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尼康显微镜荧光蛋白简介

2013-10-16  发布者:admin 

最终在20世纪60年代初发现了绿色荧光蛋白在细胞生物学预示着一个新的时代,使调查人员运用分子克隆方法,融合多种蛋白质和酶的目标荧光团部分,以在生物系统中监控细胞过程用光学显微镜和相关的方法。 当加上广角荧光和共聚焦显微镜最近的技术进步,包括超快的低光数码相机和激光控制系统multitracking,绿色荧光蛋白,它的颜色转移的遗传衍生工具已在成千上万的活细胞成像实验展示了宝贵的服务。

 

活细胞荧光蛋白标记

下村修和弗兰克·约翰逊,在星期五港实验室在华盛顿大学工作,1961年首次分离出一种钙依赖性的,他们命名水母Aequorea victoria的水母生物发光蛋白。 在分离过程中,第二缺乏的蓝色发光生物发光水母,但用紫外光照射时能产生绿色荧光蛋白观察。 由于这个属性,该蛋白最终粗鲁的名字命名的绿色荧光蛋白(GFP)。 在接下来的二十年里,研究人员确定了水母绿色荧光蛋白一起工作的水母的发光器官钙诱导发光信号转换成绿色荧光特性的品种。

虽然在1992年第一只克隆绿色荧光蛋白基因,分子探针的重大潜力没有实现,直到若干年后,当融合的产品被用于跟踪细菌和线虫的基因表达。 由于这些早期的研究中,经过精心设计,产生大量各种颜色的突变体,融合蛋白,生物传感器,被广泛称为荧光蛋白绿色荧光蛋白。 最近,来自其他物种的荧光蛋白已被识别和分离,从而进一步扩大的调色板。 随着荧光蛋白技术的迅速发展,该实用程序的广泛的应用超越了简单的跟踪标记生物分子在活细胞中的这种基因编码的荧光现在变得完全理解。

图1中所示的两个例子,在活细胞的融合产物,亚细胞(细胞器)的位置针对多个荧光蛋白标记。 负鼠肾皮质近曲小管上皮细胞(OK线),在图1(a)转染荧光蛋白变种鸡尾酒融合肽信号介导运输的核(增强型青色荧光蛋白ECFP),线粒体(DsRed荧光蛋白; DsRed2FP),或微管网(增强型绿色荧光蛋白, 绿色荧光蛋白 )。 人宫颈腺癌上皮细胞(HeLa细胞线)组成的类似的试样是描绘在图1(b)。 青色(mTurquoise)和黄色荧光蛋白编码序列(高尔基复合体和细胞核,分别),以及“水果”蛋白质,mCherry(mVenus)融合的亚细胞定位载体共转染HeLa细胞,目标线粒体网络。

蓝色,青色和黄色荧光蛋白,绿色荧光蛋白,其突变的等位基因形式,用于构造可以表示活细胞,组织,整个生物体,与工程的载体转染后的荧光嵌合蛋白质。 其他种类,包括珊瑚生物,已分离出红色荧光蛋白,同样是有用的。 荧光蛋白技术避免了净化装置的问题的,标记,并引入到表面或内部抗原产生特异性抗体的细胞或任务的被标记的蛋白质。

维多利亚水母的绿色荧光蛋白的性质和修改

绿色荧光蛋白欣赏其中最重要的方面是,在整个27千道尔顿的天然肽结构是必不可少的开发和维护其荧光。 值得注意的是,原则上荧光基团是来自相邻的三个一组的氨基酸:丝氨酸,酪氨酸,甘氨酸残基,在位置65,66,和67(以下简称为Ser65,Tyr66,Gly67,参见图2)。 虽然这种简单的氨基酸基序在整个自然界中发现的常见,它一般不导致荧光。 这是独特的荧光蛋白的这种肽的三重峰的位置位于中心的是一个稳定的桶11β-折叠片折叠成管状结构组成的。

