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尼康显微镜,荧光共聚焦显微镜的关键方面

2013-12-03  发布者:admin 

 我们都知道,荧光显微照片揭示了在组织中的分子标记的位置,对不对?好吧,也许不是。 事实上,你可以很确定,在荧光模式大多数激光扫描共聚焦显微镜测量的是在某一特定时间所收集的光子数的某些功能。 我们希望这是一个或两个有趣的参数的精确测量 - 局​​部分析物的浓度或局部离子浓度。 事实上,许多因素会影响实际存储在计算机存储器中在任何给定时刻的数值。

3D成像与共聚焦显微镜

一个通用的激光扫描共聚焦显微镜示出了一些在本文中提及的“39”特征的位置的流程图示于图1。 示的系统是基于配置为活细胞成像的倒置光学显微镜 在下面的文本称为单个组件被标记为与至(g)的字母(a)所示。 该图示包括三个光学部分,在不同的高度,通过抗体标记的果蝇胚胎采取沿z轴,并指定Z1,Z2Z3。

多年来,学生参加活​​细胞的三维显微各月期间举行,英属哥伦比亚大学,编译这些外在因素的清单。 在第一年中,列表增加至39项,所以我们借用了希区柯克电影的名字为我们的名单。此后,名单继续成长! (在球场上的更多信息可以在网络上在被发现的3-D显微镜课程公告板 )。

虽然这篇文章不能完全描述每个学期,短暂的和有用的解释也包括在内。 该条款出现在粗体字和粗体字等许多方面交互。 请注意,许多这些变量通常是在其对空间分辨率的影响来考虑的。 他们在这里列出来,因为降低的分辨率转换成“把精彩的光子数相同到一个更大点”。 这降低了激发强度 - 通过给定的分子中产生的光子的数目 - 和这些检测到的级分。 人们常常忘记,在荧光共聚焦显微镜正常信号电平对应于只有10-20光子/像素的亮区域。 在这种情况下,统计噪声是空间分辨率比由阿贝式定义的更重要的局限:

dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)

在公式中,D(分)表示在一个周期光栅,可以只是被解析的最小间距,并且被表示为在试样空间横向距离,λ(0)为光的波长在真空;和NA(obj)NA(cond)是的物镜和聚光透镜的数值孔径,分别。 该方程确定了物镜和聚光镜的数值孔径在确定图像分辨率为光的给定波长的作用。

激光单元 (图1(a))是照明光源,并且在一般情况下,测得的荧光是成正比的激光功率电平。 虽然总的激光输出功率通常调节,功率是在多行激光的每一行的值可能无法,也可以广泛地随时间变化。 波长影响光学性能,而且通过该染料的吸收光谱,它决定了荧光的产生量。

功率输出不稳定通常是噪音,它的不稳定性通常小于1%,但随着年龄的激光可以变得越来越不稳定。 因为灰尘,未对准,或机械不稳定性可导致10-30%的随机变化, 光学耦合到所述连接光纤(如果使用的话)是至关重要的效率 。

激光反射镜对准和反射特性可以是长期漂移在源代码中的激光输出。 由于激光的光源是由激 ​​光反射镜来确定, 波束指向误差和/对齐是很重要的。 不稳定这里将显示为亮度变化,因为变化的视在源的位置将改变耦合激光光线进入单模光纤中大多数仪器中使用的光学器件的效率。

物镜 (图1(b))的数值孔径的影响通过可收集样品发出的光的分数。 这也适用于光从激光。

物镜放大倍率是负相关的物镜入射光瞳的直径。 该目标将只有正常工作,如果整个入瞳充满了令人兴奋的激光。 填充不足会降低空间分辨率和强度的峰值。 载入过多会引起一些激光罢工客观的金属安装和丢失,也减少了光斑的强度。

