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尼康显微镜,标本的准备和图像

2013-10-28  发布者:admin 

大部分来自那些已经过多年开发与传统的宽视场显微镜使用的程序准备和共聚焦显微镜成像标本。 在开发一个新协议标本共聚焦显微镜成像最好的办法是开始与一个已知是适合传统的显微镜,并根据需要修改它。

无论协议的试样制备,共聚焦显微镜进行的方式所产生的一个主要好处是在图像显示和分析的结果,从多个图像的同时采集到计算机中,以数字形式的灵活性。 这在下面更详细讨论的,但一个优雅的例子在图1中,一个三元组标记的果蝇胚上面的蜂窝胚盘阶段的图像显示的可能性。 该标本的免疫荧光抗体标记的三种不同的蛋白质。 后三个对应的图像的红色,绿色和蓝色通道的共聚焦系统中,收集的图像可以被重新排列,通过将它们复制到不同的通道。 通过评估从合并的三个,最有效的颜色示出的各种蛋白质结构域的信道分配产生的图像被选择。图1给出了合并后的三通道图像(组合红色,绿色和蓝色通道)。

已证明是成功的,在传统的宽视场光学显微镜标本制备的一种方法,特别针对减少聚焦荧光的量,因为这将产生图像中的喇叭形,大大降低了分辨率的功能还。 由于共焦方法所实现的光学切片,共聚焦显微镜相比,传统的落射荧光显微镜undersamples在厚的样品的荧光。 其结果是,样品可能需要增加染色时间,着色剂的浓度进行共焦分析,如果在常规的显微镜评估,可能会超过被污染的。

虽然在典型的激光扫描共聚焦系统中的照明似乎是极其明亮的,在任何给定的点在试样上的平均照度相对温和,由于这样的事实,多点每秒扫描。 在一个典型的1.6微秒的每一个点的扫描速度,在任何给定的点的实际的照明一般小于在传统的宽视场落射荧光显微镜。 它通常是最好用最低的实用的激光功率,为了保护荧光成像。 虽然许多协议包括antibleaching的代理,防止褪色的荧光物种,可能并不需要这样的添加剂与许多更现代的共聚焦工具。

共聚焦显微镜的主要优点和应用更厚的试样是在改进的成像能力,虽然成功试样的特定属性可以是有限的。 若干试样的最小物理要求适用,它必须适应上的显微镜载物台,和感兴趣的区域必须是能够被放置在所述物镜的工作距离范围内。 在某些情况下,分辨率可能受到损害,以容纳一个标本,以避免损坏或物镜。 例如,可以具有一个高分辨率的镜头,如60倍的数值孔径为1.4的工作距离为170微米,而20倍(具有典型的数值孔径为0.75),可以提供一个相对较大的660微米的工作距离,与能够访问更多的禁区的标本,没有实物形态的干扰。

的试样,具有三维结构,该结构是用共聚焦显微镜研究,有可安装在这样一种方式,以保持结构。 某种形式的隔离物,如渔线或盖玻片一块,通常放在载玻片和盖玻片之间,以避免变形的试样。 当活体标本的研究,它通常是必要的,将它们安装在一个腔室,可提供对生命的所有必要的要求,也将允许通过物镜的图像所需的区域的足够的访问。

物镜参数和光学部分的厚度

客观 针孔
放大 NA 封闭(1毫米) 打开(7毫米)
60X 1.40 0.4 1.9
40倍 1.30 0.6 3.3
40倍 0.55 1.4 4.3
25倍 0.80 1.4 7.8
4倍 0.20 20.0 100.0

表1

试样属性,会影响,如不透明度和浊度,透光性,可以极大地影响到试样中的激光束的穿透深度,因此结构可以成像。 未定影的和未染色的眼睛的角膜上皮细胞,例如,是相对透明的激光束穿透到约200微米的深度。 与此相反,未定影的皮肤相对不透明的散射光,限制了激光穿透至约10微米。 许多固定的协议,旨在提高组织的透明度,包括某种形式的结算代理。