的绿色荧光蛋白在中心内的疏水环境中,会发生反应在Ser65和Gly67的氨基氮原子的羰基上的碳原子之间形成咪唑啉-5 - 酮的含氮杂环的环体系的结果(如在图2中示出)。 在咪唑啉环的共轭与Tyr66和成熟的荧光物种的进一步氧化结果。 重要的是要注意的是本机的绿色荧光蛋白的荧光基团存在于两种状态。 质子化的形式,主要的状态,在395纳米,最大激发和一个普遍的,非质子化的形式,吸收约4​​75纳米。 然而,无论在激发波长,荧光发射波长在507纳米的最大峰值,虽然峰值是广泛的,并没有很好地定义。

绿色荧光蛋白的荧光变化

两个主要功能的荧光蛋白的荧光作为探针,其效用具有重要的意义。 首先,作为荧光绿色荧光蛋白的光物理性质是相当复杂的,因此,这种分子可容纳相当数量的修改。 许多研究都集中在微调固有绿色荧光蛋白的荧光分子探针提供了广阔的范围,但更重要的潜力和广阔的用人为原料构建先进荧光蛋白质不能被低估。 绿色荧光蛋白的第二个重要特征是,荧光是高度依赖于周围的三肽的荧光基团的分子结构。

破坏荧光绿色荧光蛋白变性,可以预料,周围的三肽荧光残留的突变可以显着地改变荧光性质。 的氨基酸残基 β桶内部的填充物是极其稳定的,这会导致一个非常高的荧光量子产率(高达80%)。 这种紧密的蛋白质结构也赋予抗荧光的变化,由于pH值,温度,和变性剂如尿素波动。 高度稳定的绿色荧光蛋白的突变,一般以一种消极的方式改变扰动,从而导致荧光量子产率和更大的环境敏感性减少。 尽管有几个额外的突变,可以克服这些缺陷,衍生荧光蛋白通常是更敏感的环境比原生的物种。 遗传变异与设计实验时,这些限制应该认真考虑。

为了适应在哺乳动物系统中使用的荧光蛋白,进行了野生型绿色荧光蛋白的一些基本的修改,现在发现在所有常用的变种。 第一个步骤是一个37度环境优化成熟的荧光。 成熟的野生型荧光团在28度是相当有效的,但将温度提高到37度,大大降低了整体的成熟和荧光下降的结果。 亮氨酸导致改进的荧光的成熟,在37度,这是在28度观察至少相当于64位的苯丙氨酸残基(Phe64)突变。 这种突变是本来自Aequorea victoria的荧光蛋白在最流行 ​​的品种,但并不是唯一的突变,提高其他变体已经被发现在37度折叠。

除了改善在37度的成熟,也改善了优化的密码子使用的哺乳动物表达绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中表达的整体亮度。 超过190个沉默突变,已被导入的编码序列在人体组织中表达增强。甲Kozak的翻译起始位点(含有的碱基序列A / GCCAT)也被引入第二个氨基酸为缬氨酸插入。 这些,以及与各种其他改进(下面讨论),导致在哺乳动物细胞的活细胞成像的一个非常有用的探针,共同所有目前使用的是来自于原来的水母蛋白的荧光探针。

荧光蛋白调色板

范围广泛的荧光蛋白基因的遗传变异已开发出功能荧光光谱几乎跨越了整个可见光光谱(见表1)。 Aequorea victoria的水母绿色荧光蛋白的诱变努力导致在新的荧光探针,该范围的颜色由蓝色变为黄色,有一些体内报告分子在生物学研究中最广泛使用的。 更长波长的荧光蛋白,散发橙色和红色光谱区域,已开发海洋海葵芨Discosoma,和珊瑚属于类珊瑚虫  还有其他物种已被开采产生类似的蛋白质,有青色,绿色,黄色,橙色和深红色荧光。 发展的研究工作是不断提升的亮度和稳定的荧光蛋白,从而提高他们的整体实用性。

