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尼康显微镜,落射荧光照明

2014-01-08  发布者:admin 

 直到最近,荧光照明只有在配备专门的高数值孔径物镜究级复合显微镜可用的选项。 需要对这种技术在立体显微镜已经升级,推出基因编码和特定的生物荧光蛋白如GFP(绿色荧光蛋白)的。

立体显微镜的观察GFP的应用程序现在如此普遍,立体声荧光照明器更经常被称为GFP的照明 ,即使它们可以用于在生命科学和电子制造行业既许多其他应用。 大的标本,如幼虫,线虫,斑马鱼,卵母细胞,和成熟的昆虫可以容易地选择和操纵的时候都标记有绿色荧光蛋白和荧光技术的照明系统。 荧光照明揭示其生物体产生荧光蛋白和立体视觉连接到的观点和充足的工作距离大字段允许观察员进行实验,镊子,吸管,或显微操作。 其他更传统,标本也很容易观察到,用体视显微镜荧光照明记录。

上的方式,类似于那些在更为复杂的复合显微镜采用体视显微镜功能照明的落射荧光。 通常情况下,荧光照明器包括包含在经由中间管连接到显微镜的外部灯箱氙或汞弧灯(或垂直照明 ,参见图1和图2)定位在所述显微镜放大的身体和观测管之间。 这种类型的照明目前仅限于使用共同的主要物镜(CMO)的立体显微镜的应用程序,因为它使用市售的部分,以适应一个格里诺或收敛型体视显微镜荧光照明是不可能的。

由弧光灯产生的光通过一个可调节集光透镜引导至容纳在组合过滤器块中的激发滤光器(如示于图2和图3),它允许具有特定波长范围(或带通)仅光通过。 经过滤的光,然后通过显微镜成像路径的显微镜(放大体和在体视显微镜物镜)的下部和上试样通过一个二色镜,这也是调谐选择性地过滤,反射和/或发射一个特定的偏转设定波长区域。 术语二色性 (或二向色性 )指的是过滤器或反射镜的反射由下面指定的波长的颜色的限制,同时发送上述限制那些波长的两个色彩范围之间进行区分的能力。

聚焦的激发光通过显微镜放大体和物镜,在那里形成照明的倒置锥体该沐浴标本,令人兴奋的任何所存在并具有对应于激发波长的带通范围内的吸收带的荧光通过。 从样品发射的二次荧光发射(通常为更长的波长比激发光)是由立体显微镜的共同的主要物镜捕获并通过变焦机构,以阻挡滤光器直接返回该块的激发波长,并且只允许发射波长的选定区域通过。 显微镜主体管在图1和2被构造成使得回传通过左,右放大的光信道波长更长的荧光发射的光在到达落射荧光照明器之前独立地聚焦。 从左边的信道的光直接穿过的屏障过滤器被定向到的观测管或到相机端口之前。 与此相反,光从右侧通道第一行进回通过二色镜,然后在阻挡滤波器和目镜。 此灯没有一个通路到相机端口,并且只能用于观察标本。

荧光滤光器组合块的结构细节在图2和图3。 每个块包含一个单一的激发滤光器,两个阻挡过滤器和一个二色镜。 由汞弧灯产生的光入射到块通过激发滤光片,由二色镜的表面反射,如上面所讨论和图3所示。 次级荧光发射通过屏障过滤器通过。 激发滤光器,二色镜,和用于左声道的屏障过滤器是粘到的地方,但在阻挡滤波器用于右声道被安装在一个小的帧,可以从块松开一组固定螺钉被删除。 卸下屏障过滤器框架允许访问的二色镜设置在过滤器块的内部。当涂胶更换过滤成块,注意不要铺胶附着在过滤器表面,不要按住过滤器或双色镜没戴手套的手,以避免污染与油腻指纹的表面。

