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徕卡显微镜,超高分辨率显微镜和三维测量

2013-11-22  发布者:admin 

 光学成像装置有一个有限的深度字段和衍射限制的分辨率。 首先处理场问题的深度与激光共聚焦显微镜衍射无限的分辨率已经可用了几年,现在用超分辨率显微镜。 现已超分辨率显微镜领域的问题与解决深度。本地化超分辨率使用散光基Z-编码。 STED超分辨率采用了一种混合相位掩模在横向和轴向尺寸可调的超分辨率的概念

 

光学切片

经常被视为我 ​​们的感官中最令人印象深刻的视觉感知。 已作出了许多尝试,保留光学印象-或提高他们增加乐趣。 光学成像器件有一个恼人的缺点,虽然成像锐利的范围是有限的。 这种有限的范围被称为“景深”。 尽管我们的眼睛具有相同的限制,我们的大脑意味着巧妙地过滤尖锐部分的整体形象进入我们的意识。 我们认识到,最新的欺诈,如果我们看一张照片和纳闷为什么有锐化地区。

在光学显微镜的景深相对比较浅,尤其是如果我们的物镜是记录高分辨率图像。还有一直尝试增加的景深-摆脱钝化贡献。

解决了这个问题,在过去通过切片成相当薄的切片样品-厚度小于景深。 这些样品没有表现出任何的重点贡献。 但他们也没有一个人试图了解的对象的结构完整性。 重建一个三维视图的对象,例如一个单元格或一个小的有机体,一个有切一个大系列的超薄切片,然后组合所记录的图像。 这个过程显然是相当繁琐,且切割往往会导致严重变形,阻碍正确的重建。

一个更好的方法就是所谓的“共聚焦显微镜”。 共聚焦显微镜删除不属于任何贡献,景深的光学装置,其最突出的部分是“针孔检测”。 为了生成一个三维的重建,这是足以递增的聚焦位置的焦点深度的一半左右,并通过适当的软件,所记录的图像合并。 在过去的20年中,这种方法已经成为一个标准的程序在生物成像

第二种方法有异曲同工之妙的是多光子显微镜,在这里,光学切片发生由非线性效应激发的荧光分子,只有一薄层。

一个真正的共聚焦扫描显微镜(TCS)的光束路径上。检测针孔充当空间滤波器,只允许光通过的焦平面。例如实现在徕卡TCS SP8系统。
 1:共焦扫描显微镜的光路。 虽然光辐射从z方向中的所有层中,只有一个单一的焦平面转移到检测器。 从上面和从下面的焦平面上的光有效地除去由针孔,作为空间滤波器。 OL,物镜的镜头:BS,分束器,PH值,针孔。
 

更好的Z-分辨率:4PI

天然的限制,常规的显微镜是收集来自样本的光的事实,只从一侧。 从一个单点,只有一个半球体图像重建做出贡献。 此半球对应到2P的立体角。 如果有可能,操作上在试样的两侧的两个相对的透镜,理论上的可覆盖的立体角应便士,因此4PI显微镜。在实践中,最大的一个可以覆盖单个透镜是约 1.3 p和4PI显微镜实际上是在2.5 p显微镜。 在4PI显微镜,样品被夹在两个盖玻片之间,并且它必须是足够薄以留出空间,用于聚焦。 因此,厚度超过50微米的样品通常是不适合4PI显微镜。 从两侧的相干照明创建一个密闭的强度,可以允许在轴向方向上的分辨率大约为100nm的层。 这是5-10倍,更好的比较在一个经典的共聚焦显微镜的轴向分辨率。 虽然的长期4PI显微镜建议增加了一倍的分辨率,横向的表现并不显着优于共聚焦显微镜。 这种仪器是第一款商用显微镜聚焦的光,提高成像

无限分辨率:STED

仅靠光学方法显然并没有导致显着改善分辨率。 有标志“表示,不只是提高百分之几的东西,但至少双重的或更好的一个因素。斯特凡地狱的第一个概念被提出,1994年, 这个概念包括非光学物理现象,这是关键的区别较早期的尝试。 在这里,所采用的现象是“受激发射”,第一理论上所描述爱因斯坦,实际应用中的激光光源。 STED的概念,利用受激发射部分耗尽激发荧光发射前发生。 这对应于开关激发态的激发点扩散函数的区域中。 如果耗尽,可以只发生在受衍射限制的激发点的边界时,剩余的发光面积小,因此提高分辨率。 幸运的是,有一个简单的方式照亮同等的边界一个现货衍射图案:一个环形的重点。 这种集中产生到的照射光束的路径中插入一个适当的相位板。 照明,然后通过适当的荧光激发波长为两个方面:第一,与普通的圆形“艾里焦点”,然后,在适当波长光由一个环形的“枯竭焦点”。 排放,​​然后收集在任何其他的扫描光学显微镜像。 STED显微镜,因此“轻松”来自激光扫描共聚焦显微镜。 第一市售系统指定的分辨率下降到2007年的80纳米。

