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尼康显微镜,荧光共振能量转移(FRET)显微镜与荧光蛋白的基本原理

2013-11-16  发布者:admin 

 在活细胞中,动态的蛋白质之间的相互作用被认为是发挥了关键作用,调节许多信号转导通路,以及广泛的其他关键流程。 在过去,经典的生物化学方法,阐明了这种相互作用的机制是司空见惯,但是弱的或短暂的相互作用,可能会发生细胞内的天然环境是这些技术通常是透明的。 例如,合作一直怀疑蛋白本地化合作伙伴使用固定细胞免疫荧光显微镜检查相互作用在原地 ,并已提交了大量的文献报道基于这种技术的常用方法。 然而,由于在荧光显微镜的分辨率小于一个典型的蛋白的大小为几百倍,共定位往往导致有疑问的结果。 一个很好的比喻就是荧光显微镜产量相当于知识的信息,说有两个学生大讲堂。 它不提供所需的分辨率,以确定学生是否在同一教室或更好,但如果他们坐在相邻办公桌。

典型的荧光显微技术,依靠由一个波长(激发),然后由后续的二次荧光发射波长较长的光的荧光基团的吸收。 由几十到几百纳米的激发和发射波长往往是彼此分开的。 与特定的荧光基团标记的细胞成分,如细胞核,线粒体,细胞骨架,高尔基体,膜,使它们定位于固定和生活制剂。 同时通过标签的一些亚细胞结构分隔的激发和发射光谱,专业荧光滤光片组合的单个荧光基团,可以被用来在一个单一的细胞或组织切片检查标记的分子接近。 使用这种技术,比光学分辨率极限是紧密联系起来的分子似乎是重合(,说共定位 )。 这种明显的空间接近,分子缔合是可能的。 然而,在大多数情况下,生物分子之间的相互作用,以确定是否发生正常的衍射极限的荧光显微镜的分辨率是不够的。

共定位测量,在最好的情况是暗示误导在最坏的情况下,特别是考虑到,许多信号传导通路,使用相同的细胞结构,例如,网格蛋白包被的凹坑是利用许多受体复合物内在化。 两个分子或蛋白质的知识,其实是相邻的,并不仅仅是居住在同一街区,提供了更可靠的确定其潜在的相互作用。 历史悠久的电子显微镜技术有足够的分辨率,以满足高精度定位,精确的标示方法,只是缺乏必要产生可靠的结果。 此外,许多的合作定位技术一般应用于使用固定的细胞内,这就排除了非常可取的动态测量检测活细胞达到。 多色的荧光蛋白的荧光成像容易地允许与活细胞的实验,这是必要的瞬时相互作用的检测,但该方法受到限制到约200纳米的具有相对较差的空间分辨率。

申请的福斯特(或荧光)共振能量转移(FRET)的显微技术测定蛋白质分子的空间接近的限制是可以克服的。 发生FRET之间的正确定位的荧光基团,只有当它们分开的距离是8到10纳米或更小。 因此,荧光共振能量转移是非常适合于定位在几纳米彼此的两个分子之间所发生的蛋白质相互作用的调查。 在过去的十年里,FRET方法已经得到普及,由于在应用中需要使用的特定蛋白质和多肽融合绿色荧光蛋白(GFP)及其突变衍生物基因靶向的崛起。 两个光谱上不同的荧光蛋白(称为FP-FRET)之间的荧光共振能量转移已被广泛地应用于两个明显分开的实验技术,如下面所讨论。 图1给出的是一个雅布隆斯基参与之间的供体发射和受体吸收FRET耦合激发态跃迁能量图。 吸收和发射的转换表示的直线的垂直箭头(蓝色,绿色和红色),而波浪形的黄色箭头指示的振动弛豫。 雅布隆斯基图表明其正确位置,他们应该出现从光子介导的电子跃迁的虚线绘制的耦合转换。 在一个合适的接受体的存在下,供体荧光团激发态能量转移受体直接而发射一个光子(紫罗兰色的图1中箭头所示)。 将所得的荧光敏化发射具有受体的发射光谱的特征相似。

广泛实施的主要障碍之一FRET技术在活细胞中的调查一直缺乏合适的方法,用适当荧光标记特定的细胞内蛋白质。 最近开发的荧光蛋白,具有广泛的光谱和日益复杂的蛋白嵌合体(融合以及生物传感器)已经导致了一些潜在的荧光蛋白对,是非常有用的FRET实验。 FRET荧光蛋白的应用涉及到两个不同的蛋白质,每个不同的荧光蛋白融合将选定的一成生物传感器(一个单一的基因编码的结构)或间进行测量。 后一种方法已被用于图像的各种蛋白质的相互作用,包括受体的寡聚化和阐明转录因子的功能。 然而,进行FRET检测的独立蛋白嵌合体是困难得多,由于可变化学计量时,不可避免地发生在活细胞中表达独立的荧光实体。 不管难度,这种性质的实验可以得到信息的结果,当安装了适当的控制,并以严格的精度进行调查。

荧光蛋白质传感器

荧光蛋白的生物传感器已广泛的实用汇报多样化的胞内过程。 通过创造性地融合对执行关键功能,涉及各方面的生理信号的生物聚合物的荧光蛋白,研究的科学家已经开发出了一系列新的分子探针,可用于光学活细胞成像的重要过程,如钙波感应,循环核苷酸信使作用,pH值的变化,膜电位的波动,磷酸化和细胞内的蛋白酶行动。 另一种方法,但非常有用的,战略生物传感器建设涉及荧光蛋白骨架结构本身的修改,要么肽分割成个别单位相结合, 在体内产生荧光(一种技术被称为双分子荧光互补;BiFC )或加入天然的氨基和羧基末端,并创建一个插入位点的分子内传感器肽。

第一荧光蛋白质的生物传感器是一个钙离子指 ​​示剂卡 ​​默莱昂 ,夹着蛋白钙调素和钙的钙调蛋白结合结构域的肌球蛋白轻链激酶(M13域)之间的增强的蓝色和绿色荧光蛋白(EBFPEGFP)构成。 在水平的不断提高细胞内钙离子的存在下,M13域结合的钙调蛋白的肽,以产生增加的荧光蛋白之间的FRET。 不幸的是,该传感器由一个非常低的动态范围(荧光增加了1.6倍)阻碍,很难想象,由于缺乏亮度和耐光性较差EBFP。 YFP的衍生物(称为camgaroos)生成的钙敏感的肽插入在开始的第七β时,使用相同的模板,将青色和黄色的变种ECFPEYFP,得到较高的信号电平,和甚至更好的结果,得到的改进的版本链荧光蛋白骨干。 位于这种不寻常位置传感器肽是相当良好的耐受性方面保持高水平荧光。 然而,另一种策略利用独特的桶结构常见的荧光蛋白重新配置的蛋白质的端部连接的天然N末端​​和 C末端,并创建一个新的起始密码子的结构的中央区域内(通常在几个位置之一了循环)。 称为循环置换荧光蛋白,这些结构修饰衍生物可以稠合钙调蛋白和M13,产生极好的钙的生物传感器。

