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奥林巴斯显微镜成像,什么是反卷积?

2013-11-15  发布者:admin 

 反卷积进行大量计算的图像处理技术,正被越来越多地利用改善在显微镜拍摄的数字图像的对比度和分辨率。 根据一套旨在消除或扭转引起的物镜的孔径有限的显微镜图像中存在的模糊的方法,这些方法的基础是。

几乎任何数字荧光显微镜获得的图像可以被反卷积,以及一些新的应用程序正在开发,应用反卷积技术透射光下的各种采集图像对比度增强策略。 其中最合适的改进的主体,通过反卷积是从一系列的光学部分构成的三维蒙太奇。

围绕收购的串行光学部分的卷积分析的基本概念示意图如图1。 的检体是一种理想化的单元格从一系列的光学部分(右图)是沿z轴的一个广义的光学显微镜记录。 对于每个试样中的焦平面,由检测器记录,相应的图像平面中,并随后被存储在一个数据分析计算机。 卷积分析,整个系列的光学部分进行分析,以建立一个三维的蒙太奇。

作为一种技术,反卷积常常建议共聚焦显微镜作为一种很好的替代。 这不是严格正确的,因为在共聚焦显微镜中使用的针孔孔径获得的图象也可以分析通过反卷积技术。 然而,大多数的反卷积实验文献报道的适用于记录,可在一个标准的宽视场荧光显微镜图像。 现代卷积算法取得可比分辨率的图像共聚焦显微镜。 事实上,共聚焦显微镜和广角卷积显微镜都工作通过去除图像模糊,但这样做相反的机制。 共聚焦显微镜防止外的焦点模糊,从被检测的目标和检测器,通过它,可以通过只在聚焦光线之间放置一个针孔孔径。 与此相反,宽视场显微镜允许模糊的光线到达检测器(或图像传感器),但反卷积技术,然后施加到所产生的图像,以减去模糊的光,或将其重新分配到源。 共聚焦显微镜特别适合研究厚的标本,如胚胎或组织,而广角卷积显微镜已被证明是一个强大的工具,需要非常低的光线水平,如活细胞荧光标记的蛋白质和核酸的成像标本。

图像退化的来源

来源可分为4个独立的现象:噪声,散射,眩光,模糊的图像退化。 图2给出的视觉冲击每个这些相同的图像的例子。 卷积方法的主要任务是从图像中删除焦模糊。 反卷积算法去除噪声,但其整体性能,这是一个相对简单的方面。

噪声可以被描述为一个准随机排列紊乱图像中的细节,(在其最严重的形式)时遇到的外观类似白噪声盐和胡椒噪声 ,什么被认为是在广播电视接收不良(图2(a))。 这种类型的噪音被称为“准随机的”,因为可以预测的统计分布是已知的源,如果力学。 在数字显微镜,噪声的主要来源是信号本身或数字成像系统(通常被称为光子散粒噪声 )。 两个噪声源的机制是可以理解的,因此,噪声的统计分布是已知的。 信号相关的噪声可以由泊松分布特征,而从成像系统所产生的噪音往往遵循高斯分布。 由于数字法师常见的噪声源和分布是这么好理解,它可以很容易地通过应用适当的图像过滤器,这通常是大多数卷积软件包包括一个可选的“前处理”例行去除。

散点图通常是指作为一个随机扰动引起的光通过于异构折射率区域的一个标本。 分散的净效应是真正的随机图像细节紊乱,表现在图2(b)。 虽然没有完全令人满意的方法已被开发来预测散布在一个给定的试样,它已被证明的散射程度是高度依赖于试样的厚度和材料的试样的光学特性的和周围的嵌入。 散射增加与试样的厚度和内部组件内的试样的折射率的非均质性。

类似的分散,眩光是一个随机的光的干扰,但发生在光学系(透镜,滤光片,棱镜,透镜安装座等),而不是在试样的显​​微镜。 眩光,在现代的显微镜的水平已被最小化,由镜头和过滤器与抗反射涂层的就业机会,透镜形成技术,光学水泥,玻璃配方的细化。 图2(c)示出了不受控制的眩光的效果。

所描述的非随机传播的光,通过成像系统的光学系(图2(d))发生模糊。 源模糊的最显着的是衍射,并且被认为是只限于由模糊的图像的分辨率衍射极限的 。 这表示任何成像系统的特性的限制,并在评估的光学系统的分辨率极限是决定性因素。 光学理论提出了复杂的模型,可应用于现代高速计算机的协助下,在光学显微镜拍摄的数字图像模糊。 这是反卷积的基础。 由于其反卷积的根本的重要性,模糊理论模型,将讨论在本节的其他部分要详细得多。 然而,应该强调的是,所有的成像系统产生的模糊独立于其他形式的图像劣化引起的试件或相应的仪器电子。 从其他类型的退化,使反卷积技术模糊消除的可能性,正是这种独立性的光模糊。

光与物质的相互作用是主要的散射,眩光,模糊的物理起源。 然而,每种材料的组合物和在给定的材料(无论是玻璃,水,或蛋白质)的分子排列赋予它自己的特殊的光学性质。 对于反卷积的目的,有什么区别的位置,他们发生的可能性,产生这些现象的数学模型,分散,防眩光,和模糊。 由于分散是一个本地化的,不规则的现象,发生在试样,它已被证明难以模型。 与此相反,由于模糊的显微镜光学系统(主要的目标)是一个函数,它可以建模与相对简单。 这种模式使得它可以扭转的模糊数学运算,卷积采用这种模式来扭转或消除模糊。

