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完全控制的穿透深度与徕卡显微镜TIRF自动对准

2013-10-16  发布者:admin 

全内反射荧光显微镜(TIRF)的主要特点是激发荧光基团,而不是使用直接光渐逝波的就业问题。 倏逝波,而产生玻璃/水或玻璃/标本接口的从属性,是其传播z方向逐渐降低,限制了它的穿透深度大约几百纳米的样品。 这允许位于玻璃/水或玻璃/试样界面附近的一个小体积的细胞完全被激发的荧光基团。 研究人员普遍适用于全内反射荧光显微镜成像中的动态事件和关闭,如囊泡运输,内和胞外分泌和膜贩运到质膜,无可比拟的信号噪声比和Z-分辨率。 然而,所观察到的分子或结构,可靠控制的倏逝波的穿透深度的空间分布进行精确的陈述是强制性的。

TIRF_Controlling

 

 

入射角和波长的激光的穿透深度是由

倏逝波的穿透深度被定义为下降的倏逝波的界面处的初始强度的37%的范围内,仍可获得。 它主要取决于激光的入射角遇到玻璃/水或玻璃/标本接口。 因此,控制入射角度为必要的控制的倏逝波的穿透深度。 严密,精确,可靠和可重复性的激光的入射角控制也是强制性的,以确保所取得的成果的可重复性。 反过来的激光的入射角取决于在backfocal平面的目标,这是由全内反射荧光扫描仪的激光光斑的径向距离。

 全内反射荧光显微镜原理

  1:全内反射荧光显微镜原理

 

  

渐逝场的穿透深度的另一个决定因素是必要的用于激发的激光的波长。 这可以成为一个在TIRF实验问题多个荧光。 在此类实验中不同的激光线之间切换,会导致不同的渐逝波的穿透深度。 从这样的实验的结果的解释,必须非常仔细地进行,作为渗透的渐逝波,因此被激发的荧光团的数目试样的体积随激发光波长。 为了实现可靠的,可量化的结果,它是强制性的,以保持在一恒定值的倏逝波的穿透深度。 这只能实现激光线所产生的渐逝波,如果不同的穿透深度相应地改变所选择的激光线的入射角补偿。

  

完全控制的穿透深度与徕卡TIRF自动对准

为了确保重复性和可靠的穿透深度,甚至当激发波长改变的倏逝波,莱卡微系统采用特殊的硬件TIRF对准一个完全自动化的过程。 的徕卡TIRF模块的主要部分是一个全内反射荧光扫描仪,准直仪和TIRF传感器的。 全内反射荧光扫描仪控制被放置在所述激光束的客观backfocal平面的位置。 因此,控制在试样的激光的入射角度。 准直的激光束进行聚焦的后部目标的平面(backfocal平面),实现了均匀的照明视场中。 的的TIRF传感器检测到的反射光的情况下,全内反射从玻璃/标本或玻璃/水相间。

 

光通路徕卡TIRF模块。 激光束被定位的目标,借助于一台扫描仪。 在一个特殊的传感器测量的总反射的返回的光束。

 

 2:光通路徕卡TIRF模块。 激光束被定位的目标,借助于一台扫描仪。 在一个特殊的传感器测量的总反射的返回的光束。 这种反馈可以精确,全自动,所产生的渐逝场的穿透深度和可重复的设置。 1)全内反射荧光传感器,2)TIRF扫描仪,3)准直器,4)广角荧光激发。 实线:耦合激光束,虚线:回来的激光束。

 

 

 

 

 

 

 

 

这使得全内反射荧光传感器系统的一个特殊的部分,因为它允许待检测的全内反射的发生。 因此,实验者可以100%肯定,获取的图像,是真正的全内反射荧光图像。 在完全自动化的对准过程中,全内反射荧光扫描仪的激光束移动通过backfocal平面的目标和全内反射荧光传感器,检测范围的扫描仪位置处发生全内反射。 有了这个信息,然后系统计算 - 考虑到的激光束的波长 - 得到的所有可能的扫描仪位置的倏逝波的穿透深度。

