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徕卡显微镜,CARS和共聚焦

2014-01-06  发布者:admin 

 由于激光共聚焦显微镜的问世,科学家们已经获得了导致生命如何工作有更深的了解了许多新的见解。 单光子和多光子共焦显微术的最重要的缺点是需要来标记样品。 CARS(相干反斯托克斯拉曼光谱法)解决了这个问题,因为它是无毒的,非破坏性的,微创

染色过程有约束:染料漂白随着时间的推移,可以是光毒性,并可能影响后续的研究方法和伪装随后的研究信息。 过程与彩色样品不适合长期分析:大气条件的破坏染料和染料改变时,在与空气或湿气接触 - 任何变化的环境条件会影响试验结果。 另外,染色过程非常耗时。 有些样品不能被污染可言,因为染料的荧光团或存在的连接改变了分子或生物体的功能。

相干反斯托克斯拉曼光谱 - 技术

CARS是一个三阶非线性过程,涉及到一个泵浦光束在可湿性粉剂和斯托克斯束的WS的一个频率的频率。 试样是通过波混频过程的刺激。 反斯托克斯信号πas=2πp-ΠS是相匹配的方向,在频差振动产生相反Δν= VSP-与泵浦光与斯托克斯梁之间。 这等于振动的特定化学键的能量的频率。

能量图的造车工艺(相干反斯托克斯拉曼光谱)。一种泵光子“激发”的分子转换成虚拟状态,从它被强制通过一个斯托克斯光子返回到基态的特定的振动状态。第二PUPM光子激发到第二个虚拟状态,从哪里能被动地返回到基态,并发布了可检测的CARS信号。泵和斯托克斯光束产生高人口的特定振动的状态,这是为化学键的签名。作为泵浦光束是可调的,许多不同的化学特征可用于成像。徕卡TCS SP5与共振扫描仪是用于生命细胞和整体动物CARS成像。
图1:CARS能量图
 
两种颜色的CARS图像记录两个不同的泵频率。示例:霜。绿色环保:水至3150厘米1。红色:脂肪液滴在2850 CM-1。为了避免热运动伪影,共振扫描与徕卡TCS SP5II共聚焦显微镜建议。
2:在霜,覆盖图像脂滴的偏差。 绿色背景显示的水(在3150厘米-1收购),而红点是脂肪成分(在2850厘米-1收购)。

活分子分析与CARS

CARS显微镜的主要应用被发现在生物,制药和皮肤病研究,生物医学成像,食品加工和材料科学。 其潜力已被证明对各种生物医学应用中,如脂质转运的成像,蛋白浓度,DNA,RNA,组织在活的生物体,并且为了在液晶。 通过集成CARS技术融入现代光学扫描显微镜系统中,研究人员拥有最新的技术在手加上一个易于使用的共聚焦系统。

 

高分辨率图像

在拉曼CARS图像移动2849厘米-1这是具体的CH2伸缩振动。样品:小鼠皮肤。仪器:徕卡TCS SP5II汽车。
 3:小鼠耳(最大投影)的皮肤,在2849厘米-1拉曼位移(对应于CH 2的伸缩振动)。 教授Sunney谢,化学系和化学生物学,哈佛大学,剑桥大学,美国的礼貌

传统的扫描仪是用于形态学研究优化在大脑和皮肤,或亚细胞成像功能,如细胞骨架。 它允许每个图像采样高达8,196×8,196像素,结合来看高分辨率大视场。 此外,扫描器的速度可以适应从400赫兹到2800赫兹在双向模式。

在皮肤表面,对应的毛发与色球长的细丝可以看到一个非常强烈的信号,因为毛发覆盖着油。 在皮肤表面,一个明亮的多边形图案轮廓形成的皮肤的最上层时,角质层的角质细胞。 起因于细胞间隙富含脂质,胆固醇,神经酰胺和信号。 在第二层中,周围的毛发根部明亮的结构被检测到,皮脂腺。 他们是挤满了包含甘油三酯和蜡酯皮脂水库多细胞车厢。 在70-80微米表面的细胞,脂肪细胞,含有丰富的脂肪,被发现在真皮层。 因为CARS信号只在焦点处产生的三维成像能力被示为具有最大的突起。