清洁度是很重要的,并且脏光学产生更大和调光斑点。 传输 (光入射,可以聚焦到一个点上它的另一侧的物镜的分数)随波长而变化。 提防使用一些较新的,多层光学在红外范围内的。 色差和球面像差都使光斑变大,并且随波长。 此外,球面像差与盖玻片的厚度和浸渍并包埋介质的折射率变化很大。

衍射是不可避免的限制的光学分辨率。 它有效地放大物体比衍射极限较小的图像,使它们显得暗淡比他们应该的。

扫描系统 (图1(c)),尤其是缩放倍率的控制,决定了一个象素中的试样的尺寸。 对于Nyquist采样,像素应该比你希望看到在你的样品的最小功能小至少两次。 假设200纳米的瑞利准则的分辨率,像素应该是小于100纳米。 较大的生产欠,减少小功能所记录的亮度。

漂白率的影响正比于变焦倍率的平方。 扫描速度 ,较长的停留时间在一个特定的像素,所述多个信号将被检测到,并在减它将由泊松噪声失真。 在高扫描速度下(小于100毫微秒/像素),从染料的荧光衰减常数的长度超过这一停留时间信号可以被减少。

光栅尺寸 -连同变焦倍率,沿着栅格的边缘像素的数目将确定的像素尺寸。 更多的像素(1024×1024与512×512),使欠采样的可能性较小,但意味着一个人必须要么花费更少的时间在每个像素通过减少收集光子的数量,增加泊松噪声,或需要更多的时间来扫描大图和可能导致更多的漂白。 光学或扫描镜可以引入几何失真 ,可能导致物体的形状和所述图像之间的不一致。 环境是很重要的:振动和杂散电磁场可以通过多种设备引起的,例如,冷却风扇。这可能会导致产生扭曲,可能会随时间变化不正当镜偏转。

其他光学元件包括传输 ,它描述不存在于光学元件,特别是中性密度或带通滤波器,分束器和目标的吸收和反射损失的量度。 思考从空气/玻璃界面通常表示丢失的信号,但可能会出现亮点无关样本结构。 镜面反射率可以是波长的强功能的红外线和紫外线,并降低暴露在潮湿和灰尘。

盖玻片的厚度是最昂贵的光学组件和最有可能被不小心选择。 它应该是170±5微米的厚度。作为浸油 ,其折射率必须完全匹配所用的物镜。 这可能只发生在一个小的温度范围内,以及可选地,它可以是自定义的混合。 聚焦平面上的位置是重要的,因为略高于或焦点的平面之下的特征会出现比在焦点平面的特征的调光器。 当收集的三维数据,奈奎斯特采样,还必须实行的z轴的平面的间隔。 最后, 该阶段的机械漂移可导致实际成像随时间变化的对象的平面。

感兴趣的染料的浓度可能是你正在试图测量。 渗透入试样往往是离子强度和pH值的函数(或从空间排阻)是什么。 吸收截面是令人兴奋的光子通量,这将通过染料分子被吸收的分数的测量。 它是由共轭探头,pH值,特定离子的浓度和离子强度的方法的影响。

量子效率描述了机会,能量从一个激动人心的光子吸收将被重新辐射的荧光光子。 它是波长的强函数,并且还受pH值,特定的离子浓度,离子强度和染料-蛋白质相互作用。当激光功率大于1毫瓦使用具有高数值孔径的物镜时单线态饱和 。 然后,光的强度足以将大部分接近交叉的染料分子进入激发状态,从而减少了有效的染料的量子效率。

装载是指染料的你把你的细胞数量。 重要的变量包括染料分子/抗体的数量,或者其它蛋白质标记,并用于固定/透化协议。 猝灭是由附近的其他人从1染料分子发出的荧光的吸收。 卸载是指染料,这是在细胞内,但是现已泵出或以其它方式失活。

底物反应的税率适用于染料与那些与他们的互动与细胞离子或其他分子的荧光性质。 像素的驻留是微秒数量级上,因此有可能没有足够的时间以达到平衡。 预漂白是指染料的脱色本测定之前进行即可。

