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徕卡显微镜,细胞培养和激光显微切割

2013-11-01  发布者:admin 

许多目前正在作出的发现,在细胞分裂和分化,单个细胞和细胞器之间的关系,与药用物质的细胞的治疗,等不会有可能没有活的细胞培养物。允许单细胞的形态学和生化观测不同实验条件下,他们提供了一个独特的信息来源。细胞培养所面临的挑战是想象他们使用合适的对比度不杀死细胞的技术。

 

激光显微切割活细胞培养中的应用

激光显微切割提供了广泛的细胞培养操作和选择选项,不仅是单个活细胞,但也是整个文化同质小学文化作进一步处理或种植隔离。

可以很容易地使用各种活细胞切割(LCC)模块,为进一步培育或如PCR分子生物学分析解剖选定的区域或不同的克隆细胞培养显微单细胞或细胞聚集要保证所需的无菌细胞和完好状况,他们往往已经培养在特殊培养皿或标本幻灯片与特殊井为细胞培养。这些元件放置在专门设计的持有人在样品载物台,并与激光显微切割技术进行观察,操纵和解剖。传统的培养皿中,培养皿PEN膜之间是有区别的。后者特别适合于现场的小区扇区使用LCC。激光显微切割后,解剖细胞下降,例如,可以在孵化器96井机架上,从而有机质为8条。

激光显微切割的各种试样和集电极持有人的可能用途和组合在下面的章节中描述。

 1:的人力forescin成纤维细胞感染人类巨细胞病毒,巨细胞病毒-GFP融合蛋白(礼貌:玛格丽特Digel UKT蒂宾根大学医学病毒学研究所基督教Sinzger博士,德国)。

Sinzger博士,德国)。

1A:显微切割前, 
1B:显微切割后, 
1C:显微成纤维细胞的检查, 
1D:4天之后在培养
 

激光显微切割标本和收藏家持有人的可能组合

下面的标本和集热设备都可以使用,结合LCC模式:PEN膜,可堆叠膜环和Ibidi幻灯片的培养皿。这3个试样的载流子可以用于激光显微切割和选择,也适合作为收集装置。8孔条和陪替氏培养皿(无PEN膜)也可以被用作收集装置,但不能用于激光显微切割。但是,生活没有PEN膜细胞培养和单个活细胞在培养皿中,可以用激光操纵,并观看了时间较长的使用时间推移电影功能。

特别是,所有标本设备适合用于细胞培养的组合习惯采集设备(0.5毫升管,0.2毫升管,8条,片上实验室(LOC),Ibidi幻灯片和培养皿)。

培养皿与PEN膜
细胞在培养皿中培养PEN膜可以在LCC模式解剖,并转移到其他的皮氏培养皿(带或不带PEN膜)。同样,从陪替氏培养皿的dissectates可以直接收集在一个芯片上在所谓的Ibidi的幻灯片进一步培育或0.5 ml微量离心管,0.2 ml微量离心管,8孔条纹上限,或实验室的 8孔条(LOC)分子生物学下游分析。

可堆叠
可堆叠膜膜环环提供相同的培养皿PEN膜的可能性。此外,它们可以相互下面层叠激光显微切割捕获隔离材料在镇定剂环直接从上面。

Ibidi滑动
标本幻灯片Ibidi幻灯片特殊井,像上面,组合试样夹具适用于LCC模式以及与下游分析的习惯采集设备(0.5毫升管,0.2毫升管的整个范围的,8条实验室在一个芯片上(LOC))。此外,一个Ibidi堆栈是一个优雅的,污染的自由选择方法:,如果解剖标本持有人从这种堆叠的细胞,dissectates自然垂下下面进入下一个幻灯片,这是在一个特殊的堆叠支架,恢复耕种举行。

 2:Ibidi的幻灯片和LCC 8孔条纹。可用于单个幻灯片(左上角),或作为Ibidi滑动堆栈(右上角)的激光显微切割ibidi幻灯片。对于高吞吐量的应用程序为8-条纹(左下方)和Ibidi幻灯片的(右下)的收集装置可以结合对活体细胞的试样夹持器。
 
 

激光显微切割后的在培养

显微切割后,传递给细胞的收集装置,并可以在新鲜的营养培养基中有机质的。堆叠膜环并不需要一个专门收集持有人。这些和Ibidi幻灯片可以简单地叠放在对方允许的污染显微切割过程。然而,在一个合适的盖(ibidi幻灯片)或可选的气候室的激光显微切割系统相结合,无污染的选择过程中得到了保证。可堆叠的膜的环和Ibidi的幻灯片的另一个优点是,当一个单元被解剖,没有单独收集需要支架。