点扩散函数

模糊模型是根据光学理论中已逐渐形成一个三维的点扩散函数(PSF)的概念上。 这一概念是至关重要反卷积,并应清楚地了解,为了避免成像伪影。 点扩散函数是基于一个无限小的点源的光,在检体(对象)的空间。 的显微镜成像系统,因为只收集由这点发射的光的一小部分,它不能将光聚焦成一个完美的三维图像的点。 相反,出现点扩大,并蔓延到一个三维的衍射图案。 因此,点扩展函数的正式定义由一个理想的点光源产生的三维衍射图案。

点扩散函数,这取决于所使用的摄像模式(宽视场,激光共聚焦,透过光),具有不同的和独特的形状和轮廓。 在宽视场荧光显微镜,点扩散函数的形状类似于,加宽环喇叭形的光所包围的长方形的“足球”。 在三维空间中的点扩展函数来描述,它是常见的应​​用的坐标系的x,y和z三个轴()×和y是平行的试样的焦平面和z是平行于光轴显微镜。 在这种情况下,显示为在xy平面上的一组同心环的点扩展函数,并类似于沙漏的xz和yz平面中(如在图3中示出)。 通过中心的广角点扩散函数的XY片揭示了一组同心圆环:所谓的艾里斑 ,通常引用文本中的经典光学显微镜。

在图3中示出球面像差的不同程度的点扩散函数的两个XZ突起。 的光轴平行于垂直轴的图像。 在左边显示的点扩散函数最小的球面像差,而在右边显示一个显着程度的​​畸变。 请注意,轴向不对称,加宽的中央节点,在右侧图像沿着光轴导致退化的轴向分辨率和模糊信号。 从理论上讲,点扩展函数的大小是无限的,而远离焦点的平面的光强度的总和等于焦点处的总强度。 然而,光强下降迅速,并最终成为区分噪音。 在一个unaberrated的点扩散函数的记录,可有高数值孔径(1.40)油浸物镜,占用0.2平方微米的焦点平面的光传播区域超过90倍,在1微米以上和以下的集中。 用来记录这些点扩散函数的图像的检体是一个直径为0.1微米的荧光珠安装在甘油(折射率等于1.47),与具有图中所示的折射率的浸没油。

的点扩展函数的一个重要的考虑因素是如何影响在显微镜图像形成。 的图像形成处理的图像为基本单元的点扩展函数的理论模型。 换句话说,点扩散函数是砖的房子的图像。 最好的图像可以永远是一个组装点扩展函数,并增加放大倍率将不会改变这个事实。 作为一个著名的理论光学教科书(Born和狼: 光学原理 )解释说,“这是不可能的目镜,增加了电源的主图像的每个元素,衬托出细节没有出现在主图像是一个小的衍射图案,和实际图象,通过目镜观察,只有这些图案的放大图像的合唱“。

作为一个例子,考虑人口的微小荧光珠盖玻片显微镜载玻片之间夹着。 在此试样中揭示了一个在焦图像云点,其中每一个,检查时,在高分辨率下,实际上是一个微小的一套环(实际上,艾里斑所包围的磁盘,请参阅图4(a)) 。 如果此焦点若干取出试样,将出现更大的一组同心环,其中每个点是在聚焦的图像(图4(b))。 当在此试样中的三维图像被收集,然后一个完整的点扩散函数的记录,可在每个胎圈。 描述会发生什么情况,每个点光源后,通过成像系统的点扩散函数。

刚刚描述的模糊处理,数学建模为一个卷积。 卷积运算的描述试样中的每一个点的点扩散函数的应用从该对象中的每个点发出的光,以产生最终的图像的点扩展函数的卷积。 不幸的是,此卷积导致点中的试样,成为模糊图像中的区域。 试样中的每个点的荧光图像中的每一个点的亮度由卷积运算是线性相关。 因为点扩散函数是三维的,模糊的点扩展函数是固有三维的现象。 焦平面的图像从任何包含模糊的光点位于该平面混合在一起,模糊的光点,对原产于其他焦平面。

可以概括的情况下,形成图像的点扩展函数的卷积中的试样的想法。 解卷积逆转这一进程,并尝试重新构建试样从一个模糊的图像。

畸变的点扩散函数

定义的点扩展函数可以利用衍射的数学模型理论上或经验上的荧光珠(参见图3)获取的三维图像。 一个理论的点扩散函数一般具有轴向和径向对称。 实际上,点扩散函数是在xy平面的上方和下方(轴对称)和绕z轴(径向对称)旋转对称。 一个经验性的点扩散函数可以显着偏离完美对称(如图3)。 这种偏差,通常被称为像差 ,成像系统的光学火车,尤其是目标的任何组件中所产生的凹凸或偏移量,但也可发生与其它组分如镜,分束器,管透镜,过滤器,隔膜,和光圈。 的光学元件和显微镜对准更好的质量就越高,越接近的经验点扩散函数其理想的对称形状。 两个共聚焦和去卷积显微镜依赖于尽可能接近理想的情况下的点扩展函数。

众所周知,任何经验丰富的专业显微镜,光学显微镜,遇到的最常见的像差是球面像差。 这种像差的表现形式为轴向不对称的点扩散函数的形状,大小,并相应增加,特别是沿z轴(图3)。 其结果是一个相当大的损失,分辨率和信号强度。 在实践中,最常见的原点的球面像差是物镜前透镜的液浸介质和安装介质,在其中沐浴试样的折射率之间的不匹配。 一个巨大的重点应放在尽量减少这种无所不在的像差的重要性。 卷积虽然可以部分恢复丢失的分辨率,再多的图像处理,可以恢复丢失的信号。