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尼康显微镜告诉你,什么是相差显微镜?

2013-10-31  发布者:admin 

相差显微镜,在1934年首次描述由荷兰物理学家釉泽尼克,对比度增强的光学技术,可以利用以产生高对比度的图像的透明标本,如活细胞(通常在培养物),微生物,薄的组织切片,光刻图案,纤维,胶乳分散体,玻璃碎片,和亚细胞颗粒(包括核和其它细胞器)。

实际上,相位对比技术采用了光学机构翻译成相应的振幅的变化,它可以是可视化图像的对比度差异的相位的微小变化。相差显微镜的主要优点之一是没有先前被杀害,固定,染色,活细胞中可以检查它们的自然状态。其结果是,可以观察和持续的生物学过程的动态记录,可在高对比度的鲜明清晰分钟标本细节。

图1中显示的是一个现代的直立相衬显微镜的剖开图,包括相位对比光学列车的示意图。部分相干照明产生的卤钨灯被引导通过聚光透镜集中在台下聚光前焦平面定位在一个专门的环形带(标记为聚光镜的环形带)。波前通过环照亮标本,通过不偏离或标本中存在的结构和相位梯度相衍射和智障。不偏离的偏析,由相差的后侧焦点面的衍射光由物镜收集并聚焦在中间像平面形成的最后阶段在目镜中观察到的对比度的图像。

本发明的相衬技术之前,透射明场照明的最常用的观察模式,在光学显微镜,尤其是对于固定,染色标本或其他类型的可见光具有高的自然吸收的样品之一。总的来说,的标本容易地成像与明照明被称为振幅对象(或标本),因为照明的波阵面的振幅或强度降低,当光穿过试样。

可以采用一个标准的明视野显微镜相衬光学配件此外,作为一种技术来呈现一个让人联想到光学染色(参见图2)在透明的标本对比度增强效果。光波衍射和标本(称为相位对象的相移可以转化相衬中的目镜可观察到振幅差异。大的,扩展的标本也容易可视化,由于衍射和散射的现象,发生在这些对象的边缘的相位对比光学系统。现代相衬显微镜的性能做精,使标本中含有非常小的内部结构,甚至只是一些蛋白质分子,被检测到时电子增强和收购后的图像处理技术被耦合到。

图2给出了培养的活细胞,在明视场和相衬照明成像的比较。细胞生长的营养物的培养基中含有的氨基酸,维生素,矿物盐,胎牛血清沐浴在单层培养的人胶质脑组织。明照明(图图2(a)),细胞出现半透明只高折射区域,如膜,细胞核,而独立的细胞(圆形或球形),可见。当观察相衬光学配件,同一领域的观点揭示显着更多的结构细节(图2(b))。蜂窝附件成为可辨别的一样,大部分的内部结构。此外,显着提高对比度的范围。

泽尼克相衬光学理论的发展是一个很好的例子,如何从一个高度专业化的领域(在这种情况下,理论物理)的研究成果可以产生创新的新发展,在看似无关的学科,如生物学和医学。在第二次世界大战期间,在德国耶拿的蔡司光学工程是世界上第一家将实际相衬光学显微镜。生物研究的直接影响是显着的,和该技术的广泛应用,持续到目前的一天。现代相衬物镜,尼康等光学制造商设计和生产的,是能够结合辅助对比度增强技术,如微分干涉对比,荧光,偏振光。这些物镜是提供与内部相位板有不同的吸收和相位位移环绕(未衍射)照明水平,产生广泛的标本对比度和背景强度的选择相衬显微镜。

光波阶段标本的相互作用

事件眼波目前在照明光束变成分为两部分后,通过一个阶段的标本。其主要组件是一个不偏离(非衍射的零阶)的平面波前 ​​,通常被称为环绕S)波,通过和试样周围,但不与它进行交互。此外,也产生了偏离或衍射的球面波前 ​​(D -波),也变成分散在很宽的弧(在许多不同的方向),通过全开光圈的物镜。在离开试样平面,环绕声和衍射的光波进入物镜的前透镜元件,其后集中他们通过干涉相结合,以产生所得的粒子波(通常简称为P -波)在中间像平面相衬显微镜中产生的各种光波之间的数学关系,可以简单地描述为:

P = S +ð

取决于检测的标本图像的相对强度的差异,因此,在振幅上的粒子和环绕声(PS波)。如果粒子和环绕波的振幅显着不同的中间像平面中,则检体取得了相当数量的对比,并且很容易在显微镜目镜可视化。否则,将试样保持透明和普通明场条件下(在相衬或其它对比度增强技术的情况下),因为它会出现。