紧接着遗传指标,pH值,磷酸化,和蛋白酶活性钙的生物传感器。 一般有两种方法可用于以适应荧光蛋白的pH值的传感器。 首先依赖于绿色荧光蛋白的荧光灵敏度(的pKa = 5.9)和EYFP(pKa值= 6.5)结合的其它蛋白质的相对不敏感性,如ECFP(pKa值= 4.7)或红色荧光蛋白 (的pKa = 4.5)的酸性环境。 与较不敏感的荧光蛋白EGFP或EYFP融合建立一个比例的探头,可用于测量细胞内的酸度。 第二种方法依赖于质子改变原生(野生型)的GFP导致双峰式频谱公司的天然蛋白质的转变。 A类的探针命名的pHluorins,来自wtGFP,具有激发峰值从470到410纳米的pH值下降的转变。 双排放pH传感器也得到了发展,在绿色和蓝色光谱区域有峰。 虽然无法实时报告激酶活性,磷酸化的生物传感器包括含有从一个特定的激酶和一个之间夹持两个FRET能力的荧光蛋白的磷酸化肽的结合结构域的磷酸化基序的肽。 由激酶磷酸化的生物传感器,磷酸肽结合结构域的磷酸化的序列结合,从而调用或破坏FRET。 这个简单的策略已经被证明产生强大和高度特异性的生物传感器。 与许多其它生物传感器的主要缺点是降低了动态范围。

也许最广泛使用的生物传感器的设计,筛选新的或改进的荧光共振能量转移,对涉及到的蛋白酶裂解位吸附试验(参见图2)。 简单的图案由两个联系在一起的,其中包含一个共识的蛋白酶裂解位点的短肽荧光蛋白。 在一般情况下,该传感器具有非常强的能量转移裂解接头序列后,完全取消。 由于该技术通常具有高动态范围的水平,它可以被用于筛选新的青色和绿色荧光共振能量转移的供体与黄色,橙色和红色的受体。 最大的家族蛋白酶的生物传感器,采用了敏感的裂解位点的半胱天冬酶家族的蛋白酶,使传感器可诱导细胞凋亡过程中检查。 在过去的数年中,大量的新颖的生物传感器,同时使用敏化荧光蛋白和荧光共振能量转移对已有报道。尽管继续FRET传感器采用ECFP和EYFP衍生物的动态范围的限制,这一策略已被广泛采用,这可能是由于简单的比例测量探头建设,缓解。 新战略将毫无疑问出现使用更先进的服务,以增加这个非常有用的一类探头的动态范围等性能的荧光蛋白组合。

FRET基本原理

捐助荧光FRET涉及电子激发态中,这可能会激发能量转移到附近的受体荧光(或发色团)在非辐射的方式,通过远程偶极 - 偶极相互作用的基本机制。 的理论支持的能量转移为基础的治疗激发荧光团的振荡偶极子与第二偶极子具有相似的谐振频率,可以进行能量交换的概念。 在这方面,共振能量转移是类似于耦合振子的行为,如在相同的频率或无线电天线的一对音叉振动。 与此相反,辐射能量转移需要发射和重新吸收光子,并依赖于试样的物理尺寸和光学性质的,以及容器的几何形状的波阵面途径。 共振能量转移和辐射机制不同,可以产生显着量的结构信息有关的供体 - 受体对。

周边溶剂壳荧光团共振能量转移是不敏感的,因而产生唯一的溶剂相关的事件,如荧光猝灭,激发态反应,溶剂松弛,或各向异性的测量揭示的分子信息。 参与共振能量转移的荧光团的主要溶剂的影响是供体和受体的光谱特性的影响。 在更长的距离比短距离的溶剂效应和介电性质的成分(溶剂和主机大分子)的位置所涉及的荧光团之间的无辐射能量转移发生共振能量转移的功效上具有非常小的影响,这主要取决于供体和受体荧光基团之间的距离。

荧光共振能量转移的现象还没有介导的光子发射,并且,甚至不要求受体生色团是荧光。 然而,在大多数应用中,供体和受体荧光能量转移的发生通过供体荧光淬灭的荧光寿命的减少,也伴随着受体的荧光发射的增加体现。 特奥多尔·福斯特共振能量转移的理论最初是开发,以纪念他的贡献,最近被他的名字命名。 福斯特理论表明,荧光共振能量转移效率(E)的两个分子之间的距离(用r表示)的倒数第六功率变化:

EFRET = 1/[1 + (r/R0)6]

其中,R(0)为特征的荧光共振能量转移效率为50%,这可以计算出任何对这个变量也被称为福斯特半径,并在下面更详细地讨论)的荧光分子(距离。 荧光共振能量转移效率的理论荧光基团对(增强型青色和黄色荧光蛋白)以图形方式显示在图3(a)。 由于逆第六电源依赖于两分子之间的相关(r)的距离,该曲线具有一个非常急剧下降。 距离小于R(0),荧光共振能量转移效率接近最大,而距离大于R(0),效率迅速趋近于零。 有用的范围,用于测量FRET的红色与0.5和1.5×R(0)的限制,在图3(a)中的阴影区域所示。 FRET技术可以有效地使用这些距离接近R(0)作为分子的统治者 ,而事实上FRET已被改编为结构生物学等用途的通过精密光谱方法。 然而,对于大多数应用中在细胞生物学中,可用的信号 - 噪声比限制FRET实验更二进制读出。 作用时,一个测量往往会只能够区分FRET高低-FRET,或简单地之间的FRET的存在和缺乏。

正如前面所讨论的R(0)可以容易地计算出任何对荧光分子。 R(0)的值在水性溶液(或缓冲)由一个相当简单的方程与完善的输入参数:

 

R0 = [2.8 x 1017 × Κ2 × QD × ΕA × J(λ)]1/6 nanometers

Κ(2)卡伯平方的两个荧光团之间的偶极子(参见图3(b)就用于计算取向因子的角度概要)表示的取向因子Q(D) 是供体的量子产率Ε(A)是最大的受体在每厘米相互摩尔消光系数,和J(λ)是光谱的重叠积分(参见图4),F(D)(λ)之间的归一化供体荧光,激发光谱和受体E(A)(λ) ,根据公式:

J(λ) =  FD(λ) × ΕA(λ) × λ4

虽然可能会出现复杂的数学,大多数参数是常数,在文献中很容易被发现。 的两个最重要的方面,通常需要进一步的解释Κ(2)J(λ),重叠积分。 取向角变量(Κ(2))只是表示该FRET耦合取决于两个荧光团之间的角度大致相同的方式的无线天线的位置可能会影响其接收。 如果供体和受体的相互平行地排列,FRET的效率会更高比,如果他们是面向垂直。 这种程度的对应定义Κ(2)。 虽然Κ(2)可以在0和4之间会发生变化,它通常是假定为2/3,这是集成了所有可能的角度的平均值。 对于几乎任何现实的情况κ(2)接近2/3,而且通常研究者可以做调整这个值无关(虽然有些生硬地把他们的目标蛋白质的利益附加荧光蛋白质,这可能导致戏剧性效果)。 重叠积分,J(λ) ,是两光谱之间的重叠区域,如在图4中示出。的其他参数,可能会影响FRET的供体和受体的消光系数的量子产率。 因此,为了最大限度地提高FRET信号,研究者必须选择量子产率最高的供体,最高吸收的受体,荧光基团,具有显着的重叠,在它们的光谱公司。 这一理论被反复通过实验验证,有没有其他机制,以最大限度地提高非对齐的荧光探针的荧光共振能量转移。

应当指出,上面所讨论的每一个参数的影响仅由第六电源福斯特半径计算。 因此,增加一倍的供体的量子产率只有12.5%的R(0)的变化结果。 因为几乎所有荧光FRET成像实验具有很高的量子产率(大于0.5)和消光系数(大于50,000),可能福斯特半径值的范围是有限的4至6纳米,和大多数FRET对的平均值R(0)〜5纳米。 由于FRET效率强烈地依赖于分离以及FRET对的荧光基团的相对方向的距离,荧光共振能量转移,可以用来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用而产生的变化,这两种蛋白之间的亲和力或变动的变动他们的结合的构象。 这是值得重复的是,对于大多数FRET成像在细胞生物学中的应用,实验一般区分只有两种状态之间(FRET没有FRET)和附加信息是必要的助手解释所观察到的,在分子FRET变化。

FRET测量影响因素

在实践中,广泛的问题可以复杂和/或妥协FRET测量,最终导致含糊或无意义的结果。 其中的主要问题是成像时,供体和受体荧光基团,可能会表现出明显不同的亮度级别。 虽然从理论上说,这种差异不应该是一个问题,但是在实践中,因为大多数仪器可以测量只有有限的动态范围,双荧光成像可能会导致饱和(对于较亮的荧光基团),而另一个通道主要是由系统的一个通道噪音调光荧光。 因此,只要有可能,最好使用一个供体和受体,可比亮度。

另一个因素,可以限制检测FRET的供体 - 受体的化学计量,是在10:1和1:10之间的范围之外。 这个因素可能是一个严重的限制FRET测量蛋白质 - 蛋白质相互作用,其中一个合作伙伴可能是多余浓度。 主要问题是不接受FRET荧光标记的背景FRET小级别的测量。 由于这样的事实,实在没有什么可以做,以改善这种情况,主机蛋白质相互作用可能落入这一类的实验是根本不适合考试FRET技术。 对于如上所述,只有一个单一的供体和受体的构造的荧光蛋白质的生物传感器,化学计量比是固定的,保证为1:1,因此,此问题不会出现的信号电平保持恒定,无论浓度的生物传感器。

在场的流血通过(也称为串扰交叉 )和频谱重叠荧光团之间的交叉激励也很重要的问题,可以阻碍FRET调查(参见图5)。 在某些情况下,受体可以直接与选择的波长区域中的光激发,以激发供体(图5(a))。 此外,从供体的荧光泄漏到受体荧光的检测通道,尤其是当供体和受体的发射光谱公司表现出显着的重叠(图5(b))。 因为这两个来源的串扰产生的有机荧光的光物理必定是目前任何FRET对,他们必须解决的时候FRET测量。 选择是很好的分离光谱的荧光团,是一个很好的机制,以减少串扰。 然而,在大多数情况下的光谱分离的增加也减少了重叠积分(J(λ)),这在实践中通常被转化为能力下降,检测到FRET信号。

最后,两个荧光基团,如果没有正确对齐的信号可以被减少(例如,具有Κ(2)值近似为零),或当它们存在根本就没有定位在福斯特半径(大于6纳米水平的FRET )。 作为一个例子,如果两个标记的蛋白质相互作用,但位于配合物的相对侧上的荧光标记,则有可能无法检测到FRET信号,即使感兴趣的蛋白质绑定。 在一般实践中,这种类型的假阴性是相当普遍的,特别是与荧光蛋白的荧光共振能量转移贸易伙伴。 通常情况下,一些标记策略之前,需要有足够和可靠的FRET信号被检测到。 然而,上述问题可以得到缓解(或部分)的矢量结构或进行合成标记实验之前使用的荧光对明智的选择。

如图5所示的重叠中的激发和发射光谱ECFP和mVenus的,目前最优选的荧光蛋白对FRET调查。 激发(图5(a))和发射光谱(图5(b)),这两种蛋白质表现出相当大的重叠。 直接激发的荧光共振能量转移受体(mVenus;红色曲线)可以是显着的波长取决于用于激发的供体(ECFP;青色曲线或mCerulean的蓝色曲线),由于较高的消光系数黄色蛋白相比,青色蛋白。 这种重叠是特别成问题的ECFP的作为给体使用时,可以部分抵消了具有高消光系数,如mCerulean使用CFP的变种。 请注意,在图5(a)中的励磁曲线按比例绘制的,以反映黄色和青色蛋白之间的消光系数的差异。 激发波长为458纳米,产生一个更高的水平的mVenus激发串扰比激发波长为405纳米或440纳米。 ECFP广泛的荧光发射光谱(图5(b)条)显示出相当大的强度重叠,整个区域发射mVenus。

FRET技术在细胞生物学应用

调查采用荧光蛋白的生物传感器,或试图匹配的化学计量融合荧光探针分离相互作用的目标,应使用尽可能多的不同FRET分析技术可行的建立对于一个给定的实验方法。 这种努力是必要的,因为每个荧光蛋白FRET对具有不同的病理,其使用的复杂性,需要清楚地了解应用光学显微镜参数测量相对较小的信号差异在大多数FRET检测。 一旦系统和可能的结果是确定无疑的,则最简单的办法可以用于正在进行的程序。 列表中的技术已经发展到图像FRET是相当广泛的。 在一般情况下,所有现有的测量策略可应用于FRET荧光蛋白实验,但基于现实的考量,一般的方法已被证明特别有用:

  • 敏排放 -双通道成像使用一种算法,纠正串扰激发和发射

  • 受体漂白 -也被称为施主去猝灭受体光漂白时,这种技术措施增加了供体发射

  • 荧光寿命成像显微镜(FLIM) -荧光蛋白(或其他荧光)体寿命测量的变化

  • 光谱成像 -令人兴奋的一个或两个波长,测量供体和受体的完整光谱剖面

  • 荧光偏振成像 -测量偏振平行和垂直于激发高信号噪声

每个FRET以上列出的方法都有长处和短处。 例如,在一方面中,两个通道成像法是最简单,但需要最复杂的控件集。 另一方面,FLIM的可以得到明确的测量FRET效率,但是昂贵的,尚未广泛地提供给大多数细胞生物学实验室仪器仪表来测量纳秒寿命。

敏发射

通常也被称为二色比与对照成像 ,敏化发射可能是最简单的成像方法,荧光共振能量转移。的供体荧光团的激发的特定波长(在宽视场或共聚焦显微镜),收集的信号被通过使用选择供体荧光和受体荧光的发射滤光片。 的两个荧光团的激发波长和荧光之间的串扰(不现实)不存在,那么敏化发射将是一个完美的方法。 然而,荧光蛋白之间的串扰是一个重大的问题,通常需要广泛的控制实验建立的FRET的存在或不存在。 因此,它是很难获得定量准确FRET使用这种方法的数据。 敏化发射是相对简单的配置上的宽视场荧光显微镜下,可以在许多实验室中,但必要的对照实验,需要相当大的图像处理减去串扰分量,这显着增加噪音水平测量中的不确定性。

纠正的办法已经制定各种致敏发射FRET成像。 的基本概念涉及多个样品,含有:供体,只受体,和推定的FRET的供体和受体的样品使用不同的过滤器组合。 从这些样本的排放值允许研究者量来确定预期串扰的激发和发射通道和减去它FRET测量。 在理论上,这种方法效果很好,但不幸的是,图像处理的要求增加噪音水平在所有的图像。 因此,如果FRET信号分钟,那么它可能是难以测量的FRET使用这种方法。

尽管存在上述困难,FRET信号是由于大的能力,同时获得两个图像进行快速动态实验,致敏发射测量可以是有用的。 研究FRET的动态范围大,以1:1的比例是固定的供体和受体的化学计量的荧光蛋白的生物传感器时,敏化发射是一个特别有吸引力的技术。 一个很好的例子是的蛋白酶生物传感器,如图2所示。 这种嵌合体已设计有很高的FRET效率下降基本上为零时酶解肽连接。 其结果是一个大和容易测量的荧光共振能量转移,演示了在一个给定的时间和区域的特定的蛋白酶活性,在活细胞内的变化。

受体漂白

虽然只限于一个单一的测量,受体漂白(或捐助去猝灭)是一个简单的技术,往往效果极佳。基本概念利用捐助者的荧光淬灭FRET期间,因为一些捐助荧光能量输送到受体的事实。 受体荧光光漂白的不可逆消除淬火效果,并增加了供体的荧光水平。 FRET荧光团之间发生,捐助荧光受体被删除时,必须增加。 在一般情况下,重要的是要确保该受体光漂白不会降低供体荧光,至其初始值的大约10%的光漂白受体。 容易满足这些约束同时用激光扫描共聚焦显微镜,但也可以实现与宽视场或旋转盘显微镜配备一个专门的照明系统的。

受体漂白技术的优点是非常简单的,定量的,只用一个单一的样本进行。 减去漂白后其强度受体在受体的存在下从供体强度,然后漂白后的供体强度的归一化该值,可以计算出的荧光共振能量转移效率。 的主要缺点是,受体光漂白是破坏性的,可以只使用一次,限制了它的应用程序,这些实验中不涉及与动态测量每个单元格。 此外,光漂白是一个相对缓慢的过程,通常需要几分钟或更长时间。 然而,它几乎总是值得执行受体漂白测量的实验结束时,无论取的方法被用于测定荧光共振能量转移。

图6中的例子致敏排放和受体漂白FRET实验用活细胞成像。 图6(a)示出一个人宫颈癌癌上皮细胞(HeLa细胞线)表达一个卡默莱昂生物传感器包括具有介于其间的钙敏感的肽,含有钙调素和M13域(如上所述)熔合在一起的mCerulean mVenus的。 之前,除了钙诱导剂(离子霉素),激发细胞与440纳米照明产生青色荧光指示缺乏青色和黄色荧光蛋白(图图6(a))之间的荧光共振能量转移。 添加伊屋诺霉素,缩时后记录两色比成像(致敏发射)穿过细胞质中的钙波的生物传感器响应增加的电平之间的荧光蛋白的荧光共振能量转移(图6(b)和图6(c) FRET pseudocolored黄色,红色)。 的非洲绿猴肾细胞(COS-7行),如图图6(d) - (f)项标记的合成花青染料Cy3标记(图6(2),绿色)和Cy5(图6(五);红),霍乱毒素B亚单位结合,并定位在质膜。 于膜中,接近的两种染料的荧光共振能量转移,产生一个高的水平。 漂白Cy5的细胞的选定区域(白色方块图第6(e))中,增加了供体去猝灭(在图6(f)条的绿色荧光增加)时,在相应的区域可视荧光供体通道。

荧光寿命成像显微术(FLIM)

寿命测量是迄今为止最严格的方法,用于确定荧光共振能量转移,此外,它们也不易出现到串扰工件由于这样的事实,只有供体荧光监测。 所有荧光分子具有一个指数衰减,在纳秒时间刻度上的荧光,并消减率是敏感的荧光猝灭的环境变量。 因此,FLIM的基本概念有点关系受体光漂白。 该供体的荧光被淬灭的荧光共振能量转移相互作用,淬火的量可以通过测量存在FRET的供体荧光衰减时间的减少来确定。 以这种方式,FLIM的FRET效率提供了一个确定的值。 其中合并FLIM-FRET的测量的优点是不敏感受体激发工件定向,以及事实上可以被耦合到荧光供体的受体本身不是荧光。 这两方面都有助于扩大一些有用的荧光蛋白FRET对调查。

