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尼康显微镜:全内反射荧光显微镜(TIRF)的结构

2013-10-16  发布者:admin 

荧光显微镜应用中通常采用的各种机制限制荧光团的激发和检测的样品的薄区域。 消除从焦平面以外的背景荧光,显着提高的信号噪声比,并因此,空间分辨率的功能或感兴趣的事件。 全内反射荧光显微镜(TIRF)利用感应的倏逝波的有限的试样区域,紧邻两个具有不同折射率的介质之间的界面的独特性能。 在实践中,最常用的接口在应用程序中的全内反射萤光显微镜的试样和玻璃盖玻片或组织培养容器之间的接触面积。

全内反射荧光

TIRFM的基本概念并不是新的,和最近的兴趣和热情,技术已经到来,由于技术进步,促进其使用。 可用的完整的准备使用的仪器仪表系统的方法,以及在荧光基团的技术,比如基因编码的荧光物种,发展就业使人们有可能在直接调查细胞膜和其它表面处理的数这在以前是不可能的方式。

TIRFM的物理基础

全内反射(TIR)的物理现象已依赖在这种看似不同应用现代光纤的数据传输,并在百年历史的钻石切割利用率提高,切割的宝石闪闪发光,或“火”。 在每一种情况下,光的折射(或弯曲),当它遇到禁闭的一部分或全部的光的高折射率介质具有不同折射率的两种介质之间的界面(n)的结果。 甲准直光束通过一种介质传播,达到这样的接口可以是折射的,因为它进入第二介质的界面处反射,取决于入射角,并在两种介质的折射率的差异。 全内反射是唯一可能的情况下,在其中传播的光遇到低的折射率的介质的边界。 其屈光的行为是由斯涅耳定律

n(1)×SINθ(1)=n(2)×SINθ(2)

其中,n(1)较高的折射率和n(2)的折射率低。 ,相对于界面法线与入射光束的角度θ(1)表示的,而折射光束角由下式给出θ(2)内的低折射率介质。 当光照射该接口的两种材料在足够高的角度,称为临界角(θ(c)),它的折射方向成为平行接口(相对于法线90度),它被反射在较大的角度完全返回到第一介质。

TIRFM样品低亮度的结构

虽然光不再传递到所述第二介质中时,它是在大于临界角的角度入射时,反射光产生一个高度受限制的电磁场的界面附近,在较低折射率的介质中。 这渐逝场对入射光的频率是相同的,因为它在强度与界面的距离呈指数衰减,该字段在最多几百纳米到试样在z方向 (垂直接口)延伸。 在一个典型的实验装置中,在液体的玻璃或塑料液体表面附近的荧光基团,分布可以激发出的渐逝场,只要它们有潜在的电子跃迁的能量范围内或非常接近的照明光束的波长带宽。 由于渐逝场强度呈指数衰减,荧光团的激发是受限制的区域,这是典型的,厚度小于100纳米。 通过比较,该光学部分的厚度是约十分​​之一,所产生的共焦荧光显微技术。 避免因为大量的试样的荧光团的激发,次级荧光发射限制到一个非常薄的区域,来实现高得多的信号对噪声比较传统的宽视场落射荧光照明。 这种增强的信号电平,使得它可以通过内全反射萤光显微方法检测单分子荧光。

全内反射荧光的基本概念,是示意性地示出在图1中,试样的细胞结合的荧光分子(图中的绿色的荧光基团),其中在玻璃显微镜载片上的支持。 在载玻片试样介质水溶液(约1.35)(1.518)的折射率适当地支持全内反射,在玻璃载片上。 调整激光激发的值大于临界角的入射角,照射光束被完全反射回时遇到的接口到显微镜载片上,紧接该接口相邻的检体介质中产生渐逝场。 最接近的玻璃表面的荧光基团被选择性地激发的相互作用的渐逝场中,可以收集从这些发射器的二次荧光显微镜的光学系统。

正如先前所讨论的,所采取的不同介质之间的界面处的折射或反射后传播的光束的角度取决于光的入射角的界面处,以及这两种材料的折射率。 发病率,超过该发生全内反射的临界角,可以计算由斯涅耳定律的表达操纵,上面给出的。 应用方程细胞膜的过程的一个典型的生物调查,载玻片或盖玻片的折射率由n(1)(约1.5)表示,而n(2)表示的折射率的缓冲水溶液或细胞质组件(1.33至1.38)。 具有n(1)n(2),θ(1)超过临界角θ(三),会发生全内反射在玻璃介质。 上面的临界入射角,折射发生在90度(罪θ(2)=1),斯涅耳定律简化为

n(1)×SINθ(C)= n(2)