在检体及其周围介质中,该部分的入射光的波前穿过检体(D -波),但不通过周围介质(S -波)之间的光路变化,略有滞后。对于在相衬显微镜的参数,改变波通过的光路长度(实际上,相对相移)中的试样的作用是非常重要的。在经典光学系统中,通过一个物体或空间的光路长度(OPL)的折射率(n)的和的厚度()的对象或中间介质中所描述的这种关系的商品

光学路径长度(OPL)= N×T

当光从一种介质传递速度被改变成另一种,两种介质的折射率之间的差异成比例。因此,当相干光器发出的电磁波聚焦镜灯丝通过检体具有特定的厚度(t)的折射率(n)的相位,波可以是增加或减少速度。如果试样的折射率大于周围介质,波速度降低,而通过试样,随后在相对 ​​的相位滞后时,从检体出现。相反,当周围介质的折射率超过试样,波先进的退出时试样的相。的紧急检体和周围介质中的波阵面之间的位置的差异被称为相移(δ),并以弧度为单位定义为:

δ=2πΔ/λ

在上述方程中的术语D,这是类似的光路长度光程差被称为

光程差(OPD)=Δ=(2 - N 1)×T

其中,N(2)(1)试样的折射率和Ñ是周围介质的折射率。的光程差的查询结果从两个术语的商品:试样的厚度,其与周围介质的折射率的差异。在许多情况下的光程差可以是相当大的,即使试样的厚度是小的。另一方面,当试样的折射率等于周围介质中,光路差为零时,无论是否用试样的厚度是大还是小。

对于各自的细胞在组织培养中,光程差也比较小。一个典型的单层培养的细胞具有约5微米的厚度和折射率约1.36。该信元被包围的营养培养基中,其折射率为1.335,0.125微米,或约四分之一波长(绿色光)产生的光程差。亚细胞结构产生小得多迟钝的。这些小光程差产生的线性强度降低,增加移相(图像的增长逐渐变暗)到一个点(取决于相位板配置),在这之后,通过对比逆转标本图像变得更亮。在相衬显微镜的图像的强度不承担试样的整个厚度和折射率范围的光程差所产生的一个简单的线性关系。相反,强度依赖于多种因素,包括吸收的相位板,相位超前或相差的相位板的程度,相对此相移的迹象。

波相互作用相差显微镜

在图3中,环绕,衍射和颗粒(SD,和P)的试样,该区域在明视野显微镜(相衬光学配件的情况下)的图像平面的波之间的相位关系环绕波和粒子,其相对幅度的数额确定标本的对比,红线和绿线(分别)所示。从检体,这是从来没有直接观察到的,由X射线衍射产生的波被描绘成一个蓝色的波振幅较低。环绕声波和衍射波通过干扰复合生成的显微镜图像平面中的所得到的粒子波。图3中所示的每个波的振幅表示波的各个组件的电矢量的总和。

相对于环绕波,衍射波振幅较低(因为有更少的衍射比环绕声光子的图像点),通过与试样相互作用约90度(四分之一波长)在相位上被延迟。的二十分之一波长表现出轻微的相移,通常在细胞中观察到的微小的细节,所得到的粒子波(而产生的衍射波和环绕声之间的干扰),以及相关的光路长度差。由于环绕和粒子波的振幅几乎是一样的,透明的标本完全缺乏对比和叠加对明亮的背景时,几乎是无形的。

单个波阵面之间的关系,在明视场和相衬显微镜可以使用极坐标系统的矢量描述。在该系统中,矢量的长度表示一个特定的波的振幅,而相对于一个固定的参考(角的相移)的旋转矢量表示的角度的相位位移的程度(参见图3(b))。波相互作用相衬显微镜引入向量表示由泽尼克弗里茨,后来又发展了详细的罗伯特更加光秃。虽然这种描述的援助很少利用的今天,许多文本和研究报告发表在过去几年依靠向量图说明了波关系的讨论。

在相衬向量图,说明相位延迟顺时针旋转(参考任意方位),而被描述为逆时针旋转相位进步。环绕(S)和衍射的矢量和在图3(b),这在技术上是一个相量图,D)的波阵面产生所得到的颗粒(P)的波阵面。这种机制是方便,因为它有助于衍射波的相移,以及它们是如何影响的阶段,由此产生的粒子波(反之亦然)的可视化呈现波关系。在图3(b)在图形上的环绕波的衍射波的相对相移为Φ,其中:

Φ=±90°+φ/ 2

在该等式中,φ为环绕(S)和粒子(P)的波矢之间的相对相移(光程差的函数)显示可以忽略不计的光程差(实际上,无相移)的标本,后者中的u为零和Φ变成±90度。中提出的图3(b)所示,衍射(D)波具有非常低的幅度小的(或不存在)中的粒子几乎等于环绕波的振幅波的相移的结果。环绕波和粒子时也有类似的振幅(或强度),有没有代对比,在明亮的背景和试样仍然无形。

相差显微镜

相差显微镜的设计的最重要的基本概念是从检体,这是投射到不同的位置的物镜的后侧焦点面(上面的物镜后孔衍射平面)出现的偏析的环绕和衍射波阵面此外,必须减少环绕(不偏离)光的振幅和相位超前或滞后(四 ​​分之一波长),以最大限度地提高图像平面中的检体和背景之间的强度差异。用于产生相对相位延迟的机制是一个两步骤的过程中,试样由四分之一波长的相位滞后与衍射波,而环绕波的前进(或滞后)在相位上的相位板位于或非常靠近物镜后焦平面。只有两个专门的配件都需要转换一个明场显微镜相衬观察。一个特别设计的环形光阑的直径相匹配,这是光学共轭的内部的居住在物镜的后侧焦点面的相位板,被放置在聚光镜的前焦面。

聚光镜的环形带(图1和图4中示出)通常是透明的圆环,这是位于前焦平面(光圈)的聚光镜构成为平坦的黑色不透明的(光吸收)的板材,使试样能离焦,从环发出的平行光的波阵面被照亮。在显微镜聚光镜图像在无穷远处的环形隔膜,而物镜上面的后侧焦点面(其中的共轭的相位板的定位,如下面所讨论)产生一个图像。应当指出,多文本描述了从聚光镜的相衬显微镜的光锥与黑暗的中心为中空的应急照明。这个概念是用于描述配置,但不是严格精确。聚光镜的环形带替换,或位于靠近聚光镜的前孔中的调节可变光阑。当进行相位对比实验,利用相位环空和孔径光阑中的聚光镜,检查,以确保可变光阑的开度较大比的相位环形带的外周的。相衬照明和检测圆形的几何与微分干涉对比和霍夫曼调制对比度,使标本的观察,没有方向相关文物。相衬也是偏振和双折射效应不敏感,这是一个重大的优势时,研究活细胞生长在塑料组织培养容器。

科勒照明的条件下,环绕声,不与试样集中的物镜的后侧焦点面(衍射面),为亮环的光波。在这些条件下,物镜的后侧焦点面是共轭到聚光镜的前面开口面,所以非衍射的零阶光波形成聚光镜的环形带的明亮影像的物镜(在图像上叠加的后孔相位板)。通过的球面波前 ​​的试验片(的D波)衍射的衍射平面的不同位置,在整个物镜后孔。衍射光的分布(数量和位置)的数目,大小,和折射率差的试样的光散射中的对象。对于大多数样品中,只有一小部分的入射光波被衍射,一个大部分光穿过不偏离最终照亮整个图像平面。

与此相反,环绕平面波阵面中占有的比例较小的物镜后的光圈值,这对应于聚光镜的环形带的共轭。因此,这两个波阵面不重叠到一个显着的程度,并占据物镜的后侧焦点面上的不同的部分。因为直接的零阶光,衍射光的衍射平面中空间上分开的,两种波分量的相位(环绕声,S或衍射,ð)可以有选择地操纵,而不与其他干扰。

相位板被安装的物镜的后侧焦点面或其附近的(请参阅图4和5),以便选择性地改变的相位和振幅的环绕(或不偏离)的标本的光通过。在某些相衬物镜,薄相位板包含一个减小的厚度,以环绕(S)由四分之一波长的波的相差异推进玻璃蚀刻成环通常情况下,该环也涂有金属膜的局部吸收60-90%,以减少环绕光振幅。由于后侧焦点面附近的内部透镜元件,通常位于一些相衬物镜产生的实际蚀刻成的透镜的表面。无论物镜是如何制造的,最重要的一点要记住的是,每一个相衬物镜相板,一个特点,就是没有从所有其他显微镜物镜被修改为包括。