FLIM有诸多限制,防止它主要的方式FRET成像。 主要是复杂的,在纳秒寿命区的测量和检测仪器是昂贵的取得和保持。 此外,这种类型的精密的设备没有得到广泛的使用。 此外,FLIM通常是在较慢的成像方法,可能需要几分钟的时间,获取每一个形象,这限制了它在许多实用FRET实验。 解除这些限制可能会在未来更加人性化和更快的交钥匙商业系统的开发厂家。 另一个显着的缺点是,在活细胞中的荧光蛋白的寿命往往显示多指数衰减,需要更全面的数据分析进行定量FRET检测。 此外,本地化的环境因素,如自体荧光,或改变pH值,也可以测得的荧光寿命缩短,导致工件。 因此,必须采取极为谨慎的解释活细胞FLIM-FRET数据。

光谱成像

光谱成像技术是致敏发射变化FRET检测方法,但被收集后,而不是采集数据,通过两个独立的通道,整个发射光谱同时含有供体和受体荧光激发捐助。 录制整个频谱是一个典型的用于光谱实验的方法,但是是一个相对较新的工具调色板除了在广角和共聚焦显微镜。 的概念中心的前提下,使收集的整个荧光光谱重叠光谱分离不只是使用的发射峰,但不同的形状的谱尾。 在收集从供体和受体荧光团的频谱,它是可能的,以确定供体和受体荧光的相对水平。

光谱成像技术需要专门的设备,但优秀的系统都是现成的许多商业共聚焦显微镜,可以添加到常规荧光显微镜以温和的代价。 由于受体的直接激发,或在共聚焦显微镜中使用的激发波长的串扰水平进行了定量分析,允许FRET的量的准确测定。 这种方法的主要缺点是减少与获得完整的频谱,而不是通过两个通道与一个过滤器为基础的系统中收集相关的信号对噪声比。 然而,随着越来越多的商业系统中,正在开发和安装的应用光谱成像在荧光共振能量转移检测增加。 在不久的将来,它是光谱成像很可能会成为执行的主要方法之一FRET成像实验。

图7所示的(a)中的变化捐助终身衰减(mCerulean荧光蛋白)组成的10氨基酸接头融合在一起的mCerulean mVenus荧光蛋白伪FRET生物传感器。 蓝色衰减曲线观察细胞表达mCerulean单独的一生,而红色衰减曲线呈现mCerulean的的一生时获得细胞表达的级联蛋白。 注意蛋白参与共振能量转移时的在寿命mCerulean减少。 曲线之间的区域表示通过FRET从mCerulean(供体)mVenus(受体)在FRET配对转移的能量。 从450到650的纳米mCerulean mVenus活细胞在405纳米的激发时,在相同的伪生物传感器的发射曲线由图7(b)中红色曲线描绘。 转移的能量从mCerulean到的主要发射峰(的mVenus最大发射529纳米),具有非常低的值(约25%),在475纳米,峰值发射波长为mCerulean mVenus结果。 用514纳米的激光漂白后mVenus的和重复的光谱扫描,发射配置文件转移到更低的波长和非常相似的频谱mCerulean没有一个FRET伙伴。 在475和529纳米的光谱强度的差异有关的荧光共振能量转移效率之间的耦合的蛋白质。

极化各向异性成像

荧光偏振测量提供独特的优势为高对比度歧视荧光蛋白FRET。 这个概念是基于这样的事实,与偏振光的激发的荧光分子的吸收载体平行排列的激发光的偏振矢量选择人口。 激发后,立即将保持偏振平行的荧光发射的,可以考虑,使激发的荧光偏振各向异性。 各向异性会消失,如果分子旋转在纳秒荧光寿命。 然而,由于荧光蛋白大,并慢慢旋转,其荧光不会去极化在测量时间内场进行任何重要程度。 如果发生荧光共振能量转移之间的两种荧光的蛋白质,是稍有错位,那么偏振的荧光发射,会出现在不同的角度(从激励矢量),它模拟了一个旋转的荧光蛋白。

这种方法的主要优势是易于测量荧光偏振平行和垂直于具有高信号对噪声的激励矢量。 由于极化各向异性数据可以迅速获得与最小图像处理要求,该技术非常适合应用在高内涵筛选。 受体的直接激发,必须避免,但是,因为它可以减少供体信号和减少的信号噪声比的测量。 此外,虽然这项技术是一流的FRET的存在和不存在区别,它是强与弱之间的FRET区分不是一个好方法。 最后,偏振可以降低在高数值孔径物镜,所以偏光FRET实验应限于具有的数值孔径为1.0或更小的目标成像。

如图8所示是使用荧光蛋白作为模型系统的偏振各向异性的图解说明。 当被激发的荧光蛋白(图8(a))的随机取向的人口与直线偏振光(青色波),只有那些分子,其吸收偶极向量取向平行于偏振方位角优先兴奋。 排放的方向正确的荧光蛋白质,可以观察到作为信号使用的分析仪的激发光的偏振矢量(绿色波)也平行。 由此产生的各向异性,这是取向度的一个指标,可以通过垂直和水平方向的分析仪,通过测量和比较的发光强度决定。 的各向异性的信号电平将降低,如果荧光蛋白的旋转在时间刻度中的实验(图8(b))或转移,则其激发能量,由于FRET具有不同方向的相邻的蛋白质(图图8(c))。 如上所述,由于这样的事实,可以发生共振能量转移速度远远超过大荧光蛋白分子的分子旋转,去极化由于FRET可以很容易地区别开来的各向异性,在旋转过程中发生的损失。

FRET使用荧光蛋白的注意事项

在活细胞中用于检查的选择合适的探针FRET是有限的。 合成荧光,理想​​的共振能量转移的调查,在固定的细胞,是难以管理,并在活细胞中的物镜。 同样,量子点可以利用标签膜元件进行检查一个电池的外部的现象,但是,它们也无法渗透膜,因而很少使用如细胞核,线粒体,内质在细胞内隔室网。 目前荧光蛋白基因编码代表高分辨率成像FRET技术在活细胞中,证明了文学的体积每年的基础上,在这个载物台上发表的最佳。 但是,许多与合成的荧光基团的荧光共振能量转移和量子点的测量中遇到的典型的工件时,适用于荧光蛋白是特别严重的。30-40纳米合成材料的发射光谱带宽相反,例如,荧光蛋白的范围从约60纳米到100纳米,往往导致重大重叠时,试图分开供体和受体荧光。 荧光蛋白的广泛的光谱也限制在FRET成像实验中的其他类型的探针,可以一起使用的数量。 此外,荧光蛋白表现出很大的差异的亮度水平。 例如,一个最流行的捐助蛋白质,ECFP,亮度比普通的黄色受体的合作伙伴,EYFP少五倍。

