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尼康显微镜的荧光原位杂交技术

2013-11-21  发布者:admin 

 近四分之一个世纪以来已通过引入原位杂交的方法检测和研究染色体和细胞的DNA序列在文献中出现的第一个研究文章。 然而,在过去的15年里,发生了一场革命,光镜下通过荧光技术的发展,允许前所未有的轻松,精密,准确定位,识别和生物医学样品的基因构成数据记录。

通过同时使用多个荧光色原位杂交的力量得以极大地延长。 多色荧光原位杂交(FISH),在其最简单的形式中,可以用于识别尽可能多的杂交中使用的不同的荧光团标记的功能。 不仅使用单一颜色,而且颜色的组合,有更多的标记的功能可以被同时检测到单个细胞中,使用数字成像显微镜。

图1中显示的是一个典型的多色荧光原位杂交标本。 正常男性淋巴细胞杂交FITC标记生物素标记Chr2l的的的CHRY探头和CY3高辛标记Chrl3的的和CHRY探头。 在左上角的一个形象的DNA的细胞核用DAPI染色的,采取了使用DAPI过滤器集。 右上角是一个图像的Chr21 CHRY与FITC染色,用一个FITC过滤集。 在较低的左边是一个形象的Chrl3 CHRY CY3染色,用CY3过滤器设置拍摄。 在右下角的图像加入彩色合成图像显示所有物镜染色体的颜色。 由马萨诸塞州弗雷明汉,综合遗传学,添博士Houseal,提供标本。

多色荧光原位杂交,与数字成像技术相结合的技术,今天提供前所未有的功能的多个核酸序列的电池组件,染色体和基因的分析的非同位素检测。

在一个不同的,通常较长的波长的现象,即在一个光波长激发一种化学发光,荧光,用于在整个生命科学的研究各种各样的结构和细胞内活动。 探头和显微镜技术的进步导致的​​荧光技术的快速发展,在过去的十年。

该评论文章将覆盖FISH技术的基本知识的局限性,研究人员已经面临多年来在使用FISH,最近的事态发展在硬件,软件,探针,试剂技术发展的影响,以及在该领域目前的研究结果。 FISH的技术开始扩大超出纯理论研究,为临床诊断设置的新发展,也将被审查。

FISH技术概述

使用FISH基因组学,细胞遗传学,产前研究,肿瘤生物学,辐射标签,基因定位,基因扩增,基础生物医学研究正在迅速增长。 原则上,技术是相当简单的。

标识,杂交反应,或标签,物镜基因组序列,因此它们的位置和大小,可以研究。 适当情况下,染色体特异性探针的DNA或RNA序列,首先与记者的分子标记,通过荧光显微镜,这是后来查明。 标记的DNA或RNA探针杂交到中期染色体或间期核的投影片上。 洗涤和信号放大后,试样的报告分子筛选通过荧光显微镜观察。

FISH形态学和基因组结构,可以非常精确的空间分辨率。 该技术具有快速,简单地实现,并提供了巨大的探头稳定性。 一个特定的物种的基因组中,可确定整个染色体,染色体的特定区域,或单拷贝的独特序列,这取决于所用的探针。

上一页限制

直到最近,FISH是有限的硬件,软件,试剂,探针技术,并参与实施该技术的成本。

市售显微镜硬件优化多色FISH是不可用的,直到20世纪90年代中期。 在此之前,显微镜FISH应用程序进行自定义。 没有被设计成大多数光学显微镜检测FISH信号中固有的低光水平。 作为基因组的分辨率的技术已急剧增加,在显微镜光学系统的要求已进一步增大。 多个波长之间色差一直是一个问题。 对于多色进行具体分析,所有的镜头,包括集电极镜头,不得不被色校正。 此外,落射荧光光源均匀照明难以对齐。

多色荧光原位杂交图像分析使用(一)单个滤波器的多维数据集需要的各种信号的隔离,或(b),利用一个激励滤光轮与多路径的二色性和屏障过滤器。 最近的事态发展过滤技术纠正了一些以前遇到的问题,通过光学失调引起的个别滤光块的机械开关。 激发滤光片轮,可以有效地用于多通分色和阻隔过滤器使用三种颜色,采用每种颜色单独激发滤光片没有注册移位。 但是,对于超过三种颜色,单通滤波器仍然可以使用。