SINθ(C)=n(2)/ n(1)

因此,在临界角可以表示为:

θ(C)=sin-1 N(2)/ N(1)

不突然发生全内反射的临界角成为一种新现象,但随后用少量的反射,超过临界角时,总反射从主导折射的连续过渡。 朝着临界角值随着入射角的增大,传输(折射)光束反射光束强度减弱,而变得更加强大。 在所有大于临界角的角度,总的内部反射来实现,其中基本上所有的光被反射回所述第一介质。 即使不再光传播到所述第二介质中,有少量的反射光通过该接口,然后平行于表面的传播,创建一个电磁场在紧接该接口相邻的第二介质的渗透。 这个字段是被称为渐逝场,并在有限的界面附近的区域,它是能够令人兴奋的荧光基团。 在z方向上(垂直于界面)的指数衰减的倏逝波的能量激励的范围是有限的。 下面的公式定义这种能量的距离的函数,从该接口

E(Z)= E(0)exp(-z/d)

其中,E(z)是在从接口的垂直距离 z和E的能量(0)是在界面处的能量。 的穿透深度(d)不依赖于入射照明光的波长(λ(i))的入射角,和在界面处的折射率的介质,根据公式

 

在小的入射角,通过该接口的较低折射率介质传播的光波的正弦,有一个特征周期。 在增加角度,接近临界值,这个时期的折射光线变长,变得更接近平行于界面的传播方向。 当达到临界角,波周期变得无限大,折射光的波阵面垂直于界面的表面对齐。

TIRFM高数值孔径的物镜

要总结,有几个关键因素支配的倏逝波在显微镜的利用率。 全内反射的发生,并且产生的渐逝场中的照明发病率的介质的折射率必须是大于检体介质(比n(2),N(1)),光的入射角(θ (1))必须是大于临界角(θ(c) )。 入射照明光波长的影响倏逝波的穿透深度和特定的被激发的荧光基团,其中必须有适当的吸收特性的光源的波长带中。 的含意结合的倏逝波的能量呈指数下降的事实,在z方向上的波长的影响,可以诱导在一个非常薄的光学部分,通常小于100纳米的厚度,高度特异性荧光激发。 尽管是有限的全内反射萤光显微镜成像具有合适的折射率的两种不同介质的界面处,大量的应用是非常适合的技术。 在生物医学领域的研究兴趣是最活跃的领域之一,其中许多引人注目的问题涉及过程发生在细胞表面或血浆膜 - 适当的接口TIRFM调查。

TIRFM基本仪器的方法

有两种基本的方法配置仪器的全内反射荧光显微镜:棱镜法 ,和物镜方法  图2说明了这两个配置。 在棱镜技​​术,聚焦的激光束被引入到显微镜盖玻片通过附在其表面上的棱镜,光束入射角被调整到临界角(参见图2(a))。 依赖引进光束在棱镜有许多限制,主要是由于到标本操纵的几何约束,尽管该方法在生物应用已动用超过二十年,它从来就没有成为一个主流研究工具。 棱镜配置有许多变化,但大多数限制访问试样,使其难以执行操作,注入介质入检体空间,或进行生理测量。

棱镜技术的另一个缺点是倒置显微镜设计的基础上,在大多数配置中,被引入的照明在试件上的相反侧的目标的光学元件,需要通过大量的试样的渐逝场区域成像。 放置棱镜的标本,以避免这种情况的客观方面提出更多的问题,因为靠近一个短工作距离目标的标本和棱镜位置。配置利用全内反射成像系统的复杂性和精度要求阻碍了许多潜在的研究人员从显微镜制造商提供完整的系统(“交钥匙”)成为前。 需要调查谁想要利用技术,设计并建立自己的系统,这个困难,结合的必要性,建立和维护一个开放的激光光学平台上,这意味着更早版本的用户更经常棱镜方法物理学家比生物学家。

宽视场荧光和和TIR的微球

所述物镜的技术,它有时也被称为通过透镜照明 ,避免了许多设计上的限制,利用这样的棱镜引入光在所要求的角度(参见图2(b))。 在该方法中,客观上介绍无论是相干激光或盖玻片试样界面的非相干弧灯照明。 的入射角大于临界角的实现通过使用高数值孔径的目标(理想情况下为1.45或更高)。 通常情况下,被认为是一个客观的数值孔径的特征的光收集能力的镜头。 相反,直接的数值孔径决定的角度范围内的光可以退出该目标时,它是利用一个提供照明。 数值孔径和可实现的照明的入射角之间的关系由下面的公式描述

数值孔径(NA)= n×sin(θ)

