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尼康显微镜:共焦反射显微镜的基础知识

2013-10-19  发布者:admin 

当许多生物医学研究认为“共聚焦显微镜”,他们通常有荧光成像技术的初衷。 这个看似明显的联系,这是一个很好的理由。 大部分常见的生物医学应用共聚焦显微镜利用光学切片功率,结合精湛的特异性免疫荧光或荧光原位杂交(FISH)乘标记的细胞和组织产生更好的图像。

基质细胞在共聚焦反射显微镜

可以利用共焦反射镜,以收集更多信息相对点点额外的努力,因为从标本的技术要求最低的样品制备和仪器重新配置。 此外,未染色的组织的信息是现成的共焦反射镜,作为数据标记探针的组织​​反射光线。 该方法还可以结合使用,与比较常见的古典荧光技术。 后者的应用程序的例子是在一个群体中的荧光标记的细胞和未标记细胞的检测成像不透明的,图案化的基质上生长,如在图1中示出的荧光标记的细胞之间的相互作用。

数字图像在图1(a)示出了神经胶质细胞,小1微米高的支柱图案,并使用反射共聚焦显微镜成像的硅基质上生长。 细胞免疫荧光标记纽(红色)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP,绿色)。 图1(b)示出了类似的硅基质上生长的神经元和标记的抗体,该抗体,微管相关蛋白-2(MAP-2)和荧光素标记的二次抗体。 同样地,在硅基材的表面成像的共焦反射镜。

生物医学成像的共焦反射镜的一个主要诱惑是的图像无标签的活组织能力。 事实上,该技术已被利用的各种不同的组织中,包括脑,皮肤,骨,牙齿,眼组织的图像。 共焦反射显微镜成像的眼的角膜和晶状体的效果特别好,因为它们是透明的。 例如,光学部分已收集到客厅使用工作距离长水浸泡目标的角膜和晶状体深400微米。

成像未染色标本共焦反射镜设计师早期焦工具萤光技术出现之前是非常常见的。 可以利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和尼普科夫旋转盘显微镜,共聚焦反射模式。 旋转盘显微镜的图片可实时收集的,实际的颜色观察,具有的优点和不足,有时会出现在激光扫描共聚焦显微镜的反射工​​件。 此工件出现在图像中的一个亮点,从显微镜中的光学元件中的一个或多个反射所造成的。 反射的神器有几种补救措施。 它可避免通过相差显微镜的光轴的亮点和缩放的帧扫描的区域中的试样。 另外,反射可以从图像中删除数字中减去背景图像的光斑或平场校正。 除去麻烦工件的另一种方法,应用仪器,以消除从光学元件的反射偏振滤光器。

传统的生物应用广角反射光成像,观察生长在组织培养中使用的技术称为反射干扰显微镜的盖玻片上的细胞之间的相互作用。 这里,粘连细胞和它的基质之间的界面处的玻璃盖玻片和底面的细胞可见。 这些细胞粘附地区继续成为一个研究领域的极大兴趣。 与联络接触相关的蛋白质是利用免疫荧光分析,接触本身可以被视为使用干扰反射镜。

共聚焦显微镜的干涉反射

以类似的方式,使用共焦反射镜观察细胞基质粘连,如在图2中示出。 再次,盖玻片和小区之间的界面成像。 该表面可以在共焦显微镜下难以定位,但在聚焦作为一种辅助手段,可以采用高反射率的盖玻片。 细胞基质接口可以位于集中在快速扫描模式,并出现粘连刚过盖玻片明亮的闪光穿透细胞层时。 护理应注意不要超载对焦时,以这种方式从非常明亮的盖玻片表面的光电倍增管。

图2给出了干扰反射共焦反射镜技术拍摄的数字图像。 图2(a)示出了一个单一的光学部分鸡的心脏成纤维细胞在细胞 - 基质界面成像。 上面的外周的细胞接触斑的暗条纹。 图2中所示类似的单元格中的一项 xz边的(a)的图2(b)中所示。 请注意,在图2(b)的盖玻片是非常光明的。 这似乎聚焦显微镜(红色箭头)时,闪光灯的闪光,细胞基质接口后直接成像。

