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尼康显微镜,什么是共振扫描激光共聚焦显微镜?

2013-11-08  发布者:admin 

激光扫描共聚焦显微镜已被证明是对固定和染色的细胞,组织中一个有用的工具,甚至整个生物体的光来源于区域从焦平面将消除高对比度。荧光蛋白在活细胞成像,然而越来越多的应用,现在需要显微镜的成像速度为毫秒级解开在许多生物过程中发生的复杂的动力学。不幸的是,传统的激光扫描共聚焦显微镜由电流计镜有限的采集速度,这是一个线性锯齿控制信号以每像素几微秒的速度驱动。这意味着扫描速率范围从500毫秒到2秒,取决于图像尺寸。为了获得更快的时间尺度的图像,激光扫描共聚焦显微镜必须重新设计,将先进的扫描方案,使光束能够光栅扫描整个标本在更高的速度。为了克服共焦显微镜本身速度慢,一些制造商已经推出了配备共振扫描镜能够采集的图像在30帧每秒或更高的仪器。

尼康A1R激光共聚焦扫描单元

如图1所示是一个尼康A1R激光共聚焦显微镜扫描单元配备了许多先进的功能,包括一个基于高分辨率检流计扫描仪(4096 x 4096像素;非谐振)和高速共振扫描仪,连续可变的六角形小孔,光谱成像能力,几个光输出端口,并对不同波长的多个激光对一个输入端口。一个额外的自由空间光束引入口包括在a1r-mp(多光子模型)的超快激光多光子成像的必要。共振扫描系统能够在速度从每秒30帧的高速图像采集(512 x 512像素)以每秒420帧(152×32像素)而非共振扫描仪功能的最大扫描每秒4帧的速率在512 x 512像素。聚焦变焦与共振扫描仪(从1.5倍到8倍)是由一个单独的Ronchi光栅模式每一步的要求限制(在下面讨论),而非共振扫描仪具有一个1X无级变焦范围1000倍。也许A1R扫描装置最先进的功能是执行混合扫描使用能力在串联两扫描仪在这种模式下,非共振扫描仪可用于激活或漂白试样的选定区域进行共振扫描仪后续高速成像实时观察的光活化物种的恢复或扩散。该仪器的真正力量在于多功能,使固定标本和实时扫描与可选的光催化活细胞成像的荧光蛋白的荧光笔,光学高分辨率共焦成像,荧光和关。在有限的预算下的核心设施,这种多功能性使在一个单一的仪器更广泛的用户基础的住宿。

虽然比较复杂的谐振振镜已商用超过三年,在激光扫描共聚焦显微镜的应用还没有广泛实用的经验。在研究人员希望图像的快速钙波的活细胞,早在上世纪90年代初的实验室制造的第一点扫描仪器。经过多次研究报告描述了成功的实验,其他研究人员开始开发更先进的仪器,包括多光子共聚焦含有共振扫描仪。共振扫描显微镜结构复杂的高速共振扫描仪的余弦运动,产生像素时钟问题。然而在过去的十年中,在,几个可行的解决方案(包括硬件和软件)的出现,使仪器执行正常的聚焦功能,如平移和缩放,视频传输速率。这些工具应该会增加在未来几年普及无疑将能够与旋转盘和线扫描仪在速度和成像效率。

在传统的激光扫描共聚焦显微镜,激发光束扩展和向双光栅扫描光束聚焦在试样振荡光学扫描振镜。荧光发射扫描通过相同的镜组,通过共轭(聚焦)针孔孔径去除聚焦光进入光电倍增管检测器之前。在扫描过程中,扫描过程中,扫描振镜的一个沿快,水平轴的标本,而其他镜扫描和跟踪速度较慢的垂直轴。继续扫描直到整个二维(XY)是将采集到的图像,这一过程可以重复产生随时间变化的一系列图像。另外,重点可以沿着显微镜轴向平面获得三维(XY,和Z)光学切片图像栈。扫描速度由快轴镜机械规格有限,通常的扫描速度大约4每像素5微秒。因此,对于一个512 x 512像素的图像在一个单一的二收集,扫描点从每个像素约4微秒。在一个标准的视频率驱动振镜扫描器(每秒30帧)来收集类似大小的图像是很困难的,如果不是不可能的,因为镜子很快会被加速,在恒定的速度而在现场扫描,然后迅速减速和旅行的方向逆转,为每个扫描线重复这个循环。尝试这样一种行动在30帧每秒会创造条件,可能导致过热和过早失效。作为一个结果,慢的扫描速度的限制需要非共振线性振镜共焦显微镜观察在非常快的时间发生的事件的能力。