到达图像平面的波阵面之间的干扰,因为所得到的粒子波产生完全由的环绕和衍射波阵面的干扰,产生的颗粒(P)波具有现在的振幅大大小于环绕时,中性密度施加涂层。净效果是变换将样品注入引入的振幅(强度)出射的光从图像平面的差异的相对相差。因为人眼解释密度差异,如对比度,试样在显微镜目镜中可见,在胶片上与传统的摄像系统,或数字,利用CCD或CMOS的移动设备也可以被捕获。所有相衬系统选择性地推进线性环绕(S的相位波前的球面衍射(D)波前另外,相衬阻碍环绕相对于试样衍射光波的波阵面。

在一般情况下,试样具有更高的折射率比周围介质的中性灰色的背景上出现暗的,而那些具有比泳​​介质的折射率低的试样比灰色的背景看起来更亮。然而,这并不是总是如此,因为专门相衬物镜,具有较高的耦合,以较低的延迟值(八分之一波长或更小)的中性密度可以制作较厚的标本对比度反转。最终的结果是,具有很高的光程差的地区开始出现明亮。

为了修改的空间上分离的环绕声和衍射相位对比光学系统的波阵面的相位和振幅,相位板配置了一些已被引入。由于相板位于或非常接近的物镜的后侧焦点面(衍射面)通过显微镜的所有光通过该组件必须穿过。聚焦聚光镜的环形带的相位板的部分被称为共轭区域,而其余区域被统称为互补区域的共轭区域包含的材料负责改变环绕(未衍射)光无论是加或减90度的衍射波前的相位。在一般情况下,相板共轭区域宽比聚光镜的环形带的图像,以尽量减少环绕光的量,进入的互补区域扩大的区域中(约25%)。

一个典型的系列相衬物镜,有越来越多的放大倍率,及其相应的聚光镜年轮,如图5所示。作为一般规则,当物镜的数值孔径,倍率增大时的相位板的宽度和直径都下降。与此相反,聚光镜的环尺寸的增大物镜放大倍率。此外,图5中所示剖切表示正和负的相位板的施工背后的基本概念。正相位板产生暗的对比度而包含部分吸收膜的设计,以减少环绕波阵面的振幅。此外,该板包含设计转向90度(延缓)的衍射光的相位相阻燃材料。负相位板还包含两个相阻燃,部分吸收材料。然而,在这种情况下,两种材料被夹内未衍射环绕的波前的相位板,使影响(衰减和相位滞后90度)是唯一的物种。

从现代显微镜制造商提供的相差板是通过真空沉积在玻璃板上或直接到一个显微镜物镜的透镜内表面的薄的介电和金属膜。电介质薄膜中的作用是把光的相位,而金属膜未衍射的光强度衰减。一些制造商利用多个抗反射涂层与薄膜结合,以减少眩光量和光学系统的杂散光反射回。如果相位板的透镜的表面上未形成的,它通常是凝成位于附近的物镜的后侧焦点面之间的连续镜头。的厚度和折射率的电介质,金属,和防反射膜以及水泥的光学,仔细选择,以产生所需的相移的相位板之间的互补性和共轭的区域。在光学术语,改变环绕的光的相位相对于衍射光的相位板90度(或正或负)被称为四分之一波长板,因为它们的光程差的影响。

对比度是通过改变相位板的属性,包括金属膜(防反射涂层),相阻燃材料的折射率,和的相位板的厚度的吸收调制。几个显微镜制造商提供的各种相衬物镜有进步程度的对比。例如,尼康阵容包括五种类型的相衬物镜。DL暗低)系列物镜一个浅灰色的背景上产生暗的图像轮廓。这些物镜是设计,提交阳性对照标本折射率从周围介质中,例如组织培养细胞具有显着差异。对比版本略低的物镜,的DLL暗低),产生更好的图像明照明做的DL物镜相比,被用作一个普遍的物镜进行联合观测荧光,明,暗场,微分干涉对比。

尼康也产生包含一个辅助的中性密度环,设计,减少晕工件,任一侧上的中心相环切趾相衬物镜。标本具有非常小的相差是尼康的DM)正相衬物镜,一个中型的灰色背景上产生一个黑暗的图像轮廓成像的理想人选对于负相位对比,尼康提供的BM明亮的中等)的物镜,这是特别适合于视觉检验,细菌鞭毛,原生动物,血纤维蛋白纤维,分钟球,和血细胞。明亮的介质相衬物镜上产生明亮的图像中灰色背景。