荧光垂直照明可同时容纳三滤块和一个直径过滤器伪字(不含过滤器),使正常的明场观察。 滤波器块被安装在一个滑动齿条,并且可以由被利用来控制齿条位置的杆的装置被插入到光路中。 每个块具有可插入的槽上按顺序以使操作者能够容易地选择用于荧光观察的正确块的照明器外部壳体伴随的标识牌。

目前,尼康提供了一个温和的阵容过滤器的组合,其中列于表1。 这些过滤器涵盖范围广泛的荧光激发和发射条件,并且应该是许多生物学研究中常用的荧光探针有用的。 该过滤器的组合也适合于工业应用,如检查通过荧光照片集成电路晶片的污染的抗蚀剂的聚合物。 荧光探针,激发波长380和510纳米之间的范围可以通过选择合适的激发/发射过滤器组合(见表1)予以确认。 该过滤器的组合也可用于研究使用各种绿色荧光蛋白的突变体,包括青色和蓝色版本相当有用的。

在活具有荧光蛋白标记细胞培养物中,信号强度可以被显著当过滤器组合被审慎相匹配的荧光团的激发和发射轮廓改善。 例如,在DS-红信号,视觉和图像传感器检测的红色荧光的情况下,可以显着地由红色信号转移到更橙色发射的提高。 此外,专为具有叶绿素强烈的自发荧光背景辐射的植物标本过滤器组合常常受益于谨严选择的过滤器规格就相应的信号发射。 显微镜工程师采取许多这些设计标准纳入考虑时,他们优化的波长带通区域的立体过滤器组合。

体视显微镜荧光滤光片组合
滤镜套装 激励 
波长范围
分色镜 发射 
波长范围
Blue GFP/DAPI 379-401nm 420 nm (DCLP) 435-485nm
Cyan (EGFP) GFP 426-446nm 455(DCLP) 460-500nm
Endow GFP Bandpass HQ 450-490 nm Q 495(LP) 500-550nm
Endow GFP Long Pass HQ 450-490 nm Q 495(LP) 500nm(LP)
TRITC(DsRed HQ 530-560 nm Q 570(LP) 590-650nm
Yellow GFP Bandpass HQ 490-510 nm Q 515(LP) 520-550nm
表1

与其它敏感干涉滤光片,所述组合块过滤器将随时间暴露于高强度的光及紫外线的波长恶化。特性,如带通频率和透射数值也将受到影响,如果过滤器被暴露在高湿度的条件。 为了增加这些过滤器的使用寿命,应保存在干燥器中或含干燥剂的密封容器中。 此外,减少时间的光被通过保持照明快门穿过过滤器的金额关闭时的标本没有被直接观测或拍摄用数码或胶片相机系统。 该滤波器只能用从耳朵气球,软camelhair刷,或无油的加压气瓶的干燥空气进行清洁。 永远不要试图擦拭过滤器的表面与镜头纸,以避免造成划伤或擦伤进入软干扰涂层。

各式各样的标本可以在荧光照明成像用立体显微镜,如尼康SMZ1500。 随着0.5倍1.6倍,通过与15倍变焦范围物镜放大倍率,显微镜能够提供4倍的总放大倍率广度540X,采取立体显微镜观察范围成经典复式显微镜的。 放大这个很大的自由度使显微镜图像两个大客厅标本和存在于荧光标记的被安装在显微镜玻片上薄切片微小的细节。 在高倍率范围内的荧光观察的例子示于图4为小鼠肾组织的三重标记的厚部。 将试样用DAPI标记的Alexa Fluor 488的WGA,和Alexa Fluor 568(的的Alexa Fluor探针和样品购自Molecular Probes公司获得),并使用表1中列出了三个过滤器的组合进行成像: 蓝绿色荧光蛋白/ DAPI,赋予GFP的带通 ,和TRITC红色荧光蛋白 。 此图片清楚地说明了荧光立体显微镜的高倍率能力,观察原先的复合显微镜制备标本。