快速样品扫描方法

基于激光扫描共焦显微镜镜,扫描速度最快的方案包括使用线扫描获得一个像素行沿一条轴线与快轴镜标本同时将慢轴镜扫描选择合适的位置(图2)。在现代聚焦的工具,扫描线不受约束的X轴,但可以面向任何方向包括所有感兴趣的标本特征。结果往往是绘制一系列扫描偏移使荧光强度随时间变化的可视化。这种方法可以产生高速扫描,但其检测事件在样本的其他地区可能出现的能力有限。另一个陷阱快速扫描线是驻留时间,每个像素一般不足以激发所有的检测到的荧光,尤其是穷人的目标数量的标本。此外,使用共聚焦显微镜的光电倍增管有一个量子效率范围从约15至百分之40,所以扫描速度的增加,检测到的光子的数量可能在每个像素的一些标本下降到一定水平,由光电倍增管的本底噪声遮蔽。

图2给出了线扫描共聚焦显微镜在活细胞中的例子。如图2所示的序列(一)捕捉XT扫描系列钙火花的合成试剂,诱导心肌细胞Fura红。注意高荧光强度在序列中的连续时间点的几个地点发生的地区。图2(b),钙波的图像说明穿越细胞质中使用荧光蛋白卡默莱昂传感器探头在一个孤立的HeLa细胞(含mcerulean和mvenus)。获取高空间分辨率的图像(如512 x 512像素)需要快速XY扫描必须用显微镜可以在毫秒整个扫场进行,通过在下面的段落中描述的仪器为例。使用快速线与线性振镜配备的共聚焦显微镜扫描,钙波可以在一个维度记录作为时间的函数的说明在图下面的图片集。图2(c),扫描进行了沿白色虚线在图2(b)捕捉到一个单一的波的空间维度,通过细胞在不到一秒。

线扫描共聚焦显微镜

快速图像获取的另一个策略是提高像素停留时间没有通过塑造照明光束成一条线,同时激发荧光团在一轴降低帧速率,而扫描试样沿另一轴以中等速度达到镜面视频的帧速率(如图3示意图(c))。这种扫描的概念已经在商业聚焦仪器,消除快轴摆动振镜和捕捉荧光发射采用线性CCD阵列实现(线阵CCD)。因此,线扫描共聚焦显微镜可以实现视频的帧速率激励线通过聚焦狭缝形照明和采集荧光发射。线扫描共聚焦仪器的实际限制是不对称的决议,由于在一个轴的分辨率是通过共聚焦扫描而在其他轴的分辨率是通过传统的宽视场光学有限公司提供而获得的。此外,它在技术上是很难产生一个窄的衍射极限的线聚焦的光加上适当大小的检测狭缝分辨率不低于理论上的最优。

商业狭缝共焦显微镜的解决方案依赖于使用不同宽度的狭缝孔(不同程度的共焦),沉积在光学玻璃的不透明材料制成的薄膜。扫描照明由柱面透镜元收敛在由物镜的数值孔径确定一个角的焦平面形成一个光之楔。狭缝扫描仪器能够在决议,只有在轴向方向上的图像的点扩散函数的一个轻微的降解受阻的高速图像采集,如上面提到的。另一方面,狭缝扫描仪目前依靠线性CCD探测器的像素具有相同的量子效率和噪声特性的科学级CCD。这些探测器远比电子倍增CCD不敏感(EMCCD技术)因此需要显着更高的能量来实现类似的信噪比。其结果是快速的光漂白和光毒性的活细胞成像的高水平,这限制了扫描,可以在文物开始晦涩的实验结果获得的数。线扫描共聚焦显微镜将采用先进的互补金属氧化物半导体的引入大大提高了(CMOS)或EMCCD型线阵电荷耦合器件图像传感器。

高速共焦成像更先进的方法包括扫描标本多的平行光束通过一个旋转的尼普科夫圆盘或者通过扫描阵列在试样捕获所有的图像点平行形成。在后者的仪器设计的关键是创建一个网格模式,能够扫描整个场在一个单一的扫描运动,但维持照明和探测针孔在足够大的距离,防止针孔荧光发射之间的串扰。尼康”的生命可以“扫场共聚焦显微镜是一种多点阵列扫描仪提供了可选的网格具有不同的针孔大小的增加细化的一个很好的例子。该系统还可以选择使用一组具有不同宽度的狭缝提供最大限度的激发能量和发射效率在降低成本的共焦(图3(b))。在操作中,32个照明点网格席卷标本现场使用快速扫描振镜和压电元件的组合来控制反射镜和在视频速率捕获图像。狭缝扫描模式,扫描场共聚焦显微镜能够在速度接近每秒1200帧图像采集。该仪器还可利用声光可调谐滤波器(多色荧光成像声光可调谐滤波器)激光控制,专业多带双色镜,和匹配滤波器组。此外,显微镜可以耦合到高性能,使用尽可能低的激发能量的活标本最高效低噪音EMCCD相机成像系统,从而最大限度地减少光漂白和光毒性。