其中,NA是物镜的数值孔径,n表示折射率,θ是二分之一的物镜的孔径角。 结合上面给出的全内反射条件的关系,示出该活细胞具有典型的折射率为1.38需要一个客观的,具有大于1.38的数值孔径,以实现全内反射的照明。 光线进入的目标必须通过的孔径锥部对应于数值孔径大于1.38的值,以上面的玻璃试样界面被全反射。 如果采用相干激光照明,它必须集中在目标后孔的周边,保证灯将退出上面的角度等于或大于临界值的前面的光学表面。 在非相干照明,例如以从一个弧放电灯的情况下,在一个不透明的磁盘的形式的掩模必须被引入到光路中,以限制的目标的光通过后孔的外部区域。

通过限制在物镜的后焦平面的圆形环隙区域的照明,照明锥的中心的光线,通常会出现在亚临界角被挡。 由此产生的排放物的目标是一个中空的圆锥体入射的光的后半的角度足以造成全内反射的TIR接口。 如果显着的照明的目标后孔(较低的数值孔径区域)的中央部通过,落射照明,而不是全内反射,降低在图像平面上的信号 - 噪声比。 在实践中,不透明的阻光磁盘可以被安装在一个可移动的滑块,促进TIRF和落射照明成像模式之间快速切换。

实现渐逝场激发通过使用高孔径物镜,在试样的操作和测量选项提供了更大的灵活性比棱镜为基础的技术,但入射照明角度的精确控制是比较困难的。 当一激光源,用于耦合到棱镜的光的入射的角度可以很容易地在很宽的范围内变化,可以简单的控制的渐逝场的穿透深度。 与物镜系统,在客观的后侧焦点面上的激光的聚焦点的偏轴(利用的开口的外周部),和从透镜轴的径向距离增加,产生一个相应的角度的增加,在光入射到试样上的(参见图3)。

如果物镜的数值孔径足够大,则可以实现全内反射的临界角。 ,因为主要的细胞成分(细胞质中)具有约1.38的折射率,物镜的数值孔径超过该值是必需的。 只有百分之几的镜头的周边区域有一个1.4的数值孔径的目标,可以利用全内反射的临界角的只能稍微超过,进入后孔的一个非常具有挑战性的程序耦合的激光。 显然,更高的数值孔径的目标是有利的,并提供额外营运利润率超过临界角的角度微调。 一旦超过临界角时,镜头的光轴的激光焦点的径向距离的进一步增加,以减少在一个光滑的和可重复的方式渐逝场的穿透深度。

TIRFM应用

在一般情况下,总的内部反射照明具有潜在的好处,在任何应用程序需要标本中有大量的荧光基团位于分子在溶液中的布朗运动的兴趣爱好,如光学平面以外的微小结构或单分子成像,囊泡发生内吞作用胞吐,或单细胞蛋白质贩运。 这样的样本通常表现出急剧增加,信号噪声比的限制,激发区域的厚度。 图4表示的利用TIRFM技术方法(图4(b))和常规落射荧光照明(图图4(d))的溶液的荧光微球获得的图像。 到左边的每个图像是其对应的的强度直方图(图4(a)和图4(c))。 在影像中,在尖锐的本地化和较高的信号强度在直方图中对应的全内反射萤光显微镜图像(图球体从1.3到35所提供的信号-噪声比(S / N)增加分辨率的提高是明显的图4(a​​))。

宽视场和TIR荧光的细胞粘着斑

人们很早就认识到,全内反射萤光显微镜在回答了一些生物的问题可能会成为一个强大的工具,虽然使用了20多年,该技术已得到了相当多的关注,直到最近。 电池基板接触人体皮肤成纤维细胞,标记用荧光血脂,TIRFM在20世纪80年代初进行了调查。 在大约相同的时间利用TIRFM技术的组合进行的另一项研究中,用荧光漂白恢复(FRAP)澄清生物分子的表面动力学,同时仍然集中在绑定到表面的能量转移的牛血清白蛋白。 结合,后者的研究的TIRFM与荧光共振能量转移(FRET),另一种技术,目前正经历着快速增长的应用程序。

TIRFM和其他尖端技术更多地利用的趋势是由于供应量增加,使得它不必要的工程师,为每个特定的研究应用,并构建定制系统先进的模块化仪器。 另一个重要因素是,可以适用于各种各样的问题,其中最重要的,这可能是利用绿色荧光蛋白(GFP),青色,蓝色,黄色和红色的衍生物的多功能生物工具的发展。 来源于水母的绿色荧光蛋白,不要求种属特异的辅助因子表达和展览的荧光,可用于跨物种实验。 生物的荧光基团已被插入到数百蛋白质,通过基因重组,并且本质上是无限的,潜在的。 另一个有希望的GFP突变体的发展能力的结果作为神经递质释放过程中的细胞内钙指标的功能。 这些蛋白质已监测在一些研究中,通过荧光共振能量转移。