在大多数情况下,仅仅推进单独环绕的波前的相对相位是不足以导致在显微镜的产生高对比度的图像。会出现这种情况,因为环绕波的振幅显着大于衍射波,并抑制所产生的图像创建的干扰,只有一小部分的总的波数。通过应用一个半透明金属(中性,不透明度增加,以减少环绕的波阵面的振幅值接近(和执行在图像平面上的干扰)的衍射波,在物镜的相位板密度)涂层。环绕光波,通过在相衬显微镜的设计几乎完全通过相差板,在幅度上显着地降低到一个值,该值取值范围的原始强度的10%和30%之间的不透明的相位板。

在图6中的相位板的配置,波的关系,图和矢量图的生成相关联的正面和负面的相衬图像。此外,也说明了这些技术的标本成像的例子。正如前面所讨论的,刚刚从试样平面的衍射光的球面波前 ​​平面环绕(未衍射)的波阵面的相位相对于四分之一波长延迟。在正相位对比光学配置(在图6中的上排图像),环绕声(S)的波阵面的相位超前遍历的相位板产生的净相移180度(半个波长时,由四分之一波长)。先进的环绕的波阵面是现在能够参与在与上面的中间图像平面的衍射D相消干涉

正相衬的概述在图6的上部。正相衬板(图6的左手侧)推进环绕波的玻璃板中,减少了由波的物理路径,通过在高折射率板的蚀刻环由于四分之一波长。由于试样射线衍射(ð波)延迟四分之一波长与试样进行交互时,环绕波和衍射波的相位板出现时之间的光程差是半波长。最终的结果是一个180度的环绕波和衍射波,从而导致破坏性的干扰,在图像平面上的高折射率试样之间的光程差。正相衬的破坏性干扰波的振幅谱中描绘了图6中上部的曲线中。所得到的颗粒(P的振幅波低于环绕(S)波,使对象出现的相对比背景暗的,在最右边(POS的的图像Zygnema绿藻所示示出的矢量图提高环绕声波的四分之一波长,这是作为一个90度逆时针旋转在正相位对比所示,该图并在图6中的图像之间的显示。

它也有可能产生负相衬显微镜的光学系统,在图6的下部所示。在这种情况下,环绕声(S)波延迟(而不是作为先进的)由四分之一波长相的衍射D)。其结果是,具有高折射率的标本对较暗的灰色背景显得明亮(查看该图像标记在图6的下部,NEG)。在负相位对比,物镜相位板包含提升的环环绕波的四分之一波长相对的衍射波的相位延迟的相位的零级(而不是正相衬提前相位)。由于衍射波已经被延迟四分之一波长时,通过试样,环绕波和衍射波之间的光程差被消除,并且在图像平面上的高折射率试样发生相长干涉。请注意,生成的颗粒(P)波的幅度高于负相衬环绕(S)波(参见图6中的下面的图)。图中还示出的向量图,为负相位对比,,环绕波矢经过一个90度的顺时针方向旋转。

重要的是要注意,上面的物镜的后侧焦点面所形成的衍射图案偏离和相衬和所有其他形式的光学显微镜中的试样散射的所有空间频率的傅里叶变换。因此,在中间像平面和通过目镜观察到最终的图像(或记录,可通过检测器)产生的图像表示傅立叶逆变换的衍射图案形成在物镜后侧焦点面和眼点(浮在上面的目镜前镜头)。相衬显微镜利用这些光学共轭性质的增强图像的对比度,通过修改显微镜的光圈功能引入的特定图像信息的空间过滤介绍的相位板(过滤器)的物镜后部衍射平面使试样的相位变化转换为强度变化,可以观察到在最终图像中。

解读相位对比图像

用相差显微镜产生的图像是比较简单的解释,当试样很薄,并且均匀地分布在基片上(作为单层组织培养中生长的活细胞中的情况下)。检查使用正相的光学对比度,这是传统的形式,大多数制造商所生产的薄样品时,它们会出现暗于周围介质中,当试样的折射率超过介质。差分相位对比光学边缘附近的周边扩展的标本,如蜂窝之间的边界膜和洗澡的营养培养基中,增强对比度和产生整体高对比度的图像,可以粗略地解释为密度图。因为相衬的标本图像的振幅和强度相关的折射率和光路长度,图象密度可利用作为衡量各种结构之间的关系进行近似。效果,具有密度增加了一系列的内部细胞器,如空泡,间期细胞核,细胞质和细胞核(或有丝分裂的染色体),通常是可视化逐渐变暗相对于一个固定的参考对象,如背景。还应当指出的是,众多的光学构件是存在于所有的相衬图像,大扩展标本往往会出现显着的波动,在对比度和图像强度。对称也可以决定如何大型和小型的标本出现在相衬显微镜的一个重要因素。