荧光蛋白生色周围是220 +氨基酸多肽缠绕成一个三维圆柱结构约2.4 4.2纳米尺寸(称为β-β-CAN),组成广泛的氢键多肽β-折叠片包围和保护的中心含有的发色基团的α-螺旋结构(见图9)。 枪管的端部封端的半螺旋的肽区域,用于阻挡离子和小分子的条目。 如此紧密地包装内部的蛋白质是氨基酸侧链和水分子,氧,离子或其他侵入管理的小分子,穿过桶的两端扩散的余地不大。 这些有利的结构参数,这是部分负责的弹性的荧光蛋白的耐光性和优异的性能,也有助于减少在荧光共振能量转移效率。 大尺寸的桶,有效地屏蔽相邻的荧光蛋白发色团与肽残基(一个限制的接近距离为2至3毫微米,表示由图9中的红线),导致减少的最大荧光共振能量转移效率约为40理论值的%。 无论如何,FRET成像使用荧光蛋白活细胞的许多好处远远大于成本。

复合光谱带宽重叠大小的问题,与发生荧光蛋白的高度是他们的倾向,低聚。 几乎所有的荧光蛋白的发现至少日期显示的四级结构中,例如通过弱的倾向,本机Aequorea victoria的绿色荧光蛋白及其衍生物的二聚化,在高浓度固定时,在有限的程度。 这种趋势也验证了原生的黄色,橙色和红色荧光蛋白在珊瑚和海葵通过严格的四聚动机。 乙烯齐聚在细胞生物学中的许多应用中,可以是一个显着的问题,特别是在荧光蛋白融合到主机的蛋白质,是在一个特定的亚细胞定位的目标的情况下。 一旦表达,诱导的荧光蛋白的嵌合体部形成二聚体和更高阶低聚物可以产生不正常的本地化,扰乱正常功能,干扰信号级联反应,或限制的融合产物聚集在一个特定的细胞器或细胞质中。 荧光蛋白融合本身参与天然的低聚物形成的贸易伙伴时,这种效果是特别显着。 只有微弱的二聚体(实际上大多数水母维多利亚变种)与蛋白质形成的Fusion产品可能不会出现聚集或不当定位,提供本地化的浓度仍然很低。 然而,弱二聚体的荧光蛋白定位到特定的细胞区室,如质膜,本地化的蛋白质浓度,在某些情况下,成为高到足以使二聚化。 这可以是一个特定的问题时,进行分子间FRET实验,可以产生复杂的数据集,通过二聚化伪影,有时损害。 另一方面,可以是天然存在的弱水母蛋白的二聚化,在某些情况下,用来增加FRET在生物传感器中的信号,否则将具有有限的动态范围。

毒性是一个问题的发生是由于合成荧光基团浓度过高和过度表达或较差聚集本地化荧光蛋白。此外,健康长寿的最佳标记的哺乳动物细胞,在显微镜成像室也可以受到由众多其它有害因素。 其中最重要的是,被荧光标记的细胞反复暴露到从激光器和高强度的电弧放电灯的照明光引起的损伤(光毒性)。 在它们的激发态,荧光分子倾向于与分子氧反应,产生自由基,可以破坏亚细胞成分和危及整个电池。 荧光蛋白,由于这样的事实,他们的荧光基团的保护的多肽包络线内被深埋,一般都不会对细胞的光毒性。 在设计FRET实验,荧光蛋白的组合,显示出可能的最长的激发波长的选择应以尽量减少对细胞的破坏,由短波长的照明,特别是在长期的成像实验。 因此,而不是创造融合的产品和生物传感器与蓝色或青色荧光蛋白(兴奋紫外线和蓝光照明,分别),黄色,橙色和红色区域的频谱发射的变种,会更理想。

研究者应照顾到采用新的荧光蛋白生物传感器和细胞系时,进行必要的控制实验,以确保细胞毒性和光毒性文物不掩盖FRET结果或其他重要的生物现象。 在某些情况下,亲脂性试剂诱导荧光蛋白的毒性,在成像过程中瞬时转染后的细胞系,可能会混淆的有害影响。 低聚珊瑚的荧光蛋白(如上所述)有更大的倾向形成聚集体(结合较差的亚细胞定位)比单体的水母蛋白,但不正确折叠的融合产品可能发生的任何变种。 最近,一种荧光蛋白能够产生活性氧(ROS)照明时绿灯已被报告为特定的蛋白质失活生色团辅助光失活(CALI)的有效药物。适当名为KillerRed的 ,这个基因编码的光敏剂是能杀死细菌和真核细胞后,在显微镜的照明。 EGFP光毒性的以前的研究表明,即使通过发色团是能产生单线态氧的荧光蛋白作为光敏剂的效率相对较低。 然而,长时间的照明表达EGFP的细胞及其变种可以导致生理改变和最终细胞死亡,光毒性的潜在的长期成像实验中一个明确的信号。

荧光蛋白在活细胞实验中,他们相比合成荧光漂白率减少由于扩展成像非常有利的。 虽然是在耐光性方面的荧光蛋白之间的互不相关的变异程度高,大多数变体是有用的短期成像(从1到25个捕获),而一些更耐光的蛋白质,可以采用在时间推移序列24小时或更长的时间跨度期间(聚集数百至数千张图片)。 任何特定的蛋白质的长期稳定性,但是,必须为每一个照明场景(宽视场,激光共聚焦,多光子,扫描场,等等)进行调查,因为在光稳定性的差异通常可观察到由电弧产生照明时,具有相同的蛋白放电灯相对于激光系统。 因此,在耐光性方面,荧光蛋白的选择取决于许多参数,包括照明条件下,表达系统,成像设置的有效性。

FRET潜在的荧光蛋白合作伙伴

在过去的几年中,已开发出多种新的荧光蛋白变种和改进功能,涵盖了200纳米范围内(约450纳米至650纳米)的排放概况,从而填补了许多空白提供潜在有用FRET合作伙伴每一种颜色类。 发展在蓝色(440纳米到470纳米)和青色(470纳米到500纳米)的蛋白质谱地区的最新进展已经取得了一些新的探测器,可能是用于成像和FRET调查。 三蛋白质工程的研究小组报道了改进的蓝色水母荧光蛋白的变种,具有显着更高的亮度和光比EBFP。 名叫石青,SBFP2(坚决增强蓝色FP),EBFP2(见表1),这些蛋白质提供长期成功的活细胞成像中的蓝色光谱区域的第一个真正的希望,都具有重大组合的适用性与EGFP和衍生工具FRET生物传感器。 最聪明和最耐光的新的蓝色记者,EBFP2个,表现出典型的融合和GFP类似的行为,已被证明是一个很好的绿色光谱类蛋白在FRET捐助。 所有的蓝色荧光蛋白可以很容易地在荧光显微镜下,使用标准DAPI过滤集或专有BFP集可从厂家售后成像。