最近,使用相关技术,提高了图像的丝状伪足收集更反映基板上生长的细胞从PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤)。 的技术,称为反向散射增强反射共焦显微镜 ,产生类似于收集使用传统的微分干涉对比显微镜(DIC)的图像。 使用这种方法,可以观察未染色的细胞生长在不透明的基质,如硅芯片,是不可能的一种技术,它与传统的透射光DI​​C成像。

使用反射光,而不是荧光,活细胞成像的优点之一是没有漂白文物的反射光模式。 还是应该注意光损伤的活标本的威胁,然而,和所有活细胞成像时的注意事项,应采取。 已成功地利用共焦反射镜, 在体外通过胶原基质和胶原纤维形成,Z系列使用时间推移成像和随后的三维重建(被称为4-D成像)按照细胞迁移。 这些方法利用胶原蛋白的生物聚合物的高反射率或反照率。

共焦反射镜(时相比,共聚焦荧光成像)的一个缺点是缺乏特异性探针的差异反映多个标签实验。 这是很难改进的多波长的探针,可用于免疫荧光和活细胞成像。 探头,可用于在反射光模式为单个标签的实验包括金颗粒,过氧化物酶标签,和银颗粒。

银颗粒在共聚焦反射显微镜

作为一个例子,共焦反射镜原位杂交(图3)制备试样的放射自显影成像银颗粒比传统的明或暗视野显微镜提供了显着的改善。 该out-of-的聚焦信号从整个乳状液中的银颗粒可以有效地消除与核糖核酸探针的光学切片的乳液使用共焦反射镜的银颗粒,从焦点对准的图像。

如图3所​​示的几个数字图像采集共焦反射镜的实验与银颗粒。 标本外周血细胞原位杂交,用姬姆萨染色准备从艾滋病毒感染的个体。 图3(a)示出制备根据标准明照明,而图3(b)显示了相同的暗场照明领域中有显着量的焦点外的碎片。 共焦反射镜(在同一视场)的结果列于图3(三)。 需要注意的是还没有在此模式下成像的焦点外的碎片。 为了比较的目的,样品也可以用微分干涉对比成像,在明场和暗场照明。

因为收集的反射光的共聚焦图像和所发送的图像(明场和暗场)同时使用相同的扫描激光束(在图3),它们是在与另一个寄存器,并可以进行数字合并成单个图像。 的透射光的明视场图像记录的总的细胞种群,无论是作为一个灰度图像或真彩色图像(提供了一个真正的颜色的透射光检测器被安装在显微镜)。 暗场照明图像采用了银颗粒在完整的乳液,包括任何污染的玻璃表面上的尘埃颗粒的整个人口的信号。 反射共焦显微镜图像,与此相反,只记录标记的探针(图3(c))的那些细胞,并因此比透射光图像的标记的细胞是更准确的测量。 此外,它是更适合于探头的量化,因为该图像由黑色背景上的饱和像素(信号从探头)的离散区域,有点让人想起在这方面的荧光图像。

银颗粒合并后的图像

共焦反射显微镜图像数字合并透射光图像显示目的,标记细胞的细胞总人口的估计数。 在大多数共聚焦系统中,收集在一个通道的RGB图像(通常是蓝色通道)的透射光图像,反射光图像,荧光图像或一个或多个与它同时被收集,通常成红色绿色通道。 显示以这种方式产生的透射光图像的彩色背景上,在图4(a)所示,一个典型的明场或DIC图像或黑色背景上的暗场图像的灰度级,而不是更熟悉的梯度。 将其粘贴到一个不同的层上使用的数字图像编辑程序,例如Adobe PhotoShop的(在图4(b)所示)的反射光图像,可以通过以下方式获得的透射光图像的一个更为现实的版本。

除了荧光共焦反射镜通常采用添加荧光图像中查看时,隔离(特别是共焦荧光图像,它可以包括几个白色的像素上的黑色的海洋),它可以是相当抽象的上下文。 在上面给出的示例中,结合的特异性标记,免疫荧光和共聚焦显微镜的光学切片功率实际上可以妨碍的图像本身的解释,除非它们被数字合并的反射光,透射光或反染荧光图像。

共焦反射镜虽然有有限的应用在生物医学成像,它有时可以提供额外的信息,从样本反射光线或有重大波动的折射率在一定的边界。 这种有用的技术,用透射光成像,可能是值得一试的荧光标记成像时,用共聚焦显微镜标本。