理智的解释相衬图像需要仔细推敲和检查,以确保工件不错误地分配到重要的结构特征。例如,内部的一些细胞器和组件通常具有较低的折射率比周围的细胞质中,而另一些具有较高的折射率。因为这些众多的细胞内结构呈现不同的折射率,内部的活细胞,在积极相衬显微镜观看时,可以揭示一个数组的强度,范围从非常明亮的极暗。例如,吞饮小泡,脂滴,和空中液泡存在于植物和单细胞原生动物比细胞质具有低的折射率,因此显得比其他元件更明亮。相反,如上面所讨论的,具有高折射率的细胞器(细胞核,核糖体,线粒体,核仁)出现在显微镜暗。如果试样引入的相位延迟足够大(约半波长的衍射波的相移)的衍射波和环绕波之间的干扰变得建设性的,使这些标本的亮度比周围的背景。

为了避免混乱,相衬图像的亮区和暗的对比,光程差内发生的试样制备应慎重考虑。如上所讨论的,光程差是来自于商品的折射率和检体(对象)的厚度,和相关的检体之间的相对相移和背景(衍射和环绕)波。这是不可能区分高,低折射率部件,没有相关的信息的组件的相对厚度在相衬图像。例如,一个小的检体具有高的折射率,可以显示更大范围内的试样具有较低的折射率相同的光学路径差。的两个试件,将具有大致相同的强度时,通过相位对比光学系统。在许多生物实验,产生收缩或膨胀的细胞或细胞器的条件,可能会导致显着的对比度变化。外部介质也可以被替换为另一个具有较高或较低的折射率,在试样图像的对比度的变化来产生。事实上,在周围介质的折射率变化形成的图像的对比度的效果的基础上的技术被称为浸没折光率

图7中几个半透明的标本有正面和负面的阶段对比度光学系统成像。图7(a)和7(b)示出一个栉鱼鳞,在正相位对比(图7(a))和负相位对比(图7的(b)),在相对 ​​较高的倍率(200倍)。这些尺度通常发现在大多数的硬骨鱼类(简称为硬骨鱼类)。前(或前面)的一部分,每一个规模通常藏后面的后部,前述的规模。随着鱼的生长,这样做的尺度,导致图案的同心生长“环”规模大小的数量增加,出现类似树干的横截面中发现的那些。在某些情况下,栉鳞生长型态用于判断鱼的年龄。年轮出现黑暗包围的浅灰色晕地区正相衬(图7(a)),但呈现轻得多,四周暗槽与负相衬(图7(b))。

甲文化活的中国仓鼠卵巢细胞在明照明模式下显示为透明的时沐浴在生长培养基中,细胞的折射率,这是非常接近的营养盐缓冲液。正相衬(图7(C)),细胞内部的细节,包括细胞核和细胞器,可以很容易地可视化。然而,当负相衬照明下检查,细胞轮廓变得难以分辨,内部细节很大程度上掩盖除高折射率变得非常明亮的细胞器(图7(D))。最后,人类红细胞出现暗灰色的扁椭球一个的甜甜圈轮廓和明亮的中心正相衬(图7(E)),但相同的细胞是光明与黑暗的中心(图7(f)条),并脱颖而出大幅在负相衬的背景。

两个非常常见的效果相衬图像的特征关闭阴影对比度型态中,所观察到的强度不直接对应于检体和周围介质之间的光程差(折射率和厚度值)。虽然这些模式的出现的相位对比光学系统的自然结果,它们通常被称为相位工件或图像失真。在各种形式的正相衬,明亮的阶段晕通常环绕大型标本的功能和媒体之间的界限。出现相同的光晕比负相衬光学系统试样的暗。这些效果是由光程差的波动,可以把黑暗中明亮的光晕正相衬,负相衬亮暗晕进一步加剧。

