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徕卡显微镜,相干反斯托克斯拉曼散射显微与细腻样品成像

2014-01-02  发布者:admin 

 荧光显微镜假定在细胞生物学中的关键作用,一旦有可能通过荧光染料选择性地染色的细胞成分。一个有针对性的染色,保罗·埃尔利希的第一个探险家,有想法的东西,专门污渍也应该杀了明确 - 这是与术语“灵丹妙药”,化疗的基本思想有关。他的研究小组发现洒尔佛散,抗梅毒药物量身定做 - 虽然不够具体,没有造成重大的副作用。筛选许多荧光染料导致染色这是在组织学使用,包括像染料DAPI或苏木精伊红一长串。

在具体的染色革命发起的引入抗体介导的免疫组化染色和DNA杂交为基础的染色。这允许一个单一的蛋白质或DNA序列被庞大而无法与经典的化学染料分化的化学性质相似的分子背景高亮显示。在这方面,最近的重要进展已取得的荧光蛋白。这些被引入到染色的结构,分子与细胞或在传感器为代谢物,离子和其它物种中的活细胞和有机体,以提供用于观察生命的机械的一个窗口被用于 - 在实时模式。然而,所有这些染色程序涉及更多或更少侵入性的干预措施,并要求在许多情况下死亡或固定的准备工作。此外,该荧光蛋白的方法取决于外源蛋白在靶细胞中表达,通常显著与在细胞中的灵敏调节稳态干扰。因此,方法进行了探索,使笨重的样品的成像没有任何污染。

图1:左:本土化研究和档次脂质在不同类型的巨噬细胞积聚的:脂类绿色,63×物镜显示为红色,肌动蛋白。来自:Alba Alfonso Garcia and Jeff Suhalim 美国加州大学Potma实验室。细胞:阿德尔海德求Kratzer博士,医学系肺科和临界指数的护理,科罗拉多大学。右:两个录音从三明治酱叠加图像:脂质显示为红色,水绿色,25倍的目标,比例尺为25μm。

 
图2:散射过程。Y:瑞利散射。S:斯托克斯散射。答:反斯托克斯散射。(G:基态与振动子状态,E:激发态与子状态,V:虚拟状态)。

瑞利和拉曼散射

光能够与物质不仅通过吸收光子接着分子假设较高激发态相互作用,而且还通过假设所谓的“虚态”。在这种情况下,光子不具有能量量子能适合任何给定的分子中的状态的差异。出于这个原因,所释放的光子不斯托克斯位移,因为没有热子状态系列中的虚拟状态,可能导致排放转移到红(荧光,激发态先迅速放松到的最低振动子状态兴奋状态,释放热能而离开发射的光子具有较少的能量 - 偏红色调)。在正常条件下散射,入射和散射光子,因此具有相同的能量,这是相同的颜色,并且不能从相互作用的分子,携带任何特定信息。此标准的情况下被称为“瑞利散射”(图2:Y)。

然而,有一种可能性,发射不覆盖整个跨度到该分子的最低振动状态,但是,例如,能量只返回到第一热状态。在这种情况下,所发射的光子不仅缺乏的是热态的能量差到基态。发射红移。这种现象被称为拉曼散射(这里,斯托克斯散射,参见下面的替代方案,图2:S)。因为这些子状态的能量差是非常特异的分子结构,事件和释放的光子之间的能量差表明,在与光相互作用的化合物的详情。因此,拉曼光谱已成为分析化学一个非常有用的工具。另外,该分子可能只是碰巧居住在振动状态(这在一定程度上会发生,即使在环境温度)。在此情况下,在照明的虚拟状态是更高相比上面所讨论的例子。作为发射后的分子通常会假定为最低能量,散射光子具有更高的能量大于入射光子。这被称为反斯托克斯散射(图2:A)。这两个过程很少发生;斯托克斯过程约10 -3 -10 -4小于瑞利过程倍,且反斯托克斯过程甚至一个或两个数量级低于。对于成像,自发拉曼散射的效率是迄今为止太低,以产生合理的时间内足够的信号。

 
图3:一个反斯托克斯拉曼信号,以产生足够的信号用于化学成像的扩增。详细信息请参见正文。

反斯托克斯拉曼信号的放大

为了产生拉曼光子的强度的有用的,这是必要的,人为地增加的第一振动状态的人口。当达到这一目的,许多光子会散发在反斯托克斯波长,产生可测量的信号。

为了实现这一目标,强烈红外光束(泵浦光束)最初通过使用标准脉冲高功率红外激光聚焦到样品上。这束将促进许多虚拟状态中分子的集合体。为了避免他们的回归到零振动能级,第二束照射(探测光),刺激从虚拟状态的回归,就像一个STED光束返回激发态到基态。如果第二光束被调谐到与第一振动状态(表示该能量必须泵浦光束和振动能量的差)完全匹配,则该分子将不承担零电平处于基态。因此,许多分子中的焦点已经晋升到振动状态。第二激光器是可调谐红外激光,和现代系统使用的复合设备,提供同轴两种波长。

这两个过程或多或少同时发生。两种波长需要照射样本。因此,当泵浦光束仍是上,所述分子可以假设较高的虚拟状态下,从第一振动基态开始关闭。他们将在这个虚拟的状态放松到基态的零子状态,从而发射出光子能量高于泵束的高。所不同的是第一热状态完全相同的能量。所有我们需要做的就是收集这些散射光,并从泵和探测光束分开。这是没有必要的,以适应发射带通滤波器的反斯托克斯波长,作为特定信号是由填充了大量的热状态是特定于所讨论的化合物(图3)的制备。的特定信号是泵和探针,其具有被调谐来选择所需的化合物之间的差异。

 

事情,我们现在可以看到

作为热能源关联非常特别具有化学键,能够进行本地化的样品在不同的键类型。对比度是根据特定热激发和信号将规模与化合物的浓度。CH-CH键高度集中于脂质双层和其它非极性结构。因此,它可以对图像的极性(主要是水)的背景脂质区 - 无任何荧光染色程序。这已被证明是与许多类型的样品很成功。整个生物体,像果蝇胚胎,成虫和组织样本,细胞,甚至活酵母细胞变得可见,没有任何染色过程。在具有快速扫描系统,例如,在Lei​​ca TCS SP8车的共振扫描器结合,在细胞内的秘密可以在生理条件下进行监控。食物样本可以检查组件的脂水分配和庞大的应用范围是开辟了聚合物的研究和产业。



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