条块是染料的细胞内过程的重新分配。 染料/染料的相互作用不仅指刚才提到的淬火,而且还对荧光共振能量转移(FRET)。 发生这种情况时,一种染料的发射光谱与第二染料分子的吸收光谱重叠,几纳米的路程。FRET可导致光的仅在第二染料的发射波长的发射。 如果第二分子不是荧光的,如通常发生的,荧光丢失或淬灭。 染料对试样的影响,可能会影响许多环境变量,包括样品的生存力的降低。

试样 (图1(d))和它的嵌入介质的折射率,将决定的球面像差存在的严重程度。 即使是观看使用水目标水生物标本,对手是不可能做到完美,甚至接近。 这种类型的球面像差是随着穿透深度的信号损失的主要原因。

它必须使用的浸油具有正确的折射率和色散(与波长的折射率的变化)。 同时,要确保没有气泡,将作为在沉浸介质中间的镜头。 检查通过集中上下同用于调整你相环的勃氏镜。

试样的重要状态可以影响的实验的结果,因为,例如,将死的细胞具有不同的形状,大小和离子的环境中不是活的。 自发荧光是指内源性荧光化合物的存在。 这些分子的效率可与pH值,离子浓度和代谢状态而有所不同。 额外的自发荧光可以通过固定不当使用戊二醛特别是当生产。

目标和重点的平面之间折光结构或细胞器,例如,脂质球形球,可能会重新聚焦光束到一个完全未知的位置。 更小的特征可以具有较小的影响,但该光散射出来的光束的任何折射的功能将降低检测信号的激发点,因而强度。 它们的累积效应也加起来具有折射率比水高得多的细胞。

存在或不存在高度染色的结构的上方或下方的聚焦平面指的是z轴分辨率是有限的。 大型结构还可以吸收大量的令人兴奋的光,如果高度染色。

穿过针孔 (图1(e)),该信号正比于针孔的直径的平方(或它的大小 ),它通常被设置为等于艾里斑处的平面内的直径针孔。 对齐是很重要的,并且被聚焦到试样,然后通过光学系统重新聚焦回到激光器的图像应该与针孔的中心重合。

检测器 (图1(F))通常为光电倍增管(PMT)。 检测到的信号是成正比的量子效率 。在大多数共聚焦仪器中使用的光电倍增管的有效​​量子效率从约15%下降到在蓝端在光谱的红色端约4%。 至于响应时间 :大多数的荧光信号,能够迅速被放大,但探测器他人,如跨膜电流,响应速度很慢,使得慢扫描速度必要的。

光电倍增管电压决定了光电倍增管的放大。 50伏的增加对应于约2更在增益因子。 要注意的是光电倍增管的黑电平或(亮度)控制允许任意数量的加法或减法从提出到数字化的信号。 黑电平应该被设置成使得在图像的最暗部分的信号电平是5-10的数字单元。

噪声的许多可能的来源,都将扭曲的入账价值。 通常情况下,光电倍增管产生的暗电流噪声相比,信号电平是很小的。 然而,这是被允许变热或查看很差染色标本时红敏光电倍增管不假。 除了从任何杂散光,可能无意中到达光电倍增管,主要剩余噪声源是泊松或统计噪声。 这等于记录在一个给定像素的光子数的平方根。 其结果是它变得更大以较高信号电平,即使信号与噪声的比率提高。

数字化 ,通常使用的计算机(图1(克))应该是线性的。 提交的“8位”显微镜的数字化装置的电子信号必须是大小介于1和255之间要被记录的。 由于统计噪声,介于10和220的值是更安全的。 数字转换系数是指检测并存储该数的光子数之间的比率。 这依赖于光电倍增管的电压和其它电子增益,但通常为约30,用于记录在8位仪器正常标本。

记住,要衡量这些因素精确,必须持有其他38不变。 祝你好运!