如果无法实现足够的激光穿透整个安装试样,厚的部分可以用切片机切割。 通常使用固定的组织切片,但vibratome的组织(如活脑)中已经减少了,并成功地成像。 为了获得部分安装的部位较深,可以从幻灯片中取出试样,反转它,并重新安装它,但是这通常不是很成功。从检体的深部的图像,可以通过以下方式获得使用被激发的染料,在较长的波长(例如花青5),相对于那些需要更短的波长的激发。 然而,使用较长波长的照明,将略微减少相比,在更短的波长获得的图像,可以实现的最大分辨率。 出于类似的原因,多光子成像技术允许从更深的层次内的标本(由于采用红光激发)收集的图像。

物镜

对于共焦显微镜的研究中,所使用的物镜的选择是极其重要的,作为聚光的能力的透镜,作为其数值孔径,测量的分辨率和光学部分的厚度的一个决定因素。 持有其他显微镜变量的常数,物镜的数值孔径越高,越薄的光学部分。 作为在一个特定的仪器,使用60倍的光学部分的厚度设定在1mm针孔的直径是约0.4微米,并与16倍(0.5)透镜的数值孔径(数值孔径为1.4)的目标,具有相同的1 - 毫米针孔,切片厚度为1.8毫米的顺序。 通过打开较大直径的针孔,光学部分的厚度可以增加。 表1给出了各种客观镜头的光学部分的厚度值(微米),在两个不同的针孔直径为物流及供应链管理应用技术研发中心的一个模型。 图像分辨率始终是较差的垂直比水平。 例如,使用60倍,1.4的数值孔径,物镜的水平分辨率是约0.2微米,约0.5微米的垂直分辨率。 场的平整度和色差物镜选择时要考虑额外的镜头特性。 色像差校正的程度是特别重要的成像时,在不同的波长的多标记标本。

物镜分辨率最高的,有能力的,一般是那些具有最高的放大倍率和数值孔径最高。 它们也是最昂贵的,所以往往是由扫描试样的区域和该区域中,可以实现的最大分辨率之间的一个折衷办法。 如果成像昆虫的胚胎和成虫磁盘的,例如,4倍的透镜可能被用于定位试样在幻灯片上,16倍(数值孔径为0.5)镜头成像的整个胚胎,和40倍(数值孔径为1.2)或60倍(数值孔径为1.4)镜头为解决个别细胞核内胚胎或成虫磁盘。 4倍的镜头对于成像较大的组织,如蝴蝶成虫磁盘的,将有助于整个翼磁盘,和解决单个细胞的40倍或60倍的。 图2(a)示出了使用了4倍的目标取得整个蝴蝶五龄翼成虫盘的整体图,和16倍的透镜(图2(b))所提供的额外核的细节。 可以结合高分辨率和大图像视野的一种方式是从邻近地区获得许多图像,并结合成蒙太奇数字。 有些显微镜自动化XY阶段,可以设置走动标本和收集多个图像到大面积的蒙太奇。

大多数LSCMs有特征的更有用的功能之一是能够进行放大的图像,使用相同的物镜,不丧失决议。 此功能是简单地通过降低由激光扫描试样的面积,通过扫描镜的控制,同时保持相同的图像的显示尺寸或存储器存储阵列大小,有效地增加放大倍率。 这样,多个放大倍数不干扰样品或参考点的视场中的丢失的情况下实现与单透镜。 然而,在可能的情况下,更高的数值孔径的透镜应可以使用,以达到最高的清晰度,而使用较低的数值孔径的透镜的变焦比。的能力的单透镜(40倍)放大示出图2中的(cf)。 的数字显示面板(C)40倍的目标(比16x的图(b))提供额外的核细节。 面板(d)到(f)是通过以下方式获得相同的累进透镜,通过减少在试样上的扫描区域40倍变焦的图像。

共聚焦仪器设计有一些限制聚焦的光到达检测器的一个可调节的针孔。 打开较大直径的针孔产生更厚的光学部分和降低分辨率,但往往是必要的,以包括更多的标本细节或增加撞击检测器的光。 由于针孔的关闭(缩径),光学部分的厚度和亮度降低。 分辨率的提高,直至达到目标的最小的针孔直径,超过该分辨率不增加,但亮度继续减小。 在此条件下达到的针孔直径为每个物镜是不同的。