此外,所有的习惯收集设备,如离心帽或在一个芯片上的实验室(LOC),可用于分子生物学分析和PCR,例如,没有任何进一步的制剂。

 3:气候室徕卡LMD系统。徕卡LMD系统可以交付与气候暖空气孵化室(图左,应用实例权)。
 
 

实际使用中的活细胞激光显微切割(LMD)

在基础研究的目标之一是要找到一种新的抗癌药物的想法。这在下面的例子进行了说明。

在实验中,培养肿瘤细胞在原代培养物的形式,并分裂之前达到汇合。部分细胞有机质的进一步的实验,以获得足够的细胞的物质,而其他的PEN膜施加到陪替氏培养皿。

对于进一步的步骤,在陪替氏培养皿中的营养培养基中首先已被删除,直到只有一个薄膜仍然存在。由于使用PEN膜的陪替氏培养皿,在现有的培养的单细胞可以很容易地选择所LMD LCC模式转移到8孔条。现在有一个单个肿瘤细胞的各孔中  

可以重复该过程,直到集合中的每个孔中的移动设备包含单个单元格再次,在这种情况下,形成一种新的文化的基础解剖后。因此,一个以及各培养的细胞应含有相同的DNA,因为它们源于一个相同的分离的原始细胞,细胞可以用于PCR分析的突变检测裂解和转发。因此,结果是总是溯源到一个单细胞dissectate。

 4:激光显微切割和活细胞培养(LCC)。实验培养细胞的激光显微切割(LMD)的利益。A)显示常规培养过程和拆分单元格(在这个例子中,文化与异质细胞肿瘤):汇合增长后细胞是splittet和的重新培养为进一步培育成平常的培养皿中,并进入PEN膜作进一步处理的培养皿LMD。B)的线路输出端,例如,特定的细胞提取到8条纹井在不同条件下或不同细胞的各孔中,使细胞生长的调查。C)再次用以耕作细胞选择性地选择克隆LMD:单个肿瘤细胞(绿松石)剪成不受影响细胞(灰色),同时一个幻灯片Ibidi进一步培育井留在培养皿中。可以用作一个堆栈(“三明治”)的激光显微切割分离克隆的细胞多的并行分析,如用不同的毒素处理分为以下几种不同井的Ibidi幻灯片ibidi幻灯片。

 

除此之外,可以进一步细胞原代培养定期转移到培养皿与PEN膜分裂。LMD可用于解剖在恢复耕种在另一个陪替氏培养皿与PEN膜的陪替氏培养皿中的这些肿瘤细胞的新的单细胞。同样,相同的原始细胞的单细胞可以分离出在LCC模式下,通过PCR分析和上面所描述传送到平行Ibidi幻灯片中。毒素可被添加到这些比较健康细胞的细胞生长(图2),以分析其对肿瘤细胞生长的影响。

关于一种新的抗癌药物的发展,可以在不同的毒素具有相同的DNA为同一来源的细胞,以检查特定的毒素的反应的细胞。它也可以观察到细胞的基因组中(基因和蛋白的表达,如果需要的话),通过分子生物学技术。

另一种可能性是治疗不同的单细胞与同一肿瘤的不同的DNA具有相同的毒素。然后,可以检测和比较的各单电池的反应所施加的毒素。

,而不是常规的计数室的许多细胞或手动选择,自动视觉控制(AVC)程序可以被使用,其中确定并选择一个自动的基础上的激光显微切割的细胞。样品,并因此节省大量的时间,这意味着大的吞吐量。AVC模块是一个特别可行的替代手工采集的单个细胞在蛋白质研究中。AVC程序也能够捕捉到并选择荧光细胞。对于成功的外源DNA转染到真核细胞中,荧光标记物可以被耦合到导入的载体作为对照。例如,绿色荧光蛋白渗透的方式从一个向量;成功后,浸润和进一步培养含有GFP蛋白的荧光标记的细胞,并可以很容易地计算和解剖。

 5:肺上皮细胞培养。

5A:显微切割前 
5B:在显微切割 
5C:显微切割后
 

细胞培养研究中

正越来越多地用于医学研究,在制药和化妆品工业和生物技术和环境分析以及细胞培养。一个主要应用是在基础研究方面的新陈代谢,分裂和其他细胞过程的研究。它们也可用于测试系统,例如,用于信号转导和细胞毒活性的物质以供检查的疗效。