高速彩色胶片或CCD( 电荷耦合器件 )相机,用于收集数据和色彩保真度问题。 此外,叠加的图像的过程中,的收购不同颜色与不同的探针在一个单一的试样的限制。

成像软件,可以定量分析样品荧光试剂也很有限,因为现有的图像分析系统,优化工作与荧光样品。 可视化分析是劳动密集的,往往是主观的程序,并在某些情况下,荧光的样品的分析而使用先进的荧光成像能力是困难的和不确定的。 研究人员通常必须有一个软件开发人员创建自己的内部图像分析软件。

所用试剂和探针本身没有足够的所有应用程序。 例如,现场检测杂交的效率降低随探针大小,创建通过荧光显微镜观察,可观察到显着的限制。 不同颜色的荧光染料的数量是有限的,和染料的光稳定性差。 但由联邦政府资助的人类基因组计划的荧光染料技术和分拆技术的新发展,现在有一定的影响。 有所有的人染色体,越来越多的新的基因的特异性探针的探针可用。 原位杂交试剂盒和荧光标记的探针商业上可从几家公司。

成本是另一个主要障碍。 由于没有市售FISH系统市场上,研究人员组装定制的系统,包括试剂,探针,显微镜,成像硬件,软件,数据分析和报告能力。 同时要执行的多色FISH复杂的图像分析可能花费20万美元,大多数临床研究人员不容易接触到的一笔研究员向上。 其结果是,许多研究的科学家们希望在他们的实验室使用FISH被禁止这样做。

FISH已成为广泛使用

许多硬件和软件制造商已经开发出的方法来创建自定义系统的负担得起的商业替代品。 发达国家的许多公司和实验室从事FISH类合作精神,让新的突破发展。 作者将引用在自己的经验作为例子,这些类型的系统的发展。

构成的系统中使用,在美国,它提供了一个中等价位的FISH系统研究,从一些厂家和依赖于图像分析软件,显微镜硬件及配件的最新发展。 临床研究实验室会发现该系统可用于各种各样的应用。 该系统提供了集成和自动化的最终处理临床测试卷。

软件系统所示,这里是MultiFluor(TM)多参数成像软件(生物检测系统),在Microsoft®Windows(微软,华盛顿州贝尔维尤)为基础的系统,可以检测,分析,多色显示的结构和分子功能FISH样品。 分析的时间和准确性得到改善,通过关联测量在每个样品中的各种波长的多个功能。 该系统有利于图像采集,图像存储,数据库管理,显微镜自动化控制,全功能的图形化数据分析。

如图2所示MultiFluor软件数据审查画面。 用户也可以检查图像和相应的数据一起,和关联从多个颜色(波长)的交互式图形绘制工具,包括直方图,散点图等,这里使用各种多参数数据,多个数据图表一起显示所选择的多彩色的图像设置的小区(DAPI染色细胞核,FITC-ChrX,CY3-CHRY,CY5 Chr2l的示出),以及与原始数据表中所示的测量。

FISH研究人员可以自动捕捉多种波长和多个焦平面的图像,多色FISH探针可视化,注释和图像打印出来,并存储和检索大量的彩色图像数据集。 多色荧光原位杂交中期染色体进行分析,包括基因定位, 比较基因组杂交 (CGH)的比率,和核型的产生。 用户选择的地区,可以扫描和分析样品。 该软件的自动对焦操作,在多个波长上获取图像,记录细胞的滑动位置,并测量多个功能,包括探头计数,荧光强度,和细胞形态计量学。 可以从多种波长的多个功能相关。

该系统的另一个特点是其工作能力与联网的个人计算机(PC)。 在一个典型的设置,一台PC机连接相​​机和显微镜硬件上线的分析站。 这台电脑处理的图像采集和瞬时分析。 其他电脑服务复审站第一台PC所产生的结果进行分析,或进行专门的分析脱线。

