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徕卡显微镜,干式超薄切片与上高凝压力

2013-12-30  发布者:admin 

 

骨矿化的细胞培养模型:UMR106-01细胞更快地做到这一点,在时间上同步,并产生更多的矿物

我们已经使用培养UMR106-01成骨细胞,调查骨矿化的过程。 UMR106-01细胞以及初级颅盖骨细胞球形聚集胞外超分子蛋白质 - 类脂复合体,称为生物矿化灶(BMF),其中的羟基磷灰石矿物​​所述第一晶体沉积(Midura等,2004;。Wang等, 2004)。 这些文化模式之间的主要区别是与矿化发生时,从12-16天电镀初级成骨细胞88 h代表UMR106-01细胞后不等的速度。

如果矿化是阻止磷源或通过添加丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF遗漏,BMF复合物形成,但没有发生矿化。 有趣的是,超结构的研究表明,对矿化BMF事先含有大量膜囊泡有限大小不等,从50纳米到2微米的直径。 然而,第一矿物晶体未检测到UMR106-01细胞铺板后78小时和球形站点推定为小泡内被本地化。

具体地,共焦拉曼光谱的分析显示内BMF矿化是在一个培养瓶(Wang等,2009)中的所有的BMF同时发生一个渐进的,多步骤的过程。 重要的是,几种蛋白质谱的变化是检测每个BMF内前低结晶羟基磷灰石的沉积和矿化时被拦截,这些变化并没有出现。 因此,在BMF矿化是一个时间上的同步过程。 然而,了解矿化的生化机制需要的钙,磷离子处理前之BMF晶核的详细升值。

钙,磷以及目前的水溶解度的方法排除在生物矿化初始水泡事件的超微结构分析?

以前的工作已提出,软骨和/或骨矿化利用一个单一囊泡群体富集钙和磷,或,2囊泡种群分别富含钙或磷(图1)(安德森,1967;博努奇,1967;阿瑟诺和Ottensmeyer,1984)。 为了弄清这个问题,这些离子的溶解性就必须使用其他方法如高压冷冻和冷冻置换,以避免损失标本固定期间,嵌入和切片。 因为大多数现有的研究还没有一致的检体处理过程中避免水,伪非水性处理的成骨细胞介导的​​矿化过程的真实影响是难以评估。

本研究的目的是使用同步UMR106-01培养模型,以紧接音响RST羟基磷灰石晶体的成核设计和验证一个伪非水处理方法,图像内的BMF钙,磷离子的分布在其中(图1) 。 我们认为此方法也应适用于在其他细胞如肌肉钙离子的分布随时间变化的调查。

图。 1:外矿的单,双泡模型。 上游面板,单基质小泡模型。 钙,磷离子通过的Ca +2-ATPase的抽,  ,磷共转运和磷酸酶作用于磷脂建议的行动逐步集中基质小泡的单一种群内。 一旦钙2和磷酸根离子到达一个阈值浓度(黄色),初始矿物晶体的成核发生导致囊泡和结晶,可以在周围的细胞外胶原基质内传播额外晶体释放的破损。 较低的面板,双泡模型。 钙,磷正逐步集中囊泡的生化显示不同的功能分布,包括离子泵ATP酶和Na+-磷酸共转运活动,分别为两个不同的种群内。 随后,这些钙,磷富集囊泡种群融合和核矿物晶体导致囊泡和结晶,可以在周围的细胞外胶原基质内传播额外晶体释放的破损。

 

钙,磷是由高压冷冻,冷冻或取代传统的固定样本丢失

使用高压冷冻和冷冻置换不足以留住不稳定钙磷矿化成骨细胞培养物中

钙,磷可以从样品要么在高压冷冻和冷冻置换或传统固定过程中丢失。 评估我们的伪非水方法的有效性,我们选择了停止的文化在76小时,12小时添加β-磷酸甘油矿化刺激后,但在此之前2小时矿物内BMF(Midura第一晶体的外观等,2004; Wang等,2009)。 某些文化中,随机选择用于常规固定(图2)进行处理而另一些则通过高压冷冻机(Leica EM PACT)处理,冷冻干燥,取代(图3)。 这些成对的文化比较支持几个结论。 大面积的含有常规的固定后稍微均匀的颗粒有机基质中。 这些区域似乎从它们的体积排除膜囊泡有限。 与此相反,高压冷冻培养物含有大量的几乎“白”胞外区,大约0.5-1微米的直径,内BMF(箭头,图3)。