简单的蛋白可以很容易地在细菌中产生的,而更复杂的蛋白质只能产生与细胞培养物,使合适的蛋白质糖基化和复杂的连接,通过二硫键发生。

活细胞制造各种生化制品,如单克隆抗体的研究和治疗在医学中应用也起到了显著作用。几个单克隆抗体的许多可能的用途是治疗急性和慢性白血病,非霍奇金淋巴瘤的无线电免疫疗法治疗类风湿关节炎的。某些疫苗(例如预防流感),也可以从细胞培养物生产。和促红细胞生成素,应用作为造血治疗在患有乳腺癌的连接,例如,从细胞培养物中获得。

几乎所有类型的细胞,可以产生从干细胞的培养。一个熟悉的做法是使用造血干细胞在白血病研究和治疗。成体干细胞,也可以用于组织工程。

在诊断中,潜在的病原微生物被施加到文化和分析增殖后发生。

在植物研究中,完整的植物可以产生的未分化的分生细胞。例如,拟南芥可以是大量生产的在体外进行测试,对盐胁迫性,耐水性等

所谓生物反应器特别是在业内被发现与活细胞 - 一个典型的应用是现代胰岛素的生产。骨髓间充质干细胞可用于不同类型的组织的再生,因为它们可以在不同的体细胞,如软骨,骨或肌肉分化。要取得在特定的细胞类型的分化,组织特异性的生物反应器的使用,例如,开发用于在体外检验恶性肿瘤血管的皮肤等同物。类似的实验,具有标准化的人类细胞的物质是作为日后动物实验的替代方法的或完全替换它们。

上面的例子,但是,只显示一个巨大的范围的可能性,并在活细胞研究和发展的机会的一小部分。

细胞培养的是什么?

一种细胞培养是在受控条件下在营养培养基中的有机体(在体外以外的动物或植物细胞的培养小学和永生细胞培养之间是有区别的。一个主要的文化是一种非永生化细胞培养直接从组织样品。永生化的细胞培养,另一方面,其特征在于由它的无限的容量用于除法。这可能需要通过随机突变,如在肿瘤细胞中,或故意遗传的变化,如引进一个专门的质粒载体。这样的细胞可以在体外肿瘤或恶性转化的显示特征

基本上可从各种组织(如肝,皮肤,肾,脑细胞,等),单细胞。这是通过用蛋白酶如胰蛋白酶,保持细胞的蛋白质,分解。以这种方式分离的细胞,然后培养和乘以陪替氏培养皿多个除法可以选择性地在某些类型的细胞中,通过添加生长因子刺激。

 6:PEN膜的培养皿中。活细胞应用标准培养皿中,培养皿PEN膜可用于收集dissectate(左)。此外,PEN膜的培养皿可用于活细胞(右)解剖标本架。
 
 

养殖

不同于细菌,动物细胞/原代培养能够生存在悬浮液中,并为他们的成长需要一个合适的粘结面。因此,能够区分从非贴壁细胞悬浮培养的贴壁细胞培养物(如成纤维细胞,上皮细胞,内皮细胞和软骨细胞的表面上生长的),其中的细胞增殖,因为它们在营养培养基中自由游动,例如为淋巴细胞。

在合适的培养基中,细胞分裂形成一个所谓的细胞草坪。当贴壁细胞密度达到最大可能的在他们的安排,我们讲的汇合处。这触发了接触抑制,停止细胞分裂和文化变得静止。通常只划分脊椎动物细胞凋亡前的30到50倍。有时是自发的,但通常实验诱导的措施,如引入一个特殊的质粒作为载体诱导细胞永生化。一个主要的文化,从而成为永久的细胞系,这是受到无限的分裂速度,但其原有的细胞有许多特点。

恶性细胞转化通常缺乏接触抑制的现象,提出自己不朽的文化和尚存在悬浮液。因为他们有肿瘤细胞的特性,可诱发肿瘤的形成,通过注射进入一个有机体/实验动物。

增殖

营养介质必须是这样的,以确保乘以以及执行的典型功能的细胞,细胞的生长,增殖和分化。的最佳组合物取决于特定的细胞类型。化学上确定的培养基通常是优选的,典型的基础培养基中含有氨基酸,维生素,无机盐和缓冲液的混合物,额外的生长和分化因子,可以被替换胎牛血清,除了。

培养的细胞只能存活在合适的媒体。必须进行监测的pH值,一般是通过在营养培养基中的显色指示剂。正常的细胞增殖,5%CO 2的气氛中以37℃的温度下发生,作为缓冲介质,在特殊的孵化器。成倍后,细胞可以从他们的陪替氏培养皿的表面除去,通过化学(如胰蛋白酶)或机械(例如,幻灯片)细胞培养在合适的稀释。贴壁的细胞进行传代培养,即转移到一个新的营养培养基中,发生汇合之前。在这种方式中,小学文化,可以保持相对长时间活着。