 

CARS在视频速率

共振扫描器提供了紧凑的设计和快速的画面记录的好处。 当基于点照明和点观测的真实共聚焦的概念,共振扫描器允许在双向模式16,000赫兹频率的速度。 在512×512像素的帧大小时,系统获得每秒29图象。 以较低的采样,速度可以提高到512×32个像素的分辨率,以每秒290帧。 高时间分辨率的动态过程进行成像和测量或线扫描可以采取全速率。

施加平均提高了信号的信噪比,这在谐振扫描仪的情况下特别有用。 它有可能找到的图像质量和采集速度之间的正确折衷,根据成像要求。 在专业设计的共焦共振扫描器的幅度是可调的,这使得它可以通过施加较小的振幅进行放大。 有了这个功能,可以集中到感兴趣的区域,而在收购视频率图像。 泛函数 - 另一个有用的设备迅速转移到有趣的地方,这不一定是在微观领域的中心 - 也应该是可与共振扫描仪。

随后CARS显微镜开辟了新的途径,以可视化的基础上固有振动特性的结构不染色或标记的标本。 试样不从扰动由染料或光致漂白受损。 CARS打开了新的研究方法,尤其是在细胞生物学,神经科学,药理学,皮肤科,以及医疗成像。 
 

Subcutanous脂肪层小鼠皮肤,成像与徕卡TCS SP5汽车。左:共振扫描,每秒30帧,相当于每个像素120ns的仍然提供了结构的一个很好的例证。在右边的比较:与30的平均值,它对应于每秒1帧拍摄图像。
4:这些CARS图片显示小鼠皮肤的皮下脂肪层的富含脂质的脂肪细胞。 左边的图像是采取共振扫描仪的全速,采集图像以29张/秒的双向模式的速度,即在视频速率。 在120纳秒像素的停留时间只有几辆车光子被检测到,从而在嘈杂的形象。 右边的图像对应于平均与谐振扫描器接管30的图像,即,对应于非谐振扫描仪的图像质量。 教授Sunney谢,化学系和化学生物学,哈佛大学,剑桥大学,美国的礼貌
 

使CARS显微镜访问

化学系的Andr​​eas Zumbusch教授,德国Konstanz大学领导的一个研究小组对物理化学。 他专注于单分子荧光光谱和显微技术,以及对非线性光学显微镜的开发与应用:“许多研究领域,无论是从生命科学和材料科学的背景下,需要快速,非侵入性的成像具有高空间高分辨率,高分子特异性和灵敏度高。正如它的对比度是内在的样品光谱特性的基础上产生的一种光学方法,CARS显微镜可以提供这一切。在神经科学,例如,CARS显微镜可以产生影响比得上双光子显微镜,不同之处在于它不依赖于引入的荧光标记物。

商业CARS显微镜系统的出现无疑是朝着使该技术访问感兴趣的研究人员在其应用程序中的重要一步。 有吸引力的系统概念提供离手操作,同时允许被使用的CARS显微镜的全部潜力“。

皮脂腺,脂肪成分通过激励CH 2键结轿车的形象。图像与徕卡TCS SP5 CARS拍摄。
 5:一只老鼠耳未染色的皮肤。 Sebacouce腺体多细胞车厢,其中包含甘油三酯和蜡酯。 由于它们的CH 2键结,脂肪成分可以完美成像和CARS及导致锐利,清晰的成像效果。 教授Sunney谢,化学系和化学生物学,哈佛大学,剑桥大学,美国的礼貌 
两个参数成像在小鼠尾部。颜色编码绿色的F-SHG(向前二次谐波产生,一个MP-技术)和红色的外延车(后向散射相干反斯托克斯拉曼光谱)。 F-SHG揭示的结构特性,特别是从胶原蛋白。 EPI-CARS表明脂质分布。图像与徕卡TCS SP5 CARS收集。
6:小鼠尾巴成像labelfree与外延车的横截面(反射光,红色区域)和F-SHG(透射光,绿色区域)相结合的大约脂质和试样的结构性质的信息。