晕圈出现在相衬显微镜,因为圆形的相阻燃(中性密度)环位于在物镜相位板也从试样的衍射光(它并非只限于单独通过环绕波)发送一个小的程度。的事实,使问题更为复杂的零级的环绕波阵面的相位板投射到聚光镜的环形带的宽度小于相板环的实际宽度。的差异的相位板环和环绕的波阵面之间的宽度通常是大约25%到40%,但是必要的,由于光学设计上的限制和要求的。由于在物镜的衍射面,只有那些对应的低空间频率衍射的相位板的环形试样通过的波阵面的相位改变环的圆形的空间位置。因此,衍射标本的波通过相板保持90度(四分之一波长)的零阶(不偏离或环绕)光相。由此产生的相衬卤代工件由于衍射试样通过一个非常浅的角度相对于环绕的零级波前的低空间频率信息的衰减。实际上,低空间频率的波阵面的衍射试样之间的破坏性干涉的情况下不偏离的光波产生一个试样周围的局部对比度反转(表现由卤素)。为了创建一个锋利的边缘图像中,所有的空间频率衍射试样必须在最终图像中表示。

 

相衬光环围绕着一个大型,低空间频率的物体,如细胞核,硅藻,整个细胞中表现得尤为突出和明显的。卤代工件的另一个因素是在图像平面上的光能量的再分配,从区域是破坏性的区域建设性。大的,高对比度的光晕产生混乱的图像产生大的光程差,如红细胞,霉菌,酵母,原生动物细胞,细菌的样品。另一方面,卤素效果往往可以强调对比度的差异的试样和其周围的背景,并可以增加薄的边的可见性和边界的细节在许多标本。这种效果是特别有用的在负的相位相反,其产生的暗晕周围的低频图像的细节。在许多情况下,能够减少相移的程度和衍射,从而减少晕圈的大小试样周围。用于除去或衰减强度的晕的最简单的补救办法是修改的观察介质的折射率具有更高折射率的组件,如甘油,甘露糖醇,葡聚糖,或血清白蛋白。在某些情况下,改变折射率的介质,甚至可以产生逆转图像对比度,转向暗标本的功能亮点不显着令人不安的背景强度。

光环效应,也可以显着降低,利用专门设计的阶段物镜,包含中性密度材料围绕中央相环材料的物镜后孔附近的一个小环。这些物镜被称为切趾相衬物镜,使结构的阶段具有很大的相差异,具有出色的清晰度和细节的定义来看待和拍摄对象。在大多数情况下,可以清楚地分辨细胞内的功能(如核仁)具有明暗反差变迹的物镜,但这些相同的功能,有明亮的光晕或为亮点,使用传统的光学相衬成像。与变迹的光学系统,对比度是相反的,由于相对于试样的直接光通过的大振幅的绕射光。

在实践中,卤代减少和增加与变迹光学系统的标本的对比,可以实现通过利用选择性振幅相邻建立到物镜的相位板上面的后侧焦点面上的相位膜的过滤器。这些振幅滤波器包括中性密度施加到周围的相位膜的相位板的薄膜。在经典的相位板的透射率的相移环是约25%,而对周围的相邻环的相移圈中的切趾板有50%的透射率的中性密度。在这两个板的相位膜的宽度是相同的。这些值是一致的相移的透射率值的薄膜适用于标准板在相衬显微镜。

关闭阴影相衬显微镜的光学神器是另一种非常常见的,往往是最容易观察到大型,扩展阶段标本。它通常会被预期会出现一个大的形象相试样具有恒定的光路长度横跨直径均匀或深或浅,在显微镜。不幸的是,用相衬显微镜所产生的图像的强度并不总是承受一个简单的线性关系,由试样产生的光程差。其他因素,如吸收的相位板和相位延迟或提高量,以及相对的相位板和聚光镜的环形带的重叠大小也发挥了关键作用。大,厚度均匀的正位相对比试样的强度分布往往从边缘逐渐增加光的强度在中部地区的中心,在那里可以接近周围介质(相反的是真正的负相标本)。这种效应被称为阴影关闭,并经常观察研究扩展平面的标本,如材料板材(玻璃或云母),副本,扁平的组织培养细胞和大细胞器时。

正面和负面的相衬的卤素和浓淡销工件的影响列于图8为一个假设的扩展的相位检体具有矩形几何形状和较高的折射率比周围介质中(图8(a))。记录整个试样的中央区域上的光强分布图8(b)中示出。正相衬(图8(C)),标本图像呈现出独特的耀眼光环,并演示了一个戏剧性的树荫效果,这是遍历时表现逐步增加强度试样从边缘到中部地区(见强度分布在图8(d)段)。的光环和阴影关闭效果已经扭转负相衬(图8(e)及8(f)条)的强度。一个黑暗的光环围绕着标本图像查看时负相衬光学(图8(E)),和树荫过渡范围从明亮边缘的中心暗灰色的水平。此外,在强度分布图(图8(f)条)是相反的,从与正相位对比观察。