高速激光共聚焦显微镜扫描机制

通过旋转盘共聚焦显微镜快速扫描活体标本提供一个很好的替代尼普科夫圆盘。这些工具都是基于一个圆形,旋转盘,包含一个或多个针孔阵列排列的阿基米德螺旋设计的单盘旋转时扫描整个试样平面(或少用一些设计)。旋转磁盘的显微镜也可以有缝隙而不是在减少轴向分辨率成本针孔。先进的旋转盘系统功能的双磁盘包含微透镜元件放置在磁盘阵列上的针孔,从而起到焦点事件激发光对下盘相应的针孔显著增加光通量(图3(a))。这类工具通常被称为线,或阵列扫描仪因为他们扫描照明的点或线场每个图像的采集过程中无数次的数组。旋转盘显微镜最高的成像速度接近每秒2000帧,但仪器往往阻碍了达到如此高的利率由于磁盘的高速旋转必要通过每个照明点在试样多次相同的部分。长期的整合所需时间被用来捕捉图像的数码相机(至少在全或半帧大小)也限制了采集速度。旋转盘显微镜通常使用激光照明,发光二极管,或电弧放电灯,但执行优化时配备的全固态激光器的波长匹配合适的荧光激发峰。活细胞成像的应用,旋转盘或其他阵列扫描共聚焦显微镜通常是乐器的选择,尤其是在快速的细胞动力学研究。平行光束减少光漂白和光毒性,使较长的成像。

额外的技术能够在视频速率扫描标本(虽然没有市售)包括仪器配备声光光束偏转器(定位;图3(d)),数字可编程阵列微镜(DMDS;图4(b)),或旋转多边形镜(图4(a))。中心利用超声波产生的压力区,可以在晶体衍射或偏转一个角度入射激光的光与声的频率变化。这些固态设备受益于无机械运动部件和可忽略的惯性,使高度精确的锯齿栅格生成扫描几乎瞬间反激。此外,AOD扫描仪能够产生用户定义的变形产生兴趣的扫描区域。光学显微镜的缺点是基于这些器件的色散特性,它只适合单色光控制通道。因此,宽带荧光发射不能退扫描和狭缝通常用于激光共聚焦检测,从而减少轴向分辨率降低荧光从外面焦平面区域的排斥。此外,柱面透镜是必要的激光光束形状和晶体矩形孔径匹配。虽然这些问题已经解决的几个实验仪器的设计,使用AOD扫描仪的概念尚未流行用显微镜制造商。

可编程阵列显微镜(PAMS)特征的数字微镜器件作为图像平面中的空间光调制器产生广泛的用户自定义的光照和检测方案。这些工具可能杰出的多样化选择光源可在反射,传输,和光学切片和多重荧光模式,利益选择能力,同时区。PAM的仪器设计的核心是DMD单元,它由微型(约16微米)平方镜元素可以单独设置旋转“对”或“关闭”相对于入射和反射光(如图4(b))。DMD可重复模式的复用提高光通量的使用,和他们比振镜应用于点扫描共聚焦显微镜明显快。原则上,PAM工具可以生成图像和光学部分,可以通过目镜观察,荧光发射是对科学级CCD相机系统或电子倍增。利用DMD器件的主要优点是,他们可以通过软件控制,没有移动部件(除微型反射镜),并提供能够使用两个不同的镜子的位置直接光通过分光路。在这方面,PAM仪器提供更大的灵活性比旋转磁盘和狭缝扫描显微镜。然而,DMD显微镜受到严重限制的照明方。照明光束必须扩大到包括DMD的整个表面,减少来自任何特定的镜光供给量,从而使激光光源具有挑战性的应用。

共振扫描时序问题

用旋转多面镜的光束偏转系统是一项成熟的技术,利用光简单,非色散曲面创建输出光束具有基本的锯齿栅格类似于传统的视频扫描。多边形的镜子(图4(a))已被用于在过去几次商业和实验聚焦的工具,但目前没有被显微镜制造商实施。在实践中,多边形镜的使用需要更复杂的光学元件的设计,和单位是容易相对于旋转轴在反射率和角微乎其微的变化。被称为锥体的错误,这些角差异产生光束的波动必须的光学矫正。由于多边形面数必须在光栅扫描线总人数的比例,专业镜常常必须为了建立聚焦的工具。多边形有15,25,或75方都必须在63000,37800转,或12600转每分钟,分别,为了生成视频速率在每秒15750线扫描。这些高的速度,需要专门的轴承,更复杂的仪器设计。由于这些原因,基于多边形镜共焦显微镜是罕见的,一般归属于特殊利益项目。