荧光蛋白特性
蛋白质 
(缩写)
激发 
最大 
(纳米)
发射 
最大 
(纳米)
磨牙 
灭绝 
系数
量子 
产量
体内 
结构
相对的 
亮度 
(EGFP%)
GFP(wt) 395/475 509 21,000 0.77 单体* 48
绿色荧光蛋白
EGFP 484 507 56,000 0.60 单体* 100
Emerld 487 509 57,500 0.68 单体* 116
Superfolder GFP 485 510 83,300 0.65 单体* 160
AZAMI Green 492 505 55,000 0.74 单体 121
mWasabi 493 509 70,000 0.80 单体 167
TagGFP 482 505 58,200 0.59 单体* 110
TurboGFP 482 502 70,000 0.53 二聚体 102
AcGFP 480 505 50,000 0.55 单体* 82
ZsGreen 493 505 43,000 0.91 四聚体 117
T-Sapphire 399 511 44,000 0.60 单体* 79
蓝色荧光蛋白
EBFP 383 445 29,000 0.31 单体* 27
EBFP2 383 448 32,000 0.56 单体* 53
Azurite 384 450 26,200 0.55 单体* 43
mTagBFP 399 456 52,000 0.63 单体 98
青色荧光蛋白
ECFP 439 476 32,500 0.40 单体* 39
mECFP 433 475 32,500 0.40 单体 39
Cerulean 433 475 43,000 0.62 单体* 79
mTurquoise 434 474 30,000 0.84 单体* 75
CyPet 435 477 35,000 0.51 单体* 53
AmCyan1 458 489 44,000 0.24 四聚体 31
Midori-Ishi Cyan 472 495 27,300 0.90 二聚体 73
TagCFP 458 480 37,000 0.57 单体 63
mTFP1(Teal) 462 492 64,000 0.85 单体 162
黄色荧光蛋白
EYFP 514 527 83,400 0.61 单体* 151
Topaz 514 527 94,500 0.60 单体* 169
Venus 515 528 92,200 0.57 单体* 156
mCitrine 516 529 77,000 0.76 单体 174
YPET 517 530 104,000 0.77 单体* 238
TagYFP 508 524 64,000 0.60 单体 118
PhiYFP 525 537 124,000 0.39 单体* 144
ZsYellow1 529 539 20,200 0.42 四聚体 25
mBanana 540 553 6000 0.7 单体 13
橙色荧光蛋白
Kusabira Orange 548 559 51,600 0.60 单体 92
Kusabira Orange2 551 565 63,800 0.62 单体 118
mOrange 548 562 71,000 0.69 单体 146
mOrange2 549 565 58,000 0.60 单体 104
dTomato 554 581 69,000 0.69 二聚体 142
dTomato-Tandem 554 581 138,000 0.69 单体 283
TagRFP 555 584 100,000 0.48 单体 142
TagRFP-T 555 584 81,000 0.41 单体 99
DsRed 558 583 75,000 0.79 四聚体 176
DsRed2 563 582 43,800 0.55 四聚体 72
DsRed-Express(T1) 555 584 38,000 0.51 四聚体 58
DsRed-Monomer 556 586 35,000 0.10 单体 10
mTangerine 568 585 38,000 0.30 单体 34
红色荧光蛋白
mRuby 558 605 112,000 0.35 单体 117
MAPPLE 568 592 75,000 0.49 单体 109
mStrawberry 574 596 90,000 0.29 单体 78
AsRed2 576 592 56,200 0.05 四聚体 8
mRFP1 584 607 50,000 0.25 单体 37
JRed 584 610 44,000 0.20 二聚体 26
mCherry 587 610 72,000 0.22 单体 47
HcRed1 588 618 20,000 0.015 二聚体 1
mRaspberry 598 625 86,000 0.15 单体 38
dKeima-Tandem 440 620 28,800 0.24 单体 21
HcRed-Tandem 590 637 160,000 0.04 单体 19
mPlum 590 649 41,000 0.10 单体 12
AQ143 595 655 90,000 0.04 四聚体 11
*弱二聚体
表1