TIRFM是一个理想的工具,进行调查的机制和动力,许多参与细胞 - 细胞相互作用的蛋白质。图5给出比较图像的活细胞(PtK1袋鼠肾上皮细胞表达GFP-纽)利用传统的广角落射荧光法(图5(A))和渐逝波照明(图5(b))。 TIRFM图像显示融合蛋白在细胞粘着斑由平面荧光落射照明图像产生模糊的巨大反差的是在衬底界面的本地化。 活细胞成像代表TIRFM技术最有前途的应用之一。 蛋白在细胞膜表面的相互作用,如涉及焦点粘连,它具有极大的重要性,在细胞生物学。 理解正常的细胞生长和其衰减造成的细胞 - 细胞接触(接触抑制)中所涉及的信号可以提供异常细胞的生长中发生的疾病,如癌症的洞察。

蛋白动力学时间推移的次序

生物分子水平的,全内反射萤光显微镜技术已被用于图像的突变蛋白的GFP-消旋贩卖沿薄丝状伪足的细胞生长在基板上(图6)的单分子。 这种蛋白是参与细胞运动,其在细胞膜的相互作用的动力学的知识是至关重要的了解的过程。 有足够的时间分辨率动态研究的可视化单分子荧光TIRFM,因为悬而未决的倏逝波激发所带来的信号噪声比。 图6给出的四个连续时间的推移在200毫秒的时间间隔拍摄的帧,示出了运动的GFP-Rac的融合蛋白分子(箭头)通过细filopodium的一个爪蟾的细胞生长在衬底上。

TIRFM虽然是有限的调查盖玻片标本接口或附近发生的结构和流程,它是目前在生物和生物医学科学的兴趣,很多问题可以探讨在细胞膜同时偶然。 神经科学领域的许多根本问题借给自己TIRF显微镜研究。 应用该技术的一个理想的候选人是在突触神经递质的释放和吸收的研究。 从历史上看,膜贩运和融合的机制,包括突触囊泡释放(胞吐)或摄取(内吞作用),已使用遗传,生化,电子显微方法研究。 这些技术在某些方面是间接的,或仅提供一个瞬时表示所发生的程序,无法解析的细胞膜活性的复杂动态。

膜片钳技术的发展已经允许电容测量可用来指示,由非常小的电变化,膜表面积或氧化物质的释放的加法或减法。 这种技术的缺点是,只有融合事件被检测到,和高时间分辨率的同时,可以实现,有很少的重要事件的空间位置上的信息。 由于所有的事件一起被检测到,得到无特异性和囊泡运输对接,和膜融合的其他阶段的细节通常被结合动力学模型推断,从小区的测量。 虽然电子显微镜调查提供了出色的空间分辨率,活细胞或动态的研究是不可能的,与其他测量瞬时意见的相关性是非常困难的。 强度的TIRFM方法,证明在最近的调查中,可能是直接肉眼观察动态囊泡蛋白相互作用。

全内反射荧光显微镜蛋白质-囊相互作用的研究

TIRFM由于个别囊泡光学解决,按照它们之间的相互作用,直接动态的能力,提供了前所未有的大量的蛋白质参与的方式在神经生物学过程研究的能力。 最近的一项研究表明释放的荧光脂质含有突触船只活动区域,以及随后从储备库位于20纳米从质膜提供补充盗号木马的囊泡运输的。 另一项研究涉及直接可视化培养的肥大细胞的内吞作用的动态过程中肌动蛋白的作用。 GFP-肌动蛋白丝,观察周围的荧光标记的胞饮囊泡,进入细胞内的肌动蛋白的流中拉出。 一时间推移TIRFM成像序列图7说明GFP-肌动蛋白的内吞过程中。 的6个连续的帧表示在0到65秒的范围内的不同的时间间隔。 在每个帧中的白色箭头表示的GFP-肌动蛋白的融合蛋白的信号。

在图8中示出的多光谱成像囊泡-肌动蛋白的内吞作用过程中的相互作用。 在这两个通道的图像(图8(a)),一个流的绿色标记的GFP - 肌动蛋白被认为是在细胞外介质中的囊泡含有德克萨斯红葡聚糖周围。 一时间的推移三个双通道图像序列(图8(b)至8(d)条)提供了洞察时间动态的肌动蛋白囊泡的胞饮过程中的互动。 这种类型的研究逻辑上可以扩展标记突触蛋白,利用不同的GFP颜色的变种,以调查他们的互动和动态。