另一种方法:GSD

一旦STED超分辨率已经证明了它的能力允许,具有更好的分辨率比纯光电(衍射极限)成像,咒语被打破,它是安全的讨论超越衍射极限分辨率的图像。 第二个突出的方法是随机情形性质。 的荧光发电机充分稀释,以确保观察点起源只能从单个发射器的约束条件下,可以假设该点代表的点扩展函数。 然后,它是一个简单的任务,找到该点扩散函数,它允许以非常高的精度进行本地化的发射极的中心。 为了重建一个完整的图像,这是需要记录的图像,每个只包含几个分离的发射器 - 通往下一个连贯的图像结构研究的一个大序列。 在这里,一个开关,需要每幅图像,以确保足够稀疏的发射和沉默的发射器也恢复为后续的图像是必要的,覆盖整个结构。 早期建议使用切换荧光蛋白做任务。 然而,几乎所有的荧光染料也产生开关行为暗状态和背部的兴奋状态。 最有名的暗态三重态,这是由荧光随机假设。 适当的强度照射时,大部分的荧光分子可以保持在一个黑暗的状态,只是偶尔的分子处于激发状态驻留很短的一段。 在这段时间内,每平方尺被记录下来,并准备随后的超级解决本地化。 这种方法被称为基态耗尽显微镜。基于这样的理念,在2011年推出商业系统, 徕卡SR GSD

本地化的第三维

本地化显微镜提供了改进的横向分辨率。 理论上,也可以本地化的所有点沿z轴的强度最大,但是,这将需要一个惊人的长采集时间。 此外,定位显微镜通常是基于TIRF技术,这是不聚焦到样品上。 尽管如此,由TIRF范围是一些为300nm,这将是感兴趣的,可以在此范围内的位置进行测量的发射极。 为了完成这个任务,被转向的优势:散光的光学像差。 透镜往往会产生一个点源在没有获得焦点的棒状结构。 即使当场在焦平面上正确地重构,人们可以检测焦平面上方和下方的笔形的结构。 有趣的是,这些铅笔与z轴旋转。 在z解决的定位显微镜,散光引入故意由圆柱形透镜插入。 的旋转角度,然后测量每个本地化点,最后给出了精确度为约50 nm的z轴。 此方法适用于任何类型的定位,因此也与上述的接地状态耗尽技术相结合。 这样的文书近期推出商业版本

无限的分辨率在所有尺寸:STED 3D

最终物镜是无限的分辨率,横向和轴向场大小和工作距离没有限制。 STED方法提供免费聚焦到样品 - 至少在理论上。 有限的轴向分辨率的障碍是可以克服的消耗励磁上面的前部和后部的端部的点扩展函数的特殊相位掩模。 不幸的是,这样的相位掩模的设计,并没有允许在横向方向上的零,同时进行。 ,以计算侧向和轴向的同构的点扩展函数(这在本质上是球体),受激发射损耗的技术结合4PI技术。虽然这种方法效果很好,繁琐4PI的只是一个不平凡的技术结合显微镜是没有准备好,以作为在生物医学实验室的日常工具。 即使是受过良好教育的设施和训练有素的成像会质疑这样的设备的最终利益。 一个更简单的解决方案是结合横向和轴向STED显微镜在3D模式。 在这里,耗尽光束首先被由一个可调谐分束装置。 一条腿配有一个旋涡的相位掩模(这是最好的设计提高横向分辨率)。 改善轴向分辨率,被称为“z轴环形”,是理想的相位掩模配备另一条腿。 重组创建的两脚的点扩散函数,它的形状是一个中空的球体(想象的果冻甜甜圈)。 这个空心球体除去激发态的激发点扩散函数在所有方向上的中心周围。 由于侧向和轴向耗尽的比例是可调的,设置可以进行优化,以实现无论是同构的分辨率,最小的检测量,或最大横向与轴向分辨率。 该技术是现在市售(徕卡TCS SP8 STED 3X )的标题画面(左)和共聚焦显微镜三维受激发射损耗(右)示出了比较。 组蛋白在HeLa细胞的细胞核染色。 水平部(上半部分)中的虚线表示的位置的轮廓部分中,这是在将显示在下部。 注意三维STED在侧向和轴向两个方向上的分辨率的显着改善。

光束路径的Leica TCS SP8的STED 3X照明模块。耗尽激光能量被分成两个级分中,其比例是可以调整由一个可调谐分束器。由此产生的枯竭束在横向和轴向方向可调分辨率的改善。
 2:STED 3X照明模块的光路。 耗尽激光能量被分成两个级分中,其比例是可以调整由一个可调谐的分离器(VS)。 一只胳膊包含相位掩模(φxy),是专为衍射无限的横向分辨率。 时,另一臂配用不同的相位掩模(φZ),允许在轴向方向上的超分辨率。 这两种照明模式相结合,在合并(M)。 由此产生的枯竭束在横向和轴向方向可调分辨率的改善。