其他体视显微镜制造商提供的荧光激发和观测的替代照明策略。 最流行的配置,如图5所示,包括一个外部途径的荧光激发,不利用显微镜的成像光学系统 从电弧灯箱照明是通过激发滤光片首先通过,然后通过设置在主显微镜主体后部的管引导。 在管的下部装有一个透镜系统,指示激发波长到标本。 此配置可确保光线被直接引导到标本在所有放大倍率变焦位置,提供一个均匀深色背景在所有放大倍率同样强烈的荧光照明。

从标记的样品次级荧光发射是由共同的主要物镜(图5)捕获并通过变焦频道和成一组定位在所述显微镜头屏障过滤器通过。 从那里,光被引导到目镜直接观察或成摄像管用于数字成像或显微摄影。 这种结构的主要优点是由于缺乏对二色性反射镜的需求,以及一个独立的从预先配置的过滤器的组合块,其允许在过滤器选择的研究者稍宽纬度。 但是,配置也可导致无经验的运营商谁试图观察标本不正确的过滤器组合错误。

通过汞弧光灯产生和利用作为在荧光显微镜激发源的强烈的紫外线辐射可能损坏观察者的眼睛的视网膜上。 为了避免这种情况,许多显微镜制造商包括能过滤紫外线沐浴在显微镜载物台标本在显微镜体保护装置。 其他的安全预防措施,包括在观察路径和周围的灯箱杂散光防护紫外线阻隔过滤器。 此外,虚拟运营商过滤器经常插入滑块和设计的荧光干涉滤光片旋转框无人居住的过滤器的位置。

荧光立体显微镜通常配有一个光停止定位在汞灯箱和垂直照明器来阻止来自灯有害的紫外线辐射时,试样不被观察或成像之间的某处。 这个站应该总是被插入到光路中时,观察不被进行。

反射,或热点可以在荧光立体显微镜使用较高的放大倍数复消色差物镜(1.6倍至2.0倍),观察试样时出现在视场的下部。 这神器通常是唯一可见在较低的缩放比率,往往消失时的变焦倍数增加。 在大多数情况下,反射性​​的问题不与较低倍物镜(0.5倍和1.0倍)发生,而不管光学校正因子,并且通常是从低级校正(消色差透镜和平场消色差透镜)的高倍率物镜缺席。

存在范围广泛的用于利用立体显微镜荧光勘测应用中,如在表2中给出。 的受益于该观察模式标本的数量是相当大的,涵盖广泛的学科范围包括从生物领域的工业制造商。

荧光立体显微镜应用
领域 应用
生物学 基因表达,细胞分选,解剖,发育过程,眼睛和肌肉调查
植物学 植物细胞,组织自发荧光,土壤样品和寄生虫
药理 微板流,药物和ELI观察
水文学 水质,细胞结构和滤膜分析
农学 种子观察,基因表达,并Transgenetics
电子 锡膏,环氧树脂分析,监控涂料,聚合物铸件集成电路
半导体 光致抗蚀剂污染,杂质颗粒,过程中的误区
聚合物 杂质颗粒,空洞,珠分析,非聚合的区域
金工 裂缝和表面缺陷,污染,焊接控制,断裂分析
物料 裂纹,焊缝,碳键,骨折,研究方向
造纸 光纤涂料和夹杂物
取证 纺织纤维,体液,指纹,银行票据,伪造
表2

荧光观察的立体显微镜相比,由经典复式显微镜呈现的视图提供的三维观测的独特属性。 此外,更大的工作距离和场由立体技术得到的深度使之视图和更强烈的荧光更宽的全景字段。这些功能都是巨大的利益调查谁正试图处理大量的生物标本和材料的技术人员正在开展前期准备工作,如嵌入,电子检查,或切割。 随着越来越多的明确定义的过滤器组合成为可用于专业应用,在立体显微镜采用荧光应继续攀升。