软件允许所有图片要显示的组件在生动的伪多色同时成像。 例如,图像,同时四色实验,用DAPI(蓝色),FITC(绿色),CY3(红色),FITC-CY3(黄色)的组合都可以被单独显示,或相结合,以形成彩色复合图像(在图1中)。 每个图像可以以交互方式增强揭示兴趣特征。 此外,很容易创建直方图,散点图,试算表,线图,以及其他形式的数据制表和审查通过软件(图2)。 最后,数据保存在一个方便的流行的数据库格式,可以存储为TIFF,JPEG,GIF,或其他文件。

EPI-照明

自动显微镜硬件也是系统的一部分。 Optiphot和以后的模型显微镜系统(尼康仪器有限公司,梅尔维尔,纽约),具有自动化,计算机驱动的XYZ阶段和对焦系统,存储每个对象的坐标。因此,重要的细胞和染色体位点可以被立即召回在显微镜幻灯片简单地搬迁细胞按钮上点击鼠标,让更广泛的显微镜目视检查或审查。

其中最重要的显微镜系统的优点是FISH的应用程序设计的照明装置的开发。Quadfluor(TM)和后来的模型落射荧光照明(尼康仪器公司)接受四个荧光滤光块,大幅提高亮度和对比度,这是重要的好处,研究人员用多种荧光染料。

照明,进行FISH和其他先进的荧光技术的研究人员可以自由工作没有停下来更换过滤器立方体,具有四个或更多不同的探针。 ,是用于切换的四个过滤器中的一个非常精确的线性滑动件的平滑移动,确保出色的图像配准。

该过滤器的多维数据集提供更高的亮度和非常高的对比度通过励磁机,分色,节流阀过滤技术的使用;内部轻莫名其妙;节流阀过滤器的高精度斜的安装角度和专有的抗反射涂层。 此外,落射荧光照明器可以容纳在一个时间中的四个立方体用于分离不同的荧光信号,或者可以用于多频带滤波器立方体的一些荧光染料同时图像。

高传输的物镜也是必不可少的成像分钟染色体上的利益。 CFI-60 plan fluor物镜(尼康仪器公司)的光水泥高透光涂层,以允许更广泛的波长范围和明亮的图像。 物镜是自由的色彩和球面像差,并提供极高的对比度和低背景的自发荧光。

其他电脑控制的显微镜配件,以创建先进的电动系统,这将是模块化和更负担得起的研究和临床应用目前正在开发的几个厂家。 相机是该系统的另一个重要的考虑因素。 图像可以使用数字CCD或愈演愈烈摄像机的收购。 在系统中的关键因素是他们有能力执行而不牺牲保真度低光成像。 通过适当的软件,可以自动设置相机的设置,通过全自动化的显微镜的精度和易用性。

癌症,产前,产中和生物学研究

这里描述的FISH系统,可以访问到更多的比旧的,定制系统的研究人员,正在进入更广泛地使用在癌症研究,病理学,遗传学,发育生物学。 在他们的应用程序间期细胞多色探测器点计数,免疫,细胞形态学,DNA含量的分析。

该系统是在使用测试畸变染色体拷贝数,总DNA含量的相关性,与膀胱肿瘤。 在出生前的研究中,该系统可用于测试在产前唐氏综合征,特纳综合征,克氏综合征,以及其他的缺陷,包括相关联的间期核中的anneuploidies。 在细胞和发育生物学的研究中,该系统可用于映射的存在和相对分布的细胞表面标志物,例如受体,胞质蛋白标志,包括细胞骨架蛋白和特定的基因的信使RNA。

诊断潜力

在过去的十年半,研究人员已经知道,FISH技术具有非凡的潜力,不仅为纯理论研究,但作为一种工具,产前诊断,细胞遗传学,肿瘤评估等领域的临床诊断中使用。 缺乏一个高层次的,价格适中的系统,不仅放慢了速度FISH已成为大多数研究者,但也阻止这种不可避免的扩张技术的辅助诊断的医疗保健设置。

在此系统中的最重要的后果之一是,它可以提供高级别的结果,不仅成本高,自定义配置的系统能够提供在过去。 将FISH不仅要更广泛的生物医学研究中的应用,而且成为患者的直接需要的梦想可能会在不太遥远的将来成为现实。