后的对应是可能的激光线之间切换,同时保持一个恒定的倏逝波的穿透深度时,扫描仪将自动改变的客观backfocal平面中的激光束的位置。 这保证了激光始终具有所要求的相对于波长的激光的入射角度,以产生所要求的渐逝场的穿透深度。 结果可自由定义,但仍然稳定,并充分的重复性渗透深度,可用于所有波长的倏逝波。

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 3:全内反射荧光图像的荧光标记RAB11(绿色)和GAL3(红色)的蛋白,在MDCK细胞顶膜囊泡。 与不同穿透深度设置的图像被收购。 左上:90纳米,右上:110纳米,中心左:150纳米,中间偏右:200纳米,左下:250纳米,和底部右:EPI模式。 请注意可见小泡数量的增加和减少的信号对噪声比。 徕卡上午TIRF MC系统获取的图像。 礼貌德国马尔堡大学PHILIPPS,细胞生物学和细胞病理学研究所苏菲博士Veitinger,。

 

灵活的TIRF扫描仪使河洛成像和方位选择

 

雇用一个高度灵活的TIRF扫描仪具有额外的优势。 如前所述,对系统进行精确识别,激光位置(或扫描仪的位置)内部全反射发生,反之亦然,这是不是这样。 发生全内反射的确切位置的知识,没有可以用来照明样品,在一个特殊的所谓的HILO模式。如果激光遇到玻璃/水界面在低于所需的全内反射的临界角的角度,激光束将通过试样倾斜。 因此,只有部分的试样所遇到的激光束,并只在本卷中被激发的荧光团。 这将导致在具有低背景和一个很好的信号 - 噪声比传统的落射荧光图像的图像。 这种方法的一个额外的好处,漂白和光毒性大大降低,延长细胞生存力,尤其是在长期的实验。 的的HILO模式是特别适合用于定量研究的动态运动,分布或相互作用的分子和单​​分子跟踪。 一个标准的应用程序是泡跟踪。

在耦合位置可自由定义的一个全内反射荧光扫描仪的另一个优点是可以选择的激光遇到玻璃/水界面的方向(所谓的方位)。 这意味着,可以选择的倏逝波的波阵面的方向。 这反过来的倏逝波(水平或垂直玻璃/水界面)的传播方向上有一定的影响。 的传播方向反过来可以影响荧光团激发的效率,因为它们通常具有一定取向的偶极子。 徕卡TIRF系统是可能的四个方位位置之间进行选择,以确保最佳的荧光激发。

一个声光可调谐滤波器(AOTF)和多模激光光纤保证超快波长切换和均匀的照明系统的全内反射荧光字段

徕卡TIRF自动对准的好处是最明显的多色全内反射荧光显微镜在时间推移应用。 为了这个目的,不同的激光线之间快速切换是强制的。 这是通过采用声光可调谐滤波器,用于选择所需的激光线,而不是一个过滤系统。 的AOTF能在几微秒内振动的方式,基于过滤器的系统相比,减少传输损耗的波长之间的切换。 一个AOTF也可调谐的激光束的强度通过。 此外,百叶窗AOTF变得过时,这也加快了激光线之间的切换。

最好的可能的全内反射荧光显微镜的另一个因素是一个均匀的照明系统的视场。 对于激光为基础的全内反射荧光显微镜,这是强烈地依赖于系统中所使用的特定的激光光纤。 通过采用多模的激光纤维,具有极高的数值孔径,如在Leica TIRF系统的使用,可以实现最好的均匀性。

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 图4a:广角乳腺癌肿瘤细胞表达的GFP标记的细胞粘附分子在细胞膜上表达的CD44的荧光图像。 
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 4B:相同的细胞在TIRF成像。 礼貌,CNIO玛丽亚C.蒙托亚博士,西班牙国家癌症中心,马德里,西班牙

 

 

 



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