可视化细胞培养的方法

光镜观察生活材料仍然是一个特权。尽管他们的高解析度证明不适合现代高科技仪器,如扫描电子显微镜。

然而,活细胞是由透明的视觉光谱性质,因此在对比极其恶劣。在一个常规的光显微镜下,几乎是“透明的”,难以识别图像中产生所谓的明视场模式下。获得所需的对比度虽然有许多标本染色产品,通常杀死细胞培养制备和染色过程。

活细胞可以成像与相位对比技术,虽然在较厚的部分的检体造成问题的串扰和扭曲。微分干涉对比方法(DIC)是成像细胞培养和活细胞的另一种方法。集成调制对比度(IMC)技术也被证明可用于检查未染色,低对比度的样本。观察活细胞的另一种方法是对其进行标记,用荧光蛋白。这些可以被基因导入细菌为动物或植物细胞。该方法可用于标记单个活细胞,细胞聚集体,器官或整个动物。蛋白质的生物合成,以及运输,分泌和降解过程可以直接在生物体中使用的荧光观察和分析。荧光蛋白存在于许多不同的形式,用不同的荧光光谱,例如

  • GFP(绿色荧光蛋白)
  • 蓝色荧光蛋白(BFP),
  • 青色荧光蛋白(CFP),
  • YFP(黄色荧光蛋白)。

荧光素和荧光珊瑚蛋白也正在越来越多地用于显微镜。GFP是常规应用,标记蛋白质在活细胞中,并检查他们的行为在原地

题外话:荧光/ GFP

短波辐射暴露时,一些物质发光。在荧光技术,这是利用非自体荧光的利益结构与相应的荧光蛋白如GFP标记。GFP是一个发光的水母(Aequorea victoria的修饰蛋白当蓝光或紫外光激发时,它会发出一个密集的浅绿色的颜色。

当通过基因工程技术导入细胞,荧光蛋白的分布,解剖学和发展的目标单元格的形式给分析上市。因为他们没有毒性作用,它们非常适合探索活细胞。细胞既不损坏或破坏,所以条件是理想的活的生物体体内试验,原位和实时。

如何进入细胞的遗传信息得到?

这个问题的答案是,特种运输质粒引入到目标生物体作为载体。的荧光蛋白质通常是耦合于这些。

向量的工作方式不同:

克隆和表达载体留在目标生物,即使在完成运输任务。无法建立自己在这些自杀载体,可以被引入到许多主机。由于他们的transposomes(所谓的跳跃基因)的自杀载体管理渗透到靶标生物的染色体或质粒,以与它们耦合的GFP。自杀载体的其余部分都将丢失。

细胞周期阻滞与FUCCI技术

也可以结合使用激光显微切割技术在未来的另一项技术是FUCCI(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator method)。

在该方法中,细胞系是专门处理,以改变它们的荧光,根据他们的细胞周期的状态。蛋白质组学研究可以在原地进行,在体内,在细胞周期的实时捕捉到发展阶段的不同的细胞蛋白表达和解剖所需的细胞或地区使用激光显微切割。此外,它也有可能快速并直接使用AVC的软件,例如以选择单个细胞相同的细胞周期阶段。  

细胞周期阻滞

所谓的检查点是特别重要的,为“质量检查”细胞周期过程中的相变。这是可能使细胞周期停滞在G1-/S-phase(中期)。到现在为止,它被证明是困难的,以确定确切的时间和地点相变 - 它只能通过化学诱导的细胞周期阻滞过程,例如。细胞有不同的划分率,因此在细胞周期的不同阶段,目标阶段捕获活细胞是有问题的。

如果一种毒素被施加到前S期的细胞,使除停滞在细胞周期可以同步在2天内。然后在所有的细胞是相同的相位。这种类型的细胞周期阻滞用于分离白细胞染色体,例如。人体血液中的白细胞培养72-96小时一段时间,然后用一小时与colcemide停止在细胞周期中的中期。

然而,细胞周期同步再次变得不平衡了一段时间后,由于不同的划分时间。

FUCCI技术

FUCCI技术可以用于可视化在活细胞中由G1期向S期过渡。等待时间长的问题与化学诱导细胞周期阻滞技术所遇到的规避引入荧光蛋白。然后,可以通过不同的颜色标识的不同阶段的细胞的发展。荧光被触发,例如通过引入蛋白质MAG-相中的mKO2的CDT1。各个阶段确定醒目的颜色对比。细胞核显示红色在G1期,S,G2和M期的绿色荧光。从G1向S期的过渡黄色荧光确定。激光显微切割的荧光模式的组合是一个巨大的节省时间,作为黄色荧光的细胞,例如,可以通过对AVC模块捕获,并直接记录,可在荧光模式下解剖。