共聚焦成像探头

共焦仪器的发展继续影响力,又能受到新的荧光探针的合成,提高免疫定位。 荧光染料被引入,有更密切地相匹配的由激光器产生的波长与大多数商业LSCMs供给的激发和发射光谱。不断发展改进的探头,可以结合目前的研究兴趣抗体。 的花青染料组作为一个例子,作为替代品其他历史悠久染料的开发,作为一个美好的替代罗丹明菁3,找到越来越多地使用在三重品牌战略菁5。

荧光原位杂交(FISH)探针检测分辨率和灵敏度方面具有优势进一步增强时与激光扫描共聚焦显微镜,成像荧光标记的DNA和RNA序列在细胞中的分布是一个有价值的方法。 此外,明亮的荧光探针,目前可用于在两个原子核和孤立的染色体总DNA的激光共聚焦显微镜成像。

大量荧光探针可结合在相对简单的协议,当目标的细胞器和结构,特别是染色。 可用探针之间的过多的染料,的标签细胞核,高尔基体,内质网和线粒体,染料如荧光标记的phalloidins,目标聚合的肌动蛋白在细胞中。 这种染料是非常有用的,在多个标签的方法来定位感兴趣的抗原在细胞中具有特定的隔间。 例如,图3给出了就业相结合的鬼笔环肽和核染料(TOPRO)的蝴蝶蛹翼成虫磁盘应用到整个坐骑在三重标签计划与相应的抗原。 图3(a)所示,鬼笔可以用来强调在发展组织的细胞轮廓,与周边肌动蛋白小梁被标记为明亮的荧光环。面板(B)的数字说明了戏剧性的特异性核染料标记只是一个细胞成分。 除了本细胞区室的标记策略,可以有益地包括已知的分布或功能的细胞(例如抗微管蛋白)的蛋白质的抗体在多标记研究。

如果活细胞成像,关键是要认识到系统中添加荧光染料的效果。 这些探头可以活细胞毒性,尤其是当他们用激光激发。 毒性的影响降低到细胞培养基中添加抗坏血酸在一些准备协议。在成像过程中的特定的被标记的细胞成分,可能会影响细胞的生存能力。 例如,细胞核的污渍通常有更多的有害影响比细胞质染色。 探头可以区分活细胞和死细胞(其中,吖啶橙),在成像过程中,可用于检测细胞活力。 大多数这样的检测方法是基于的前提时,死细胞的膜是可渗透的许多材料,如染料,这是不能穿透生活状态。

萤光-3和RHOD-2已被合成,改变自己的某些离子,如钙离子的存在下的荧光特性的染料的例子。 新的探针已被开发用于成像基因的表达,包括,例如,水母的绿色荧光蛋白(GFP),这使观察体内的基因表达和蛋白质的定位。 GFP的使用,使基因表达的监测,在许多不同类型的细胞,包括起居室果蝇卵母细胞,哺乳动物细胞和植物(使用激光扫描共聚焦显微镜的激发激光的488nm的线)。 GFP用频谱发生变化的突变体可用于在multilabeling实验,并且这些人还发现了用于避免干扰的在生物体组织的自体荧光。

自体荧光

在许多类型的细胞中自然发生的组织的自体荧光,并且可以在成像过程中的背景干扰的主要来源之一。 例如,在酵母和植物细胞中的叶绿素荧光的红色部分的光谱。 某些试剂如戊二醛固定剂,是源的自体荧光,这可以减少用硼氢化钠处理。 有时可避免使用荧光基团,可以是天然的自体荧光的范围内的波长被激发自体荧光。 花青5经常被选用,因为它是在较长波长处,避免了更短的波长的自发荧光激发。

虽然它是最经常考虑的一个问题,组织的自体荧光,可用于成像的整体细胞形态作为的multilabeling研究的一部分。 自发荧光的总荧光的贡献可以评估通过查看未染色标本在不同的波长,并指出黑电平增益的激光功率和PMT设置。 往往可以自体荧光漂白,在高功率激光,或通过泛滥的标本汞灯的光从一个简短的接触。 包括使用更复杂的方法来处理自体荧光时间分辨成像,或利用数字图像处理技术,如图像减法去除。