旋转盘,扫场,和线扫描共聚焦系统都受到光学切片性能妥协相比,点扫描共聚焦仪器。表现较差是由于这样的事实,从试样的偏远地区光漏出到探测器通过空间的串扰,并越来越严重的高荧光厚组织成像时。此外,一些市售的旋转的磁盘工具采用固定针孔大小不可调的用户,因此这些显微镜是限于只有特定的目标放大的兼容。情况稍好的市售基于狭缝圆盘显微镜匹配目标分辨率和放大提供可互换的磁盘。然而,大多数在以上段落牺牲最佳衍射限制的照明和检测速度的描述工具,并不能产生商业上的激光点扫描共聚焦显微镜平移或缩放功能可用。然而,这些显微镜能够产生薄优良的图像,在视频速率或更好的贴壁细胞培养。

共振扫描仪的基本知识

回顾传统的单点激光扫描共聚焦显微镜,扩大激光束扫描在试样用电流计镜不断改变的光通过物镜后焦平面的夹角。的情况下被放置在一个90度角的对方这样的扫描镜与自己的表面以及在远心面显微镜的光轴的旋转轴(共轭的目的后焦平面)。来回的振镜旋转反射镜将聚焦激光光斑在试样在栅格模式穿越田野的横向尺寸。一边一个镜面旋转(X)产生水平扫描线,而其他的镜子上下旋转(Y)产生垂直偏转。现代共焦仪器配备先进的扫描系统,给予高度的灵活性,对试样的形状和尺寸,扫描区域。扫描角度可以通过重新分配的一部分旋转X-振信号的Y检流计,反之亦然。同样,共焦变焦功能可以通过改变该电流计扫描角范围内实现。扫描一个专门的用户定义的区域的标本为实验能力需要激活或漂白选定区域不具有矩形几何特别有用。

高性能的伺服控制,闭环振镜应用于激光扫描显微镜是一个工程奇迹,为了准确地旋转附加镜和精密的光束位置在一个寿命超过几个亿的周期。振镜是在一个类似于电动机采用转子和定子驱动定位运动构造执行器,包括整个装配和响应根据惯性比它的扭矩。根据振镜的设计,无论是转子或定子永磁与妹妹组成的线圈相互作用,产生驱动力,转子。机械站是用来限制转子运动的有限转动弧。在大多数的共聚焦显微镜,移动磁铁驱动器是首选由于其紧凑的尺寸,定位精度高,刚度和响应速度快的优势。电流计镜表面很薄的银或铝沉积在硅,石英片,或铍衬底。检流计反射镜的最重要的要求之一是,他们是重量轻,建立刚性材料,具有孔径大小不限制光线进入物镜孔径,并具有高度抛光的表面,平的波长的一小部分。镜子必须在较宽的波长范围是同样的反射(约350至700纳米)和反射面应集中在扫描单元的旋转轴。

谐振扫描镜运动

如上所述,伺服控制线性振镜在扫描速度由于惯性作用有限,因此,只能光栅在图像采集速率,通常范围从1到5帧每秒的帧尺寸的试样在标准扫描。为了实现视频率,用于水平线扫描速度较慢的线性振镜可以更快的共振扫描振镜的振动频率固定,是一个音叉旋转等效替换。在共振情况下(也被称为反旋转扫描仪CRS),能量储存在扭簧或杆组件用于振荡的镜子在正弦曲线的方式。这些设备的周期在4到8赫兹的共振频率,通常接近国家电视系统委员会(比例分数NTSC制式)视频标准的15750线/秒水平频率。当在7900赫兹运行共振扫描仪是用来获得512线,逐行扫描在双向取向(奇数行从左到右,甚至线右到左),结果是大约125微秒和图像捕获率在每秒30帧的顺序单独一行期。

图5给出了几种共振电流计设计具有不同的镜像(图5(a)),随着一个图,说明了镜子的振荡运动(图5(b))。高速(7.9千赫)谐振振镜可以旋转约12度,在每个方向绕中心轴。入射激光的激发光反射在镜子般的表面通过物理反射镜位置确定一个角(共覆盖24度的范围内)。如果镜像运动在振荡周期的相位和速度方面考虑,从一个阶段过渡的镜子(速度等于零)通过0(最大速度)为(速度等于零)。因此,将在下面更详细的描述,速度是最小的(或零)在镜达到最大角度的振荡周期的结束,和最大的周期在镜角为零的中心。