在较高功率的观点,这是显而易见的,尽管低对比度这些“白”的区域不具有一个基本的细节表示一个范围不规则形状的球状体在约50至800纳米的直径(未示出)。 然而,这些“白色”区域的存在提出了关于无机或有机物质的损失迫切关注。 特别是,当与从成对的,以往固定培养物(图2)相似的BMF区域相比,我们推测,“白”点表示它被优先地由高压冷冻保留,但其中在进一步处理,其后丢失材料。

 

图。 2:BMF的常规化学固定和湿切片后矿化成骨细胞培养外观。 UMR106-01细胞中的β-甘油磷酸的存在下培养12小时。 箭头限定的胞外BMF的富集稍微均匀的颗粒有机基质的轮廓。 

图。 3:高压冷冻,冷冻干燥,取代的成骨细胞培养物含有的BMF具有半透明的斑点(箭头所示),这些不良的对比细胞外基质的区域。 当与进行干燥切片类似的样品相比,透光性斑点出现黑(参见图4)。
 

钙,磷潴留在干燥的切片高压冻结,冻结取代的培养提高

并排侧比较显示干切片与高压冷冻和冷冻置换组合须于成骨矿化文化观察富含钙外囊泡人口和磷

值得注意的是,随后的电子光谱的钙,磷成像是不可能在任一常规固定,也不该被切开的水无论标本是否后染色或不冻结取代的样品(结果未显示)。 因此,我们取代干切片用于高压冻结,冻结取代文化湿切片。 钙,磷潴留在干燥的切片高压冻结,冻结取代的培养提高。 很显然,干切片的取代导致生物矿化灶内的显着增加在保持钙和磷[比较图3(湿切片)和4(干切片)。

从而出现如图3的“白”点后,湿切片焦点0.5-1微米直径的区域,现在的零能量损失图像变暗(图4A)。 这UMR106-01文化矿化可重复的,时间上同步的方式其实有利于这些直接比较不同文化之间(Wang等,2009)。此外,电子光谱成像表明,暗区出现富含钙,磷(比较图4A,B和C)。 最后,如​​图所示,在图4D中,钙(红色)和磷(绿)信号的叠加图像在很大程度上相互重叠的76 II培养物如由黄色的存在。 因为其他的研究表明,76 II UMR106-01文化不包含检测矿物晶体(霍夫曼等人,2007; Wang等,2009),钙,磷在这里观察到的丰富内容可以代表无定形磷酸钙(Driessens等人,1978)和/或磷的活性有机形式,例如多磷酸盐(Omelon等人,2009)。 
 

4:伪非水性处理后,矿化BMF富集钙和磷。 细胞在相同生长到那些在图2和图3。 答:零能量损失的形象描绘黑暗的出现囊泡。 B:电子光谱钙信号的成像。 C:电子光谱磷成像。 D:在A-C的意见叠加图像。
 

重要的是,对钙,磷的矿化富集观察重点内容的功能作用是通过非矿化控制文化分析的支持。 当类似的高压冷冻,冷冻置换,并干燥切片方法被应用到非矿化UMR106-01培养,很少暗(钙和/或磷富集)囊泡或颗粒进行检测(未示出)。 最后,一​​个附加的优点为使用的摆动刀是它切片过程中降低压缩和减压的所得部分起皱。

总结

总之,我们的结果表明,高压冷冻和伪非水性处理是必需的,以检测早期钙,磷富集矿化成骨细胞培养物的细胞外位点。 使用干切片的证明是钙,磷的保存的关键一步。 此外,电子光谱成像表明胞外生物矿化灶内深染的囊泡之前的结晶矿物的检测(Wang等,2009)富含钙和磷。 现在,我们计划使用这种方法来确定是否成骨细胞在体外和体内利用单或双泡成矿机理(戈尔斯基科等,2004;。Midura等,2009)。