表1给出的是一个汇编显示一些最流行和最有用的荧光蛋白变种物业。 随着每个荧光蛋白质的通用名称和/或首字母缩写,峰值吸收和发射波长(纳米),摩尔消光系数,量子产率,相对亮度,和在体内的结构协会被列出。 是来自于该产品的摩尔消光系数和量子产率,EGFP的值除以计算出的亮度值。 创建此房产已被科学和商业的文献资源,目的不是要全面,而是代表荧光蛋白的衍生物,在文献中得到相当的重视,可能证明是有价值的研究工作。 此外,在受控条件下的吸收光谱和荧光发射光谱中列出的表和图所示的记录,可进行归一比较和显示之用。 以实际的荧光显微镜调查,光谱和波长极大可能会发生变化,由于对环境的影响,如pH,离子浓度,溶剂的极性,以及局部探针浓度的波动。 因此,以下列表中的消光系数和荧光量子产率可能会有所不同,在实验条件下实际观察到的。

绿色荧光蛋白

虽然本机产生显着的绿色荧光蛋白的荧光和极其稳定,紫外线范围内的最大值是在关闭激发。由于紫外线灯需要特殊的光学考虑,可能会损坏的活细胞,它通常不是非常适合于用光学显微镜的活细胞成像。 幸运的是,的最大激发的绿色荧光蛋白很容易转移到488纳米(青色区域)通过引入单点突变改变成65位的丝氨酸苏氨酸残基(S65T)。 这种突变的特点是在最流行 ​​的绿色荧光蛋白的变种,称为增强型绿色荧光蛋白(EGFP),这是在广泛市售BD Biosciences公司Clontech的荧光蛋白技术的领导者,所提供的载体。 此外,增强版可以使用常用的过滤器组设计用于荧光成像,并且是其中最亮的当前可用的荧光蛋白。 这些功能提供了增强的绿色荧光蛋白的一个最流行的探针和单标签荧光蛋白实验的最佳选择。 EGFP使用唯一的缺点是轻微的敏感性pH值和弱的二聚化的倾向。

除了增强型绿色荧光蛋白,其他几个变种目前正在使用活细胞成像。 这些最好的光稳定性和亮度方面之一可能是翡翠的变种,但缺乏商业源限制了其使用。 几个消息来源提供了人性化的绿色荧光蛋白的变种,荧光共振能量转移(FRET)实验中具有明显的优势。 苯丙氨酸残基在位置64亮氨酸(F64L GFP2)的换人产生一个突变,保留了400纳米的激发峰,并且可以加上增强的黄色荧光蛋白作为一种有效的伙伴。 S65C突变(通常代半胱氨酸丝氨酸)的激发峰在474纳米的一个变种已经出台一个更合适的商业合作伙伴FRET增强蓝色荧光蛋白质比红移增强绿色版。 最后,一个礁珊瑚的蛋白,被称为ZsGreen1具有发光峰在505纳米,已被引入作为增强型绿色荧光蛋白的替代品。 在哺乳动物细胞中表达时,ZsGreen1相对EGFP是非常光明的,但效用有限生产融合突变,类似到其他礁珊瑚的蛋白质,有一种倾向,形成四聚体。

黄色荧光蛋白

黄色荧光蛋白家族的启动后,绿色荧光蛋白的晶体结构的发现,苏氨酸残基203(Thr203)附近的生色。 本酪氨酸残基的突变引入稳定的发色基团的激发态偶极矩导致20纳米移位至较长的波长的激发和发射光谱。 精炼导致增强的黄色荧光蛋白(EYFP),这是一个最亮的和最广泛使用的荧光蛋白的发展。 增强型黄色荧光蛋白的荧光发射光谱的亮度和一个出色的候选人的多色成像实验在荧光显微镜相结合,使这种探头。 增强型青色荧光蛋白(ECFP)GFP2搭配时,增强型黄色荧光蛋白也是有用的能量转移实验。 然而,黄色荧光蛋白提出了一些问题,这是很敏感的酸性pH和失去其荧光的大约50%的在pH 6.5。 此外,EYFP也被证明是氯离子和光漂白敏感,更容易比绿色荧光蛋白的。