谐振振镜扫描仪的主要优点之一是,他们逐渐加速和减速,因为他们通过振荡周期的进展,从而避免复位信号的必要性在每次开始扫描线。为了实现平滑的运动,先进的扫描仪都配备了两个振荡质量平衡扭杆是机械调谐在建立平等的相反相共鸣,但方向相反的扭矩,取消住房安装位置。其结果是一个反应少机械振荡器,消除抖动和外部振动。高速共振扫描仪镜孔径大小是直径约5毫米,并用银或铝涂层的光学级铍制成,具有优良的比刚度。这些情况下的扫描角度范围从15到26度,峰值。在振荡,如图5(b)和图6,一个谐振振镜的角速度在余弦变换方式,在零度角达到最大速度(在扫描区域的中心)在90度和最小速度(在场地的边缘),在那里扫描方向的变化。当生成图像使用共振扫描仪,这些非线性的变化出现在像素时钟上的一个重大问题。

谐振扫描时序问题

由于共振扫描仪速度的非线性,荧光试样在中部地区最高的速度扫描的速度逐渐减小,当扫描到边缘。因此,当图像数据流来源于共振扫描仪和图像采集卡的主频率获得恒定的像素(假设光束扫描线),图像出现在边缘延伸。此外,激光激发强度分布不均匀(大边)产生过度的光漂白(和潜在的光毒性)在扫描区域的边缘,因为增加了暴露于激光。扫描非线性补偿的最简单的方法是限制扫描范围这部分的振镜的速度几乎是线性振荡周期,这发生在一个跨越约百分之70的总扫描宽度区域。不幸的是,该解决方案降低了发射信号可以被收集的时间,提高周转时间之前扫描信号可以再次收集,并不能防止漂白在该地区被记录在跌倒的标本地区。光漂白的影响可以被最小化,然而,当用检流计的振荡的线性部分采用限制试样暴露于光照区域的孔径可调。

图像失真的非线性共振振镜扫描引起的是幸运的是可预见的,可以通过软件或硬件解决方案修正。不管涉及产生图像的校正方案,最有效的策略包括在扫描振镜的向前和向后扫描收集数据。在正向扫描是简单的记录数据,但由于落后的扫描改变像素的图像数据记录的方向,必须使用专门的读写缓冲区或软件倒。在实践中,图像聚集在正常宽度的两倍(实际上,1024像素为512 x 512像素的最终图像的大小)和正常高度的一半(256像素)。在每个结束了X-谐振振镜轴扫描,提供线性垂直锯齿波信号(Y)电流计加1线和反向(X扫描开始)。在这种方式中,垂直扫描进展顺利256次直到一图像足够的数据采集。

共振扫描时序问题

谐振式扫描共聚焦显微镜软件和硬件时钟解决方案依赖于了解高频谐振振镜的位置数据。在7.9千赫的设备,这面镜子可以旋转约12度,在每个方向绕中心轴(共24度的旋转)。镜角位置(θ)和相位(或速度φ)的关系可以预测取决于振荡周期的状态。在一个振荡周期的开始(镜子的位置等于正负12度;图5和图6)镜子是固定的速度等于零。当镜子移向中点,角速度随相位的余弦函数,达到其最大值时,镜角等于零。继续,镜子又减慢时向前扫描到的速度等于零,因为它瞬间改变方向的结束。在角速度相同的变化是观察镜在相反的方向转动。应考虑与共振情况下的另一个因素是,这些设备是高Q振荡器和不能有效地同步到一个外部频率的相位和振幅变化大的反应时稍有漂移的自然振频率和外部驱动源之间发生。因此,共振电流计本身应该是作为主振荡器的定时元件同步所有其他。

基于软件的时钟方案涉及共振扫描共聚焦显微镜能够像素数据的线性化使用查找表的基于镜像的可预测的运动算法。作为一个例子,一个流行的算法首先确定相位常数为镜和图像采集卡,然后确定最终图像的中心像素。该算法通过围绕中心对称平面的反射镜的位置与高度精密称。图像通过一个水平扫描时间在它们传送到图像采集卡生产线加工。像素数据存储接收从扫描仪在两次最终图像宽度和高度的半决赛。这个过程的第一步涉及反相点数据的水平扫描线的下半年,其次是隔行倒数据线之间的图像上半年(图6(b))。由于图像中点的可能不是由于数据和水平同步信号触发采集起始集合之间的滞后确知,这往往是软件偏倒的几个像素的扫描线的必要。在这种情况下,扫描线的右边缘作为图像的一个参考点。序列中的下一步是将一个校正因子为每个像素或相位相对于中心像素。像素然后安置在最终图像的正确位置(图6(c))。在理想的情况下,利用先进的高速计算机,输入数据可以动态分析和记录到硬盘实时。