收录图像

开始共聚焦显微镜的用户可以在几个方面获​​得经验。 显微镜通常由制造商提供的手册包含了一系列必要的程序简单,入门。 大多数多用户设施的主要负责人,操作仪器,可提供定向会议,或者设施经理可能需要有一定的专业水平独奏使用仪器前进行短期培训和示范。 应特别注意支付给该设施的内部规则。 显微镜公司进行的培训课程,从显微镜的工作坊,也可以得到的信息和培训,并从各种出版物。

与实验标本工作之前,至关重要的是要熟悉所涉及的摄像系统的基本操作。 它通常是一个相对容易的标本,而不是一个更困难的实验之一,有利于新手开始试成像。 一些更好的测试样品包括纸浸在一个或更多的荧光染料或荧光珠的制备。 这两种类型的试样是明亮的荧光和共聚焦系统的图像比较容易。 另一个出色的样品表现出的自体荧光在许多不同波长的混合花粉的幻灯片。 这些可以容易地制备园林植物花粉,或可从商业供应商的生物样本。 同时,相同的光电倍增管的黑电平,增益,和针孔的直径设置在图4中的花粉粒图像采集,但揭示了三种类型的花粉,每个荧光在不同的激发波长。 这些标本作为测试对象是有价值的,因为他们不仅有一些有趣的表面细节,还能保持其性能相对较好时,接触到的激光束。 活体组织标本制备洋葱上皮或水植物伊乐藻的试验。 是可靠的,可以使用自体荧光或与染剂DiOC6染色。

聚焦仪器在尝试成像之前,应设置尽可能最佳的性能。 这需要最优比对,特别是当一个正在使用的旧的共聚焦显微镜。 使用的校准程序,是非常具体的特定工具,通常是最好的人谁拥有全面负责维护。 在任何情况下,应对准尝试没有适当的训练,从显微镜的所有者和权限。用于尝试对准的程序不当可导致完全丧失的光束,一些仪器的情况下,可以要求上门服务,以纠正。

共焦系统是基于传统的光学仪器,光学显微镜的基本程序和惯例,在任何时候,应遵循。 这是非常重要的,在光路中的所有玻璃表面清洁,因为灰尘,油污,或润滑脂,载玻片,盖玻片,物镜图像不佳的主要原因。 在物镜和标本之间的折射率必须是适合于所使用的镜头。 例如,正确的浸油,必须使用对于一个给定的物镜的数值孔径,试件必须被安装成在透镜的工作距离。 盖玻片的厚度必须是正确的,所使用的透镜,特别是对较高的功率目标,要求第1“或”否“,而不是第2号1.5盖玻片。 盖玻片必须密封,以使用合适的培养基中滑动,安装在平坦的。 指甲油可用于固定的标本,如果采取审慎态度,以确保它是干的前成像。 将凡士林,蜂蜡,羊毛脂,或一些其他的无毒密封材料,必须使用与活标本。 经过严格的基本清洁程序在样品制备阶段,可以节省大量的时间和精力。

在聚焦模式下成像的准备,一个地区的利益所在,无论是明场或使用传统的荧光显微镜。 另外,优选使用的共聚焦系统的显微镜做这个调查,但对于新手来找到正确的焦平面单独使用共焦成像模式,它可以是非常困难的。 如果传统的成像模式是不可用的共聚焦系统上,然后结构还可以使用一个单独的荧光显微镜定位,它们的位置标使用的钻石在显微镜上的标记,标记笔,或通过记录的位置坐标从显微镜阶段。 这是特别有用是能够预览与实际的共聚焦系统的显微镜标本,当试图图像一个罕见的现象,如在一个特定的发展阶段表达的基因,在检体可能包含数百个不同年龄的胚胎的。 大量的时间可以以这种方式保存,过有许多标本,使用共焦模式扫描。 共聚焦工具通常有一个低分辨率的快速扫描模式,使得初步扫描更高效。 ,但是,搜索很少发生的事件时,最好的方法是使用传统的显微镜检测模式,然后立即切换到共焦模式下,在相同的显微镜图像收集扫描的幻灯片。