常见的荧光蛋白光谱

黄色探头发射黄色荧光蛋白结构的持续发展已经解决了一些问题。 黄水晶的变种黄色荧光蛋白EYFP相对是非常光明的,并已被证明是更耐漂白,酸性pH值等环境影响。 另一个衍生物,命名为金星 ,是最快的成熟和开发的亮黄色的变种之一。 珊瑚蛋白ZsYellow1,最初是从一个Zoanthus种原产于印度洋和太平洋的克隆,产生真正的黄色发射多色应用的理想选择。 衍生像ZsGreen1,这是不是有用,创建EYFP融合,有一种倾向,形成四聚体。 许多更强大的黄色荧光蛋白变体在荧光共振能量转移研究的定量结果是重要的,潜在有用的,以及其他调查。

如图3中所示,对于许多常用市售的荧光蛋白,跨越从青色到远红可见光谱的吸收光谱和发射光​​谱。 来自Aequorea victoria的水母的变体,包括增强的青色,绿色,和黄色荧光蛋白,表现出峰值发射波长范围从425至525纳米。 来自珊瑚礁,DsRed2 HcRed1(见下文)的荧光蛋白,发出波长较长,但遭受从齐聚文物在哺乳动物细胞中。

蓝色和青色荧光蛋白

的蓝色和青色的绿色荧光蛋白变体由于在本机的荧光基团(参见图2)的第66位(Tyr66)的酪氨酸残基直接修改。 该氨基酸组氨酸的查询结果在蓝色发射具有在450纳米波长的极大值的转换,而转换为色胺的查询结果中的一大约480纳米的荧光峰随着肩膀,大约500纳米的峰值。 这两个探头只有弱荧光,需要增加二次突变折叠效率和整体亮度。 即使经过修改,这一类荧光蛋白(EBFPECFP)的增强版本,只有约25%至40%,亮如增强型绿色荧光蛋白。此外,蓝色和青色荧光蛋白的激发是不常用的,所以专门的过滤器组和激光源的光谱区域中最有效的。

尽管缺点,蓝色和青色荧光蛋白,多色标记的广泛兴趣和FRET推广他们的应用程序在多个调查。 增强型青色荧光蛋白,可兴奋离峰的氩离子激光(使用457纳米的谱线),是显着更耐漂白比蓝衍生物,这是特别真实。 对比其他荧光蛋白,有没有高水平的兴趣,为设计更好的探针的可见光光谱中的蓝色区域,发展研究的大多数在这个类荧光团一直专注于青色的变种。

FRET荧光蛋白对变种的光谱

其中改进青色荧光蛋白相继出台,AmCyan1和增强的青色变种称为天蓝显示最有希望。 派生礁珊瑚,Anemonia majano的 ,AmCyan1荧光蛋白变体已经与人的密码子优化,以产生一个相对高的亮度水平和抗光漂白相比,增强型青色荧光蛋白在哺乳动物表达。 在下行路上,类似于大多数其他礁珊瑚的蛋白质,这种探头有一种倾向,形成四聚体。 天蓝荧光探针是由增强型青色荧光蛋白的位点定向诱变,以产生较高的消光系数和改进的量子产率。 西鲁林是至少2倍的亮度比增强型青色荧光蛋白,并已被证明加上黄色发射荧光的蛋白质,如金星(参见图4)时,显着增加了信号 - 噪声比,在FRET调查。

红色荧光蛋白

荧光蛋白开发的主要目标已经成为一个红色发光衍生物等于或超过先进的性能增强型绿色荧光蛋白的建设。 在一个合适的红色荧光蛋白的优点是潜在的兼容性与现有的共焦和广角显微镜(和他们的过滤器设置),以及增加容量图像整个动物,这是明显更加透明红灯。 由于施工从Aequorea victoria的水母绿色荧光蛋白的黄色光谱区以外的红移突变已被证明基本上是不成功的,调查人员已经把他们的搜索热带珊瑚。