青色的光谱区域中的荧光蛋白已经被广泛地应用于FRET捐赠者当搭配黄色发光蛋白,主要由变体的原始多管水母 ECFP直到蓝绿色的单体记者,被称为mTFP1引进。青色荧光蛋白具有更高的亮度和酸稳定性水母重点计划相比,更为耐光。高的发光量子产率共mTFP1(见表1)提供了一个很好的替代,以青色衍生物mECFP和mCerulean的,黄色或橙色荧光蛋白结合时,作为FRET捐赠。其他调查已经产生有用的蛋白质在青色谱类。改进的青色荧光蛋白,最近被引入其中,CyPet和增强青色变种称为天蓝显示最有希望的候选人融合标签,FRET生物传感器,多色成像。西鲁林是至少2倍的亮度超过ECFP,并已被证明是显着增加对比度,以及信号-to-noise比当它与黄色发射荧光的蛋白质,如金星(见下文),在FRET调查。CFP名为CyPet的变种(的缩写:CY É能源科技转拨荧光P rotein )来自通过一个独特的战略,利用FRET配对青色和黄色荧光激活细胞分选(FACS)来优化。CyPet的一半左右光亮如蔚蓝明亮EGFP和三分之二,但表现相对较差,在37摄氏度左右。然而,CyPet有蓝移窄的荧光发射峰比CFP,这大大增加了其潜在的多色成像。

ECFP的单体的变种到有益的折叠突变的引入导致在生产新的变种,具有增强的亮度,折叠高效,溶解性,荧光共振能量转移的性能。称为超的重点计划(SCFPs),新的记者是显着的亮度比亲本蛋白在细菌中表达时,在哺乳动物细胞中的几乎2倍的更亮。这些高性能探头应该是有用的例行融合标签,并创造新的CFP-YFP FRET生物传感器具有高动态范围。另一种新的单体青色记者,TagCFP,是来自一个从水母水母macrodactyla的 GFP类似的蛋白质。蛋白质的具体的细节是无法在文学,但它是市售哺乳动物克隆载体和融合Evrogen的。TagCFP据报道,明亮的ECFP和西鲁林相比,但类似的耐酸性。另一个青色发光蛋白,Midoriishi青色(简称MiCy)最初被设计为在新的捐助FRET单体Kusabira橙人民圣战者组织见表1)结合产生的生物传感器具有高光谱重叠(福斯特的距离为5.3) 。这种蛋白质具有吸收和发射波长最长的配置文件(分别为472和495纳米)报告青色光谱区域中的任何探头。由MiCy展出的高摩尔消光系数和量子产率,使亮度相同的蛋白质就是蓝。

FRET对属性的选择荧光蛋白
蛋白质对 捐助者的激励
最大 
(纳米)
受体发射
最大 
(纳米)
量子捐助者
产量
接受器摩尔
消光
系数
福斯特距离
(NM)
亮度 
EBFP2 mEGFP 383 507 0.56 57,500 4.8 1:2
ECFP-EYFP 440 527 0.40 83,400 4.9 1:4
蔚蓝金星 440 528 0.62 92,200 5.4 1:2
MiCy人民圣战者组织 472 559 0.90 51,600 5.3 1:2
TFP1 mVenus 492 528 0.85 92,200 5.1 1:1
CyPet YPET 477 530 0.51 104,000 5.1 1:4.5
EGFP-mCherry 507 610 0.60 72,000 5.1 2.5:1
金星mCherry 528 610 0.57 72,000 5.7 3:1
金星tdTomato的 528 581 0.57 138,000 5.9 1:2
金星mPlum的 528 649 0.57 41,000 5.2 13:1
表1

目前最好的选择活细胞成像FRET记者在绿色类(500纳米到525纳米),其中有EGFP父性质类似于GFP衍生翡翠 。 翡翠包含EGFP F64LS65T突变的特色,但该变种还具有四个额外的点突变,提高折叠,在摄氏37度的表达,和亮度。 最近,一个新的绿色光谱区域已经创造超折叠GFP,这是更明亮,更耐酸比EGFP或翡翠,也有类似的耐光性。 因此,超折叠变应与哺乳动物蛋白的融合是一个出色的候选人,并建设FRET生物传感器,尤其是那些展示折叠的问题,标准的绿色荧光蛋白衍生物。 另一个明亮的荧光报道,这可能是一个很好的荧光共振能量转移的候选,被称为AZAMI绿色,并已被隔离从石珊瑚Galaxeidae的 ,在哺乳动物细胞系中的表达过程中表现出快速成熟。 此外,还有两个明亮,单体获得的GFP记者通过现场指导和随机突变库筛选青色蛋白结合已有报道。 来自的Clavularia珊瑚属,mWasabi是一个潜在的替代绿色发光FRET蓝色荧光蛋白由于微不足道的吸光度在400纳米的合作伙伴和更低的蓝色变种往往兴奋。 新绿记者市售(等位基因Biotechnology公司)和两色成像连同长的斯托克斯位移(Stokes shift)的蛋白质(如T-蓝宝石 ),以及与目标蛋白的融合本地化标签应该是特别有用的。 的衍生物TagCFP,名为TagGFP,是一个充满生机和单体绿色的变种,具有吸收最大发射482纳米和505纳米。 ,这是TagGFP只是稍微比EGFP亮,可作为克隆载体和融合从Evrogen标签,但一直没有得到彻底的特点文献报道。

黄色荧光蛋白(525纳米到555纳米)是最多才多艺的基因编码的探头,并应提供考生作为供体和受体双方FRET配对。 该变种水晶金星被称为是目前最有用的蛋白质在这个光谱类(见表1),但也不是市售的。 Invitrogen公司提供的另一个变种,命名诞生后黄玉 ,是已经融合标签定位,细胞内信号的服务,和FRET调查。 的Evrogen“标签”商用系列的本地化记者蛋白,TagYFP的新成员是一个单体水母( 大型多管水母 )衍生物比EYFP略低的明亮,但为了更耐光的幅度。 其合作伙伴相似,TagYFP(发光峰值在524纳米)的特点在文献中,但可以购买哺乳动物克隆载体或融合标签。