掌握的“秘密”依赖于成功的共焦成像的物镜的数值孔径,针孔的大小,图像的亮度,并使用最低的激光功率可以达到最佳的图像之间的相互作用。 新手用户应该试验用试样和试件几个不同的放大倍数和数值孔径的物镜来获得,然后再尝试成像实验标本的显微镜的能力感改变这些参数。 应使用变焦功能与使用具有更高的数值孔径的目标所得到的共聚焦系统的图像获得的比较。 特定的样品和功能成像,将决定哪些镜头和方法是最合适的。 适合于激光共聚焦显微镜的许多目标的两个例子示于图5。 数字包括一个60x planapochromat的油浸镜头和20倍planfluorite的。 后一目标的调整轴环,它允许利用油,甘油,或水作为液浸介质。

特定的显微镜设置适当的试样应设立相差的主要感兴趣的区域,以避免在有价值区域的试样的荧光物种的光漂白。 这通常需要设置光电倍增管检测器的增益和黑电平与​​针孔的大小,以获得可接受的分辨率和足够的对比度之间的最佳平衡,使用最低的激光功率,以尽量减少光漂白。 许多仪器利用颜色查找表的设计,以帮助设置正确的动态范围的图像。 这样的表的设计,使最暗的像素,亮度值在零附近,是任意显示为绿色(例如),各路像素的亮度值在255附近在8位系统,会显示为红色。 该显微镜的参数,例如增益,黑电平,和针孔的直径,调整,以便有只有少数绿色和红色的像素在图像中,确保利用从0到255的全部动态范围,但很少截止亮度范围的任一端。 虽然这些调整,可通过肉眼,在极端的使用伪彩色成像系统的动态范围,使调整变得较少主观。 在某些情况下,图像必须被收集以低于全动态范围的系统,因为必须使用小于最佳激光功率或检体有不均匀的荧光,导致掩盖感兴趣的帧中的调光区域的明亮区域。

在扫描过程中的检体的图像的平均例程,通常采用降低随机噪声的检测系统,并加强固定(非随机的)图像中的特征。 一种图像均衡算法可以应用于后采集的图像缩放它们的全动态范围的显示。 应小心,要应用此不同的例程如果施加均衡例程之前,除非在控制图像被包含在同一帧中作为实验用图像进行荧光强度的测量。 在使用任何类型的图像处理程序,它是一个很好的策略,以节省任何处理的原始未处理的图像。

图像采集通常的策略是将图像保存到共聚焦系统的计算机的硬盘上,以后将它们备份到其他大容量存储设备。 一般来说,它始终是最好,显微镜会话期间尽可能收集尽可能多的图像,并放弃不必要的,在以后的审查。 许多似乎是不必要的图像,首先考虑进一步审查后,在以后的日子(尤其是与同侪)变得非常有价值。 如果它似乎浪费看似多余的图像,考虑它更难准备另一标本,更难重现精确的实验条件,或什至完全复制的样品制备协议。

成像开始之前,应制定的策略标记图像文件信息的方式。 在成像过程中,许多票据应采取或随着图像添加到图像文件中,如果这种能力是可以使用的系统。 应该做的测试,以确保访问任何保存的信息是保存图像后,牢记时,它随后被转移到NIH图像或Adobe Photoshop的图像编辑程序,如文本和图像相关的其他信息,可能会丢失其他电脑。 一个组织良好的笔记本电脑或笔记本电脑上的文件可能会优于其他方式记录成像会话的详细信息,并应包括文件名,注释和细节的目的和任何用于允许在稍后的日期计算比例尺的缩放因子。 ,大多数聚焦系统不自动记录使用的物镜,这个信息是非常重要的用于计算字段宽度和后出版的比例尺。 许多现代系统利用图像数据库的组织的文件的文件名和位置,通常会显示图像文件的缩略图。 必须小心,按照图像的命名系统所施加的限制,如允许在文件名中的字符和句点或空格字符,如是否可能被误解的软件。

故障排除

任何实验学科,协议已经产生了良好的效果有时会莫名其妙地停止工作。 共聚焦成像实验,当发生这种情况,有可能是初始反射怪的工具,而不是标本,但应进行测试,以确认该标本进行任何故障诊断仪器上开始之前没有过错。 一个很好的第一次测试是在传统的落射荧光显微镜查看样本。 如果某些荧光是肉眼可见的,功能正常的共聚焦系统的信号应该是非常光明的。 经确认,荧光标本中存在,然后做一些测试的共聚焦系统使用已知的试验片,而不是实验。 为便于参考,在共焦系统应该有一个数字文件访问的用户的显微镜,包括其收集的所有参数,如激光功率,针孔的直径,物镜和变焦值和增益的测试试样的图像,并黑电平检测器。