虽然试样中的全内反射萤光显微镜中成像在二维空间中,有可以得到在细胞的囊泡或结构上的位置的三维信息的机制,其中,无论是在活细胞研究和在固定染色制剂。 图9示出了在细胞结构蛋白的微管蛋白的免疫细胞化学标记,想像同时使用宽视场落射荧光(图9(a))和瞬逝波照射(图9(b))。 结构的细节揭示在TIRFM技术的图像,不能进行可视化与常规落射照明。 比较两个图像模式所强调的是覆盖在伪。 在图9中(C),萤光分配的颜色为绿色,而TIRFM图像显示为红色。

全内反射萤光显微镜的原理,通过改变照明的入射角,并因此对倏逝波的穿透深度,荧光基团可以被区分纳米尺度上的深度。 这种技术可以精确地控制穿透深度更容易棱镜类型的系统中来完成的,最近的技术改进的方法是利用声-光偏转器(AOD),快速地改变入射角。 在渐逝场深度的快速变化,目标囊泡或其他结构可以跟踪在不同的深度和准确地确定它们的位置。有很多方向AOD中的全内反射萤光显微镜,包括用作极快的快门,可以快速地调节照明波长的多线式激光装系统的潜在的有用的应用程序。

多光谱囊-肌动蛋白的运动

如上所讨论的,在目标为基础的系统中的入射角的变化是不容易在使用棱镜来完成,虽然新的更高的数值孔径的目标提供了相当大的改进,在可用的范围内的入射角调整。 在一般情况下,目标类型的系统能够检测更多的发射光,并且这个信号的强度随距离单调减小。 该属性是一个优势,在校准的TIRFM技术的系统,可以使荧光信号电平有关的轴向位置,提供了另一种方法,三维成像。

未来发展前景

TIRFM的基本理论,现在成立,最近的技术进步大大促进了该技术已实际执行。 因此,越来越多的生物分子和细胞生物学的调查正在使用的技术进行。 TIRFM技术的系统结构的基础上直立或倒置显微镜是相对简单的,使用的激光光源,并且可以通过使用传统的弧灯源,如果进行了修改,以阻止光通过的中央区域的目标。 TIRFM配置与其他光学技术结合,完整的模块化显微镜系统,现在,有的厂家专门为内部反射的应用提供了高数值孔径物镜。 具有广泛的照明模式,包括明,暗场,相衬和微分干涉对比,以及常规落射荧光的内全反射萤光显微技术兼容。 的目标为基础的系统的一个特别的优点是,它们可以被用来结合用于处理生物分子的各种机制,如原子力显微镜。 它很可能是全内反射萤光显微镜将继续被合并与其他技术互补。

收购在活细胞在多个波长的高时空分辨率的图像数据是一个面积的TIRFM大有希望,一定要更详细地比以前一直未能揭示细胞动力学和扩大利用各种染料组合。 最近,研究者已经报道利用双发射波长检测,可以在一个单一的波长激发的荧光基团,并通过配置系统的多波长激发TIRFM能力进一步扩大的可能性是存在的。 单分子研究,将大大提高染料特性的进一步发展和持续改进的探测器。 在细胞研究的TIRFM方法的扩展可能继续通过细化的遗传和分子操纵技术,结合所提供倏逝波激发的高时空分辨率的光学检测。

在宽视场和TIR荧光照明细胞的结构

TIRFM和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)由于有一定的通用功能,这两种技术进行评估时,自然比较可能的方法来研究问题。 虽然这两种技术提供了光学切片能力,全内反射萤光显微镜的方法是有限的试样区域,具有一个合适的折射率界面,而共聚焦显微镜可以选择性图像几乎任何试样平面。 然而,共聚焦方法所产生的最小的光学部分的厚度是约600纳米 - 厚度大于100纳米的部分的内全反射萤光显微技术的典型。 在许多应用中,它是希望到标本(减轻细胞损伤,例如),以尽量减少总的照明通量,因为共聚焦工具照亮一个比较大的标本量,这是与全内反射萤光显微镜更容易地完成。 在一般情况下,它是更经济的配置TIRFM技术的仪器,它不需要复杂的扫描系统,可以建在几乎任何现代光学显微镜研究级。 完整的,配置系统的一些厂家所提供的是最直接的进入点TIRFM技术,并允许其他强大的光学成像模式的综合能力。

d = λ(i)/4π × (n(1)2sin2θ(1) - n(2)2)-1/2