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尼康显微镜,物镜的分辨率

2014-01-01  发布者:admin 

 光学显微镜分辨率被定义为上仍然可以由观察者或摄像机系统作为单独的实体来区分一个标本两点之间的最短距离。 这一重要的概念,例如,列于下面的图(图1),在那里光从样本的点源在显微镜中间像平面显示为艾里衍射图案。

显微镜物镜的分辨率极限是指其在衍射图(图中的说明)2紧密间隔的艾里磁盘之间进行区分的能力。 中间像平面附近的衍射图形的三维表示被称为点扩散函数 ,并且示于图1的下部。 检体图像是由一系列形成艾里图案和说明了两个二维和三维的紧密间隔的点光源来表示。

分辨率在光学显微镜有点主观的价值,因为在高放大倍率,图像可能会出现不清晰,但还是可以解决的物镜的最大能力。 数值孔径确定一个物镜的分辨能力,但整个显微镜的光学系的总分辨率也取决于聚光镜的数值孔径时。 较高的总系统的数值孔径时,分辨率越高。

显微镜光学系统的正确定位是非常重要的也是为了确保最大的分辨率。 台下聚光必须匹配的物镜相对于数值孔径和调整光圈光阑精确光锥的形成和标本的照明。 用于图像的标本的光的波长光谱也是通过显微镜得到的分辨率的程度的决定因素。 较短的波长是能够解决的细节在更大程度比是较长波长的光。 有已衍生来表达的数值孔径,波长和分辨率之间的关系数的公式

分辨率(R)=  /(2NA) (1)
分辨率(R)= 0.61  /NA (2)
分辨率(R)= 1.22  /(NA(OBJ)+ NA(COND)) (3)

其中,r是分辨率(两个对象之间的最小可分辨间距),NA是一个通用术语,在显微镜的数值孔径,λ是成像波长,NA(OBJ)等于物镜的数值孔径,和NA(COND)的聚光镜的数值光圈。 注意,等式(1)(2)由乘法系数,这是0.5为公式(1)和0.61为差异方程(2)。这些方程是基于多种因素(包括各种光学物理学家的理论计算的)来核算的物镜和聚光镜的行为,并且不应被认为是任何一个一般物理定律的绝对值。 在某些情况下,如共焦和荧光显微镜,分辨率实际上可能超过置于由这三个方程中任一项的限制。 其它因素,如低样品的对比度和亮度不理想可以用于较低分辨率,并且更经常的情况是,R(大约0.25 微米的使用550纳米的中间光谱的波长),以及数值孔径的真实世界的最大值1.35到1.40未在实践中实现。 下表(表1)提供了一个列表的分辨率(r)和数值孔径(NA)的值由物镜放大倍率和修正。

分辨率与数值孔径由物镜修正
  物镜类型
  平场消色差 平场萤石 平场复消色差透镜
放大 NA 分辨率 
(μm)
NA 分辨率 
(μm)
NA 分辨率
(μm)
4X 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375
10X 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61
20X 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37
40X 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29
60X 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29
100X 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20
NA =数值孔径
表1

当在显微镜是在完美对准,并与台下聚光适当匹配的物镜,那么我们可以替换为物镜的数值孔径为等式(1)(2),与添加的结果是等式(3)简化为公式(2)。 要注意的一个重要的事实是,倍率没有出现在任何这些方程的一个因素,因为只有数值孔径和照明光的波长确定试样的分辨率。

正如我们所提到的(与所用的方程可以看出)的光的波长是在显微镜的分辨率的重要因素。较短波长产生较高的分辨率(对r值越低),反之亦然。 在光学显微镜的最大分辨率是实现了近紫外光,最短的有效成像波长。 近紫外光之后是蓝色,然后绿色,最后红光在解决标本细节的能力。 在大多数情况下,显微镜使用所产生的白光通过一个卤钨灯泡照亮标本。 可见光光谱集中在大约550纳米,绿色光的主波长(我们的眼睛是最敏感的绿光)。 它是这样的波长,是用来计算表1中的分辨率值。 数值孔径值也是在这些方程中重要和更高的数值孔径也将产生更高的分辨率。 光对分辨率的波长,在一个固定的数值孔径(0.95)的效果,被列在表2中,以生产降低程度的分辨率的较长的波长。

分辨率与波长
波长 
(nm)
分辨率
(微米)
360 0.19
400 0.21
450 .24
500 0.26
550 0.29
600 0.32
650 0.34
700 0.37
表2

显微镜的分辨能力的光学系统的最重要的特征,并影响一个特定试样的细节来区分的能力。如上所讨论的,在确定的分​​辨率的主要因素是物镜的数值孔径,但分辨率也取决于样品的种类,照明的相干性,像差校正的程度,以及其他因素如任一中的光学系统的对比度增强的方法显微镜或在试样本身。 在最后的分析中,分辨率是直接关系到显微镜的放大倍数有用和标本细节的感知限度。