树荫下脱落的现象也通常被称为区域行动的效果,在试样厚度均匀,因为中央区衍射光不同于高折射率区边缘和界限。在中央区域的一个标本的相对角度和衍射光的量显着减少时相比,边缘。源于中央的试样区域的衍射波阵面,因为只有轻微的空间偏离的零级非偏离的的环绕波阵面(但仍然是由四分之一波长的相位滞后),它们被捕获的物镜后方的相位板焦平面,以及与环绕光。其结果是,试样的中心区域的强度基本上保持相同的背景。外观遮荫的影响在相对 ​​平坦的标本地区,边缘和界限产生过高的对比度,提供了强有力的证据表明相衬机制主要是受合并衍射和散射现象。

光环和阴影销文物依赖于几何和光学特性的相板和被检查的标本。的宽度和相位板的透射率的材料特别是,在控制这些效果(相差板的宽度通常是十分之一左右的总开口面积的物镜)发挥了关键作用。更广泛的相位板具有降低透光率,往往会产生较高的强度光晕和树荫,而环的直径有一个较小的影响,这些影响。相对于一个特定的物镜(或正或负)的光程差和试样的大小,形状和结构有显着影响的严重程度的卤素和阴影的影响。此外,这些影响是严重影响物镜,放大倍率较低,产生更好的图像。

结论

相衬是一个极好的方法用于增强薄的,透明的标本对比度而不损失分辨率,并已被证明是一个有价值的工具的研究在活细胞中的动态事件。此前引进相对比度光学系统,电池和其他半透明的标本进行呈现在明显微镜可见的由人工染色技术。虽然这些标本可以被观察和记录与暗场和斜照明,或散焦明场显微镜,这种方法已被证明是不可靠的细胞结构和功能提供关键信息。

相衬的技术被广泛应用于生物和医学研究,尤其是在整个领域的细胞学和组织学。因此,该方法被用来研究活细胞,组织,并在光照下是透明的微生物。相衬使内部的细胞成分,如膜,细胞核,线粒体,主轴,有丝分裂器,染色体,高尔基体,和来自植物和动物的细胞和组织容易地可视化的胞质颗粒。此外,相衬显微镜被广泛采用在诊断肿瘤细胞的生长,动力学,和行为的各种各样的活细胞培养。专业长工作距离相衬光学系统已经开发倒置显微镜组织文化调查。相衬观察的好处是血液学,病毒学,细菌学,寄生虫学,古生物学,海洋生物学在生物领域的其他地区。

相衬的工业和化学应用包括矿物学,结晶学,聚合物形态调查。无色微晶粉末,颗粒状固体,结晶性聚合物,具有只有轻微的环绕浸没液体的折射率不同,往往容易被使用相差显微镜观察。事实上,定量折光率往往利用取得的折射率值,用于识别物镜。相位对比光学技术审议的其他的商业产品包括粘土,油脂,油,肥皂,涂料,颜料,食品,药品,纺织品,纤维和其他纤维。

入射光相衬显微镜,虽然在很大程度上取代了微分干涉对比技术,用于检查的表面,包括集成电路,晶体位错,缺陷和光刻。一个很好的例子是在硅外延片,半导体产业有巨大的意义堆垛层错。在反射光中的相衬系统中的照明的环形带,一个图像被投射到的物镜,其中的相位板通常位于后侧焦点面。此外,该相位板的位置不在物镜之内,但由一个辅助的透镜系统,以避免所产生的相位板的反射和散射而形成的后焦平面的图像。应当指出,在反射光的相差显微镜,相差从救济产生的试样表面上,而不是试样内的相梯度。

减少的光环和阴影关闭文物仍然是一个主要关注相衬显微镜。变迹相位板是用于减少严重晕,和专门的可变相位对比系统,可以微调,以控制这些影响,以优化图像质量和技术所获得的信息的保真度。发展先进的相衬系统提供精确的测量相标本具有大光路的差异,以及与其他的对比度增强技术的结合观测也有相当大的兴趣。特别相衬往往利用荧光成像,荧光团确定的位置,并有望增强对比度,在光学显微镜。