在相同的荧光激活细胞分选的调查导致的代CyPet的(上面讨论的),进化优化的互补FRET受体,称为YPET,也被得到。 命名后,其熟练FRET(Y F P电子能源科技转移 ),YPET尚未开发并演示了合理的耐光性是亮黄色的变种。 抵抗酸性的环境所提供YPET是优于金星和其他YFP的衍生​​工具,这将增强系统的效用,这个探头针对酸性细胞生物传感器组合。 然而,虽然CyPet YPet优化组合应该是的首选首发点在开发新的FRET生物传感器,那里仍然是一个严重的疑问的起源YPET增加的性能,这是可能由于简单地增强二聚,其共同的进化合作伙伴,CyPet。 同样的,本地化的实验中,双分子互补分析和其他应用程序的融合标签为中CyPet YPET的适宜性尚未建立起来。 存在这两种蛋白质在溶液中为弱的二聚体,但据推测,可以被转换成真实使用A206K工作的突变,以及与其他多管水母的变种(虽然这显然破坏了它们的优点在FRET)的单体。

橙色荧光蛋白,所有这些都被隔离从珊瑚礁物种,有可能是有用的在各种FRET成像场景。 也许最多才多艺的这些是从蘑菇珊瑚Fungia黄果厚壳桂 (称为日本为Kusabira艾希 )最初是作为一个四聚体,蛋白质单体Kusabira橙色。(简称人民圣战者组织)Kusabira橙单体版本创建引入超过20突变,通过现场指导和随机突变。的单体(市售从MBL国际)的四聚体具有相似的光谱特性,并具有类似EGFP的亮度值,但稍微敏感的酸性环境中,比它的父。然而,本报记者的耐光性,是名列前茅的任何蛋白质在所有的光谱类,使人民圣战者组织长期成像实验的最佳选择。此外,发射光谱轮廓充分分离从青色荧光蛋白的荧光共振能量转移效率增加人民圣战组织结合在生物传感器中,探针是有用的在多色调查与青色,绿色,黄色和红色的探针的组合。

寻找一个理想的红色发光荧光蛋白长期以来一直使用活细胞和整体动物成像的目标FRET生物传感器和融合,主要是由于在这个光谱区域的探头在多色成像实验的要求,以及事实较长的激发波长产生更少的光毒性和可以探测到生物组织更深。 至目前为止,已广泛的潜在有用的红色探头(排放量在590纳米至650纳米),其中许多仍然受到一定程度的强制性的四级结构赋予原籍物种。 与水母蛋白不同的是,大多数的本地和基因工程的珊瑚礁蛋白变体的成熟非常有效地在37度。 广泛的诱变研究努力,包括新近引入的方法,已成功地应用在搜索中为黄色,橙色,红色,和远红荧光蛋白变异,从而进一步降低的倾向,这些潜在的有效的生物探针自交联,同时推动排放最大值向更长的波长。 结果已改进的单体蛋白质,具有消光系数增加,量子产率,和光,虽然没有一个单一的变种尚未优化的所有标准。

红色mFruit蛋白,MAPPLEmCherry mStrawberry的发射峰位于592,610和596纳米,分别),有亮度级别范围从50%到110%的绿色荧光蛋白,但马普尔和mCherry得多比mStrawberry耐光和的最佳探头的选择长期成像实验,以取代mRFP1。进一步延长的mFruit蛋白质谱类通过迭代产生了两个新的荧光蛋白突变体与最大发射波长625纳米和649纳米,相当于第一个真正的远红遗传工程探头。此语言对的最有可能有用的探针被评为mPlum的,它具有相当有限的亮度值(10%的EGFP),但优良的耐光性。这种单体的探针的组合应该是有用的,与变体排放,青色,绿色,黄色和橙色区域的多色成像实验中,作为生物传感器的荧光共振能量转移与绿色和黄色的蛋白质,如绿宝石和黄晶(参见图10)的合作伙伴。礁珊瑚生物已分离出一些额外的红色荧光蛋白呈现不同程度的承诺。应用程序的位点特异性和随机诱变,然后通过筛选的突变显示出远红荧光的TurboRFP变种,导致一种二聚体蛋白质名为Katushka(发射最大值为635纳米)。尽管只有三分之二光亮如绿色荧光蛋白,Katushka展品涵盖650至800纳米,一个地区是重要的深层组织成像光谱窗口中的任何荧光蛋白的亮度最高水平。介绍到TagRFP的的四个主要Katushka突变产生的单体,远红蛋白名为mKate,具有相似的光谱特征。耐光mKate报道是例外和蛋白质mCherry,这使得它一个很好的候选人本地化和远红光部分频谱FRET实验显示亮度类似。

尽管扩大到橙色,红色,和远红外光谱区的荧光色调色板的显着的进步,青色和黄色的僧帽衍生物仍是最有用的配对场景开发有用的生物传感器。这场突如其来的差异发生,因为大部分的橙色和红色珊瑚源性蛋白表现出一个比较宽泛的吸收光谱曲线有一个长期的激励尾部延伸到紫色和青色区域,从而产生直接受激励。可能开始发挥作用的另一个因素是相对成熟率荧光蛋白融合伙伴。在大多数情况下,从多管水母蛋白衍生的变种的成熟速度远远超过造礁珊瑚得到的,所以它是可能的,不成熟的受体,有助于所表现出许多的珊瑚来源的蛋白质的敏化发射差。此外,广泛的吸附光谱的橙色和红色的蛋白,结合的单体版本的量子产率减少,有可能使它们很难用于FRET。FRET荧光蛋白未来的成功将重点放在实验设计,除其他因素外,配对的蛋白质相匹配的成熟率。

结论

虽然提供了巨大的潜力,在活细胞系统,尚未揭示分子动力学FRET实验的基础上无处不在的荧光蛋白家族是不是有一个完美的FRET对。 CFP和YFP的优化版本仍然为一般用途,提供最有效的对更好的组合,虽然可能笼罩在地平线上。 同样地,也没有完美的技术,测量荧光共振能量转移(FRET),上述所有的方法虽然有优势,取决于特定的实验调查的情况下,可以利用。 更优化的荧光蛋白成为包括鲜红的变种,可能是适当的受体为GFP或YFP捐助者的,FRET使用荧光蛋白在活细胞中蛋白质 - 蛋白质相互作用的调查变得更加有用。 如所讨论的,宽的吸收光谱的红色荧光蛋白的当前调色板,除了单体版本的量子产率较低,这些候选者难以采用在荧光共振能量转移。 然而,快速的步伐荧光蛋白改进借给乐观,这种蛋白质会在不久的将来,将有助于进一步改变这种新的方法来阐明细胞内生化机制。