如果初步测试不提供明确的解决方案,它是最好的专家谁可能遇到的问题以寻求帮助。 作为一项规则,如果用户是不知道的东西,它是最好的,他们退后一步,并寻求帮助,然后再尝试任何补救措施。 共聚焦显微镜的所有公司提供的热线电话和提供额外的帮助,可以访问网站。

被跟踪的制备协议的问题,通常所造成的降解的试剂,并通过进行一系列的诊断测试,应检查。它通常是最好的人做实验,以弥补自己的试剂,或至少要取得他们的信任的同事。抗体应分配的冷冻小批量的股票,然后将其存储在冷藏条件下,不应该被重复使用,除非绝对必要的。有时稀有或昂贵的试剂,这是不可避免的,通常不会出现问题。

出血在多标记标本的实验中,通过从一个通道到另一个可以作为试样本身,或由于显微镜的问题的性质的结果发生。在文献中,应征询发布评论流血通过和可能的补救措施的原因的详细信息。一个很好的测试仪器本身涉及成像试验样品与已知的流血通过属性,同时使用多个标签和单标签设置。在测试样品的图像应与所有相关的显微镜设置的记录一起存储,这样,当问题发生时的试验片可以重新与存储的记录,可被称为当仪器相比具有相同的仪器条件和图像成像最佳运行状态。

当问题出现时,可以用其他的测试包括激光照明的颜色的激光的阳极电压的检查,目视检查。如果,例如,氪/氩激光的光束扫描上的多个标签设置时,呈蓝色,而不是白色,那么这可能表明红线弱。在这种情况下,阳极电压可能会过高,通常可以通过调整反射镜的激光减少到可接受的水平。这种调整应该做的,或监督人负责维持共聚焦系统。如果电压不能被带入一个可接受的范围内,可能需要替换为激光。

中可能遇到的另一个问题是,抗体探针可以具有降低或需要进行再纯化,或以其他方式清洗。已准备了一段时间的试样,有可能发展增加背景荧光和由分离的第二抗体的荧光染料扩散到周围组织中引起渗色。 如果可能的话,影像应新鲜制备的标本。 有时候,改变浓度和/或荧光染料的分布,将有助于减轻问题。 作为一个例子,荧光素可能出血到若丹明通道,可以切换成使罗丹明上更强的信道。 这样做的理由是,荧光激发光谱有一个尾,重叠和被激发在若丹明波长范围。 在随后的实验中,辅助的浓度可以减少。

图像处理和出版

共聚焦显微镜获得的图像通常保存为数字格式,使他们能够使用共焦系统的一部分提供的专有软件很容易被操纵的计算机中的文件。 的最显着提高的当前LSCMs能力之一是它们的共聚焦图像的显示。 这是非常重要的,因为改进利用共聚焦显微镜成像的价值不大,如果有没有办法有效地显示图像硬拷贝或复制。

最近5年左右前大多数实验室仍在使用传统摄影暗房和化学处理的薄膜和纸张,其最终的硬拷贝图像。 再现彩色图像有特别的困难,因为他们通常由独立的打印机通常很少有想法什么构成正确的色彩平衡的显微印刷和打印质量的成本很高。 要取得现在的硬拷贝图像,图像文件可以导出到一个幻灯片打印机,彩色激光打印机,或出版打印质量的染料升华打印机,直接控制被收购人保持图像特征图像。 可以直接打印照片或幻灯片,视频监视器屏幕,可以在Web上发布和电影序列。

现在大多数期刊都能够接受的数字图像文件的发布,这导致发布的图像质量显着改善。由共聚焦成像系统的图像质量达到现在可以在发表的文章中更忠实地再现。在某些情况下,期刊也使他们的文章可以用CD-ROM,这意味着读者可以访问发布的图像,正是因为他们对那些做研究的共聚焦系统采集时出现。毫不奇怪,图像采集,显示和发布的技术进步现在可以准确地再现图像的原始分辨率和色彩平衡,从理论上说,在低得多的成本向笔者特别有利的情况下,在该刊物上的彩色图像。