硬件时钟

由于谐振振镜可以漂移的温度和振幅的变化,以及作为一个主持人,很难控制其他变量,设计硬件时钟机制是扫描镜在振荡周期的瞬时角位置的精确测定的关键。目标是产生一个时钟脉冲,当激光束穿过一个均匀分布的像素边界上从左到右或从右向前扫描对逆转左扫描。这些时钟脉冲不会均匀分布在谐振情况下的时间。正如上面所讨论的,这种差异是由于角速度是在扫描范围最大的中心,那里的时钟脉冲将更加频繁(有间距约70纳秒)。在极端的情况下,在振镜开始改变方向,时钟脉冲将有更大的间距(接近160纳秒)。在理想的情况下,时钟脉冲用于触发的光电倍增管输出的模数转换和每个像素代表在最后的图像相同的空间位移。已开发的几种方法,线性谐振扫描数据(称为扫描线性化)使用的硬件,但最成功的两个策略被模拟像素时钟和实时测量的光纤光栅反射镜位置。

的像素时钟解决方案的一个例子是利用一个电压控制振荡器(压控振荡器)和相位检测器连续跟踪像素和周期循环操作的电流计。一旦像素时钟锁定扫描共振频率,振荡器时钟计数器,访问一个内存芯片存储信息有关的像素位置的扫描速度。记忆将该存储的信息通过数字模拟转换器,将压控振荡器在一个封闭的循环。由压控振荡器接收的控制电压用于校正时钟频率匹配的扫描仪的余弦速度变化。作为一个交叉检查,像素时钟发送每个像素的触发相位检测器比较定时扫描同步的电子信号。检测到的相位误差产生校正电压,反馈到压控振荡器的维护周期与扫描周期同步。压控振荡器的输出用于探测器的像素时钟。几种先进的专有像素时钟可以从共振电流计制造商为他们的电子控制选项。然而,大多数的产生是基于查找表不允许在扫描模式的发生是由于机械漂移的小变化信号。

尼康共振扫描仪像素时钟的光学系统

最先进的基于硬件的像素时钟能够直接跟踪反射镜的位置在整个扫描周期使用辅助反馈系统,直接追踪镜运动获得的光学数据。也许最好的例子是第一次描述了罗杰钱和布瑞恩bacskai和作为第一个商业共聚焦显微镜含有共振扫描仪的基础上,介绍了rcm-8000的尼康,早在上世纪90年代。类似的计时系统是目前采用的高性能的尼康A1R共聚焦显微镜系统。总之,尼康的像素时钟是基于使用一个辅助的低功耗红外激光系统反映了共振电流计反向镜面时梁。反射光束聚焦在光栅的透明与不透明的条纹(称为Ronchi光栅)和振动与共振扫描仪沿光栅周期的步骤。光通过光栅记录的强度变化,使用专用的光电二极管,提供信息给电子元件,数字化的图像数据。由于检流计反射镜的位置检测精度高,振荡,像素时钟是非常准确。

如图7所示是一个示意图,勾勒出一个Ronchi在共振扫描共聚焦显微镜为基础的可变像素时钟光栅光学系统组件。在像素时钟的主要光学和电子元件在图中左边所示,包括低功耗半导体红外激光光源,可旋转的磁盘包含光栅不同间距,中间透镜聚焦激光光束反射到Ronchi光栅和光电传感器,探测光脉冲通过光栅。参与激励和成像光学列车在右手边的图形组件,但为了简单,成像元件的数量减少到最低限度。注意,在图7中的谐振振镜对双方为高反射的表面适应成像和时钟激光器。

在操作中,由时钟二极管激光器发射的光直接反射而参与成像系统激光器光从同一面镜子前反射谐振扫描镜的背面。从时钟激光聚焦聚光透镜席卷对振镜的摆动运动步Ronchi光栅的表面。在光栅,激光束扫过一系列交替的不透明和透明的空间线条宽度相等。聚光透镜聚焦时钟束小于间距光栅确保光是完全通过或由光栅部分封锁线的大小,以交替的方式依赖于检流计反射镜的位置。关键的一点是,在光栅表面的激光束光斑水平要明显小于栅线宽度为消除衍射。在光照强度的振荡振引起的波动是由光电二极管检测,位于下方的光栅。

