衡产生重大误差。 在一般情况下,对于大多数显微镜应用,最好的办法是限制白平衡评价一个精心选择的图像区域或其他合适的物镜。

当数字捕获设备是利用图像的颜色样本在光学显微镜,获得正确的色彩平衡,以提供样品的真实再现通常是首要物镜。 从这个战略意图的偏差通常只取得了纠正与产生不良偏色的样品制备问题。 最科学级数码相机,包括那些专门为显微镜设计,依靠参考调整白平衡,以选定的颜色值。 在透射照明,适当的区域(通常为白色或中性灰色的)被选为从试样字段或单独的照明场中进行调整,以从光路取出的试样。 为了在利用反射光显微镜进行白平衡调整,白色或中性灰色卡(或纸部分)可以被定位于代替试样的显微镜载物台上。 白平衡设置是通过测量从白卡的表面反射的光随后获得。

大多数设计为显微镜通过驻留在主机计算机上的软件控制和数码相机通常被配置为与多个显微镜的功能进行交互。 尼康DXM 1200数码相机系统的软件接口,例如,具有代表性的现有相对于在该白平衡调整的实现方式的商业产品。 当白平衡调整窗口是用户界面中的启动时,选项供由摄像机系统中选择的视场区域的白平衡的评价。 在显示屏上的实时图像,应仔细评估一个合适的白色或中性灰色地带,作为图像传感器的参考点。 如果显示在监视器具有色偏不同于在显微镜的目镜中观察到的色彩平衡的图像,照相机系统必须进行白平衡,以使该试样的准确的图像进行调整。 理想情况下,所显示的偏色将由当正常试样区域被选择为白平衡调整摄像机的彩色平衡电路被删除。

可以被用来设置数码相机白平衡算法标本领域几个典型的例子示于图4。 该标本是成纤维细胞的生活文化影像与微分干涉对比(图4(a)),淀粉颗粒马铃薯组织在四染色薄款在光照下(图4(b)),与人类红细胞相位对比(图4(c))。 每幅图像上,适合在使用区域选择技术白平衡调节的区域中的红色概述,而黄色箭头表示上选择一个像素时,可能会产生满意的白平衡校准图像的特定点。

所选择的作为白平衡参考区域应尽可能大,且无试样渍的着色效果,流鼻血到安装介质。 在许多系统中的白平衡调整软件能够把一个单点(像素)的图像中,或者可以由选取框用鼠标光标指定更大的区域选择。 更好的结果是通过选择尽可能大的区域获得的。 在结果中更广泛的变化可能发生,如果被选择用于调整单个点,因为波动的红色,绿色和蓝色的像素强度局部组合可以向白色的整体视觉效果。 通过选择一个较大的面积,平均获得在传感器阵列中的一个更大数量的像素,以实现可接受的色彩平衡的改进的可能性。 以下参照区域的选择,白平衡调整被启动,并且相机系统利用任一种算法或查找表(LUT)来设置适当的电子值(例如传感器增益为每个分量的颜色)产生一个中性或白色的颜色值。

如前面所讨论的,数字图像的颜色平衡是通过由CCD或CMOS图像传感器收集的波长的光谱的严重影响,无论该传感器是否被容纳在一个照相机,望远镜,激光工作台,或显微镜。 在采用这些固态器件彩色数码相机,一系列的平衡调整,通常是必要的,以便产生符合上述照明光源的颜色温度可接受的彩色影像。 成功地实现正确的色彩平衡若干准则应考虑:

  • CCD图像传感器对红外光敏感的,并且是最可靠的性能对可见光成像只能过滤掉波长较长的红外线来实现。 一些系统可装有红外线阻挡元件在照相机内,但如果这被确定为不是这样的话,适当的过滤应该被添加到排除这些波长在到达图像传感器之前。

  • 对于其中的白平衡调整被检体图像,空白样品载玻片,或反射光的参考(例如,白色表面)上进行任何配置显微镜,显微镜应具有光学系统对准的正确科勒照明和准确地聚焦在样品平面中。 确保这些条件最大程度地减少从色差所造成的视场照度不均匀或颜色异常的问题。

  • 通常,图像传感器的性能是最佳的色温较高的区域,这就要求钨 - 卤素发光器可以在所建议的电压调节范围的上端操作为数字成像。 任何必要的减少照度应始终与中性密度过滤器,而不是通过降低电压来照射灯进行。 同样,适当的色彩平衡是最容易实现与数码相机,如果一般用于摄影的日光平衡彩色胶片的色彩平衡滤波器插入照明光路。 尼康称此滤波器作为南商 (中性色彩平衡),虽然其他厂商有不同的名称具有相同用途的过滤器。

  • 白平衡的中性灰区域中的样本现场调整可能会产生更精确的结果比如果一个非常亮的区域被选为白色参考。 是完全的区域“泛白”,或超出传感器的动态范围,可以由一个或多个组件(RGB)的颜色出现​​白色的图像中作为过饱和度的结果。 获得的色彩平衡电路对这样一个区域进行补偿可能产生不准确或不重复的结果。 灰色区域(具有中性密度)是由红色,绿色和蓝色像素传感器(或单独的RGB彩色图像)约等于信号电平产生。 作为一个结果,基于中性区域精确的色彩平衡更容易实现。