在水平扫描振镜的谐振周期,时钟寄存器的脉冲激光二极管的Ronchi光栅可以电子方式转化为具有可变频率的像素时钟散。这些光脉冲将时振镜在其振荡周期的中央部分将更加频繁,但他们会慢下来,如镜的扫描,达到改变方向的结束。对光电探测器的要求之一是处理可变脉冲频率的能力(在带宽方面),它必须足够大以检测整个线扫描。检测器连接到一个跨导放大器,光电二极管的电流脉冲转换成放大的电压,然后送入一个倍频器电路,双打每行的像素数。光电二极管和相关的电子传递256脉冲每线和倍频电路将输出512个脉冲,每行由图像采集卡采集和用于构造一个图像。

Ronchi光栅像素时钟

图8给出了一个Ronchi光栅耦合到光电探测器作为可变像素时钟的使用背后的基本概念的说明。为了清晰,光栅图8(a)只包含八个间距相等的叠加与共振电流计和时间的余弦运动一个完整周期(红色曲线;125微秒)。实际光栅256线间距和是线性尺寸更紧凑,由于像素时钟激光实际上追述一行(垂直于不透明线)在光栅表面的操作(如图8(b))。当光束进入和退出的Ronchi光栅的清晰区域,透射光强度是由光电二极管检测到的上升与振镜运动步跌倒(图8(c))。每个过渡(在这种情况下,从黑暗到光明)光由光电二极管检测是用来产生像素时钟(图8(d))触发图像采集的显微镜。虽然时钟脉冲,图8(d)的非均匀间隔的时间(大约70至160纳秒),但它们对应于图像的空间间隔相等。

为了在相同的空间间隔获得像素样本(而不是在相等的时间增量),光电倍增管的信号从主显微镜成像系统通过可变增益和偏移传统的放大器,然后通过模数转换器由Ronchi光栅脉冲产生像素时钟触发的数字化。然而,对图像信息的一半倒由于双向共振振镜扫描。为了纠正这种双向扫描神器构造一个图像之前,数字像素输出是先转移到一个先进先出(FIFO)或后进先出(后进先出法),缓冲取决于像素从左到右或从右到左后天。因此,对振镜的水平扫描过程中,图像的像素是扫上半年获得(62.5微秒的时间)被送入FIFO缓冲区而反向扫描过程中获得的像素被送入后进先出缓冲区。FIFO缓冲区读取和重置为零在每个水平线开始收购,而后进先出缓冲区计数输入数据存储在下读出期间确保反向扫描过程中获得的像素倒。

共振扫描的优点

不像旋转盘,形势扫场,旋转多边形的显微镜,激光扫描共聚焦显微镜共振能够改变放大倍率不使用通用的聚焦缩放功能改变的目标。变焦控制的物理基础涉及改变旋转角度为横向谐振振镜扫描镜以及垂直线性振镜。小后掠角降低了试样的同时保持有效提供选定的标本细节放大图像的像素数相同扫描的区域。调用聚焦变焦功能需要改变间距的线在Ronchi光栅用于可变像素时钟。图7中的磁盘包含光栅四大小,每一个都可以旋转到像素时钟光火车为了改变缩放因子。当线径在Ronchi光栅间距尺寸缩小一半(保持相同的线路总数),由两个因素的缩放因子的增加。同样,降低光栅线尺寸由四增加到4倍的放大因子的一个因素。可能的缩放设置的数量取决于Ronchi光栅尺寸可变像素时钟数。尼康A1R激光共聚焦显微镜能放大步骤7从1到8倍。互换光栅需要降低谐振振镜的扫描角,这是使用预先存储的信息在显微镜控制电子检流计扫描角坐标与选定的光栅实现。

谐振扫描镜的动态影像采集速率的选择仅仅通过改变图像的尺寸提供广泛的纬度,同样像素组合在旋转盘显微镜面阵探测器。虽然这一水平线扫描速度是由检流计的谐振周期固定,用每幅图像的行数可以减少产生更快的成像速度。因此,在512×512像素的图像的大小,尼康A1R显微镜在每秒30帧的速度产生的图像。如果垂直线的数量的一半是采集收购具有512 x 256像素尺寸的图像,帧速率是每秒60帧,理论上翻了一番。注意图像的大小速度的关系是不完全的线性由于在线性定位轻微的延迟(Y在更高的速度表)。对于尼康A1R显微镜,扫描率最高达到共振扫描模式,每秒420帧,在512 x 32像素的图像尺寸。对于许多应用,如快速的钙波成像活细胞,减少垂直图像尺寸的增加速度可以接受的牺牲。

串联谐振振镜扫描的应用

如图9所示是使用光学荧光笔荧光蛋白在活细胞中的光转换和光活化的实验中,从该串联扫描和如此配备谐振扫描共焦显微镜高速能力的一个组合,其显著受益。图9(a)至图9(c)说明了在光转化标记的融合mEos2的间隙连接(红色到绿色的光可转换荧光蛋白)的蛋白43间隙连接组分和表达于HeLa活细胞。一个小的区域被选择为光转换与耦合到一个405纳米激光的检流计线性(如图9(a)),其次是成像用488纳米激光(图9(b)和图9(c))。图9(d)〜图9(f)表示的PA-GFP的光活化融合到人β-肌动蛋白在肾细胞。类似于图9(a)中,感兴趣的区域被照亮用405纳米激光随后成像在488纳米。最后,线粒体的使用的融合红色发光点燃荧光蛋白(KFP1)到线粒体靶向信号出现在图9(g)至9(ⅰ)的照片切换。标记的线粒体被成像与在图9(克)既荧光和微分干涉对比(DIC)模式561纳米的激光。后完全照片切换标记的嵌合体“关”与488纳米的光照,线粒体通过再次成像在561纳米的出现缺乏荧光(图9(H)),它可以被重新激活(图9(i))。使用光学荧光笔调查可以与共振扫描共聚焦显微镜下进行在成像速度必要澄清细胞内动力学上各种各样的时间尺度。这些成像技术是通过在尼康A1R扫描仪hyperselector成为可能(见图1),它将405纳米光子用于光活化的振镜扫描器,离开共振扫描仪可以同时获得的光固化产品的高速图像。振镜扫描器可以缩放限制刺激区域的大小(可以大大加快激活)。能够用光催化在405纳米的同时获取图像,利用谐振扫描器延伸到尼康a1r-mp多光子显微镜。

结论

传统的激光扫描共聚焦显微镜遭受的主要缺点是相对缓慢的关于图像采集速度尽管在光排斥来自荧光区域从焦平面取其高分辨率的优势。在共聚焦技术的主要技术的局限性是一个快速的水平要求(X轴)扫描镜能够产生500个或更多的实时每帧的线。然而,即使在相当慢的扫描速率的点扫描共聚焦显微镜配备标准线性振镜,波束驻留时间,构成一个像素很短,限制了可以采集的信号量。随着新技术的引入,提高扫描速度,如共振电流计,争论仍然存在,继续增加点扫描共聚焦显微镜的速度只会降低信号量,直到它最终运行在最高速度。这最重要的,但关键的信噪比概念也许不公平的LED的几种可供选择的高速成像技术,提供劣质的光学切片的性能在重点工程努力点扫描仪器能够视频速率的图像捕捉消费的发展。

与预期相反,一些报告显示高速点扫描共聚焦显微镜配备共振扫描仪能够改善信号水平和减少漂白过什么预料。这个意外的结果最有可能来自人工合成的荧光团,这极其复杂的光物理行为的量子点,和基因编码的荧光蛋白,所有这一切都似乎是能够激活,光的光谱,在不同程度上通过广泛的不明原因的机制。关于共振扫描共聚焦显微镜,荧光信号的增加可能是激发光照剂量依赖性反应,通过快速扫描产生的信号电平增加调制。通常情况下,这样的反应应该取决于光斑的直径和速度的光束扫描标本。结果模拟脉冲照明的荧光。因为脉冲光可以转变成黑团或“关闭”的矛盾状态中,他们避免进入激发态,荧光发射水平的增加而增加,光漂白率有所降低。这些报道都没有得到实验验证,一个广泛的基础,但他们应该记住在检查生活快速共聚焦成像结果和固定标本。

共振扫描共聚焦显微镜,一个仍在发展和完善的技术,应该被证明是用于检查主机采用细胞生物学问题的组织,一个有用的方法,和完整的生物条件下的视频率成像是实验的关键在。同时利用谐振和线性振镜与兴趣激活或漂白优越的光学部分的分辨率比区串联进行高速成像是一个额外的好处,不能与其他技术实现的能力。最精密的仪器,可以将视频率与使用专门的探测器进一步提升这些新型成像光谱共焦扫描显微镜。例如,使用荧光蛋白成像钙波共振生物传感器需要非常快速的采集速度因为波可以在不到一秒钟穿过细胞。使用传统的共聚焦显微镜,钙成像几乎是不可能的,但与仪器如尼康A1R,波可以实时捕获和荧光发射光谱的贡献而可以解开与光谱检测器。这种类型的实验,以及无数的人,将有利于在未来的激光扫描共焦显微镜检查谐振。