  • 多个变量影响的显微镜获得的图像的色彩平衡,以及它们的相互关系的理解是在实现可接受的结果很重要。 通过成像软件界面进行曝光设定,由图像传感器电路的增益调整进行。 因为白平衡的调整是通过RGB传感器的选择性增益补偿也生效,曝光量应设置为一个近似正确的价值开始白平衡调整之前。 如果曝光时间被改变,或其他更改增益和偏移都需要经过白平衡矫正已定,最好是重复的白色平衡调整步骤,因为所有这些因素彼此互动。 同样地,向显微镜,影响光的属性,如隔膜的调整,更换过滤器,以及切换目标组分的变化,可改变白平衡和要求,以便再次进行校正,以获得最精确的图像。

  • 如果一个特定的应用程序需要作出关键的颜色判断或1样品和另一个选定的一组(其中,标本已按照标准程序制备)内进行比较,它不重复的白平衡调整每个样品是重要的。 在这种情况下,最好的方法是执行对单独的照明初始白平衡校准(在这里的空白显微镜载玻片),然后获得一个样本的图像,使任何必要的曝光调整。 再次替换空白幻灯片的标本后,白平衡日常应反复在照明领域,而不进行任何更改曝光或显微镜配置。 被比较的标本应接着在白平衡,曝光,等等相同的设置进行成像。 如果暴露的变化是必需的,他们应该保持在最低限度,以避免影响色彩平衡。 重述在这种类型的应用(其中彩色再现正在其中试样用于测试或诊断目的比较)的关键概念,白平衡调整应该在单独而不是为每个试样校正的光源来进行。 因此,比较有可能对于每个样本赋予显微镜照明光源的色彩效果。

  • 在调整的数字化采集系统的白平衡光学显微镜目前更多的挑战所采用的某些照明和对比度增强技术。 偏振光,暗场和荧光方法通常存在宽视场其中标本呈现在深度饱和的色彩在深色背景,以白色很少或没有的地方。 有些摄像机系统提供了一种机制来设置暗平衡黑平衡这种类型的成像情况,其中没有合适的白色或中性灰色区域是可用的。 这种方法就建立了传感器响应一个基准确定,并且可以提供满意的色彩平衡。

  • 对于暗背景样本的图像的替代方法是用试样上除去照明场进行白平衡调整。 对于高度饱和的,深色的标本,但是,适当的曝光成像可能需要极其明亮的照明或相对较高的相机增益设置。 这可能会限制白平衡调节的准确性,如果这是在不存在试样上的明亮的照明场进行。 为了让白平衡电路,以评估该照明在类似于与试样现有(和在近似正确的曝光设置)的亮度级,中性密度滤光器可以在白平衡调节被插入到光路中,并且然后与试样实际成像取代。 一些实验是必需的,以便选择近似于试样的传输特性文件的中性密度滤光器。

白平衡操作

情况经常遇到在可接受的白平衡不能图像拍摄过程中按照一般的协议来实现的。 在这些情况下,非标准技术有时可以采用能有效地“欺骗”摄像机的白平衡功能,以产生特定颜色的平衡,这可能会或可能不会被认为是正确的,但达到了预期的效果。 如果连这个策略不能提供可接受的色彩还原,或者如果现有的图像,与差的色彩平衡,采集后图像处理与数字图像编辑软件(如Adobe Photoshop)初始取得可以提供一定程度的修正。

为了应用上述技术,各种滤色器通常用于透射光的配置是有用的。 设计用于彩色照相印滤波器组是适合于此目的。 该套包含一系列在各原色的密度,并且可以被组合以产生任何所需的色调。 为反射光显微镜,适于反射色的引用是必需的非白色平衡。 这是没有必要的目标符合任何颜色标准,和实验通常是必需的,以产生所需的结果。 任何有色反射面可以使用,但最好是有一个可用的宽范围的色调和饱和度的变化。 服务到家中心或油漆店油​​漆色样卡是理想的目的,因为它们是在几乎每一个可以想象的颜色变化提供。 在某些情况下,试样本身的选定区域可以被用来设置断色的白平衡校准。

无论是利用过滤器在反射光透射光或反射物镜(如油漆样卡),操作相机的白平衡功能的概念是相同的:在非白色的白平衡校准会导致相机的电路,以消除物镜颜色,并使其作为一个较为中性的灰色色调。在大多数情况下,只有一个微妙的变化是需要的,并且试验将确定目标的色调和饱和度,将产生整个图像的平衡,使必要的改变。平衡在一个淡蓝色的颜色会导致整体变暖的影响,或转向红色。相反,采用淡红色作为参考会产生偏蓝转向凉爽的色彩平衡。其他颜色校正遵循相同的一般逻辑。在任何给定的颜色进行白平衡将倾向于导致相机的电路,以移位的色彩平衡朝向互补色。需要强调的是,这些非传统的彩色平衡技术对于实现所希望的结果时,通常的方法都失败了(用于与特定的样品制备,光源,或成像装置的原因)的潜在机制是重要的。在这种情况下,它仍然可能通过抵消相机的响应标本调色板获得可接受的图像。

总之,缺乏显微镜照明光源和胶片乳剂或图像传感器校准之间的正常色温的平衡是最常见的原因,在显微摄影和数字成像意想不到的颜色变化。如果光源的颜色温度太低的膜或传感器特性,导致显微照片和数字图像将有一个整体的黄色或偏红,并会出现。另一方面,当光源的颜色温度过高时,产生的图像将具有一个蓝色的演员,并会出现冷却。错配的程度,将决定这些颜色的变化程度,以导致极端的颜色变化很大的差异。相同的效应发生与固态的数码相机系统。由于有问题的,因为这些颜色的变化可能看起来,他们总是容易被正确使用的转换和光均衡器的校正,或用数码相机的白平衡电路的正确校准。