Discosoma芨来自第一的珊瑚源性荧光蛋白被广泛地利用,并通常被称为DsRed的  一旦完全成熟,红色荧光蛋白的功能而有一个主要的激发光谱的峰值在558纳米和500纳米左右的小峰,峰值在583毫微米的荧光发射光谱。 几个问题都与使用DsRed的,但是。 成熟的红色荧光蛋白的荧光发生缓慢和收益荧光发射是在绿色区域时,通过一个时间段。 被称为绿色状态 ,与其他绿色荧光蛋白,因为光谱重叠的多个标记实验已经证明了这件神器问题。 此外,红色荧光蛋白是一种专四聚体,可以形成较大的蛋白质聚集体的活细胞。 虽然这些功能是无关紧要的DsRed的使用作为记者的基因表达,DsRed的表位标签的有用性受到严重限制。 相反水母的荧光蛋白质,已成功地用于标记蛋白质的数百个,红色荧光蛋白共轭物已被证明不太成功,通常是有毒的。

有几个问题与红色荧光蛋白的荧光蛋白已被克服,通过诱变。 第二代的红色荧光蛋白,称为DsRed2,包含在该肽的氨基末端,防止蛋白质聚集体的形成,并降低毒性的几个突变。 此外,荧光基团的成熟时间减少这些修改。 DsRed2蛋白形成的四聚体,但它是更兼容的绿色荧光蛋白在多个标记实验中,由于更快的成熟。 已经实现了进一步减少成熟时间与红色荧光蛋白的突变体,这也显示增加的亮度电平在峰值细胞荧光的第三代。 红色荧光表达后一个小时内,可以观察到红色荧光蛋白快速相比,约6个小时DsRed2和11小时红色荧光蛋白。 称为红星酵母优化变型中,已经开发出来,还具有改进的成熟率,并增加亮度。红色荧光蛋白-Express和红星绿色状态的存在是看不出来的,这些荧光蛋白呈现橙红色光谱区域多重标记实验中的最佳选择。因为这些探头仍然预留四聚体,他们没有标记蛋白的最佳选择。

橙色和红色单体荧光蛋白的光谱

礁珊瑚生物体已分离出了几个附加的红色荧光蛋白,示出了相当多的承诺。适于哺乳动物应用的第一HcRed1分离从皱Heteractis,现在是商业可用。HcRed1最初源自非荧光的吸收红光的色蛋白,通过诱变,以产生弱荧光的的预留二聚体具有最大吸收波长为588纳米和618纳米的最大发射。虽然这种蛋白的荧光发射光谱从红色荧光蛋白的分离是足够的,它往往协合的红色荧光蛋白和少得多明亮。一个有趣的HcRed构建含有两个分子串联已产生克服,在原则上,优先发生于串联配对产生标签的单体的二聚化。然而,由于这种双蛋白的整体亮度尚未改善,这是不是一个好的选择为常规应用在活细胞显微镜。

发展单体荧光蛋白变种

在其自然状态,存在大多数荧光蛋白,二聚体,四聚体,或高阶低聚物。同样,Aequorea victoria的绿色荧光蛋白被认为参与在一个四聚体复合物与水母发光蛋白,但这种现象已经在非常高的蛋白浓度和水母的荧光蛋白的二聚化的倾向,只观察到通常是非常弱(具有解离常数大于100微摩尔)。荧光蛋白的二聚化,因而一般不被观察到,当它们被表达在哺乳动物系统。然而,当荧光蛋白定位到特定的细胞区室,如质膜,本地化的蛋白质浓度理论上可以变得足够高,以允许二聚化。这是一个特别值得关注的,在进行FRET实验,它可以产生复杂的数据集二聚文物,很容易受到损害。

建设的单体红色荧光蛋白变体已被证明是一项困难的任务。第一代单体红色荧光蛋白(称为RFP1)的创造需要超过30个氨基酸改变结构然而,该衍生物具有显着降低的荧光发射的天然蛋白质和光漂白相比非常快,渲染不太有用的单体绿色和黄色荧光蛋白。突变的研究工作,包括新技术,如体细胞突变,将继续在搜索黄色,橙色,红色和深红色荧光蛋白的变种,进一步降低的倾向,这些潜在有效的生物探针自联营公司的同时推动最大发射朝更长的波长。

改进的单体荧光蛋白正在开发,增加了消光系数,量子产率,耐光性,虽然没有一个单一的变种尚未优化的所有标准。此外,与专四聚体的红色荧光蛋白的表达问题被克服生成单体的变种的努力,已经取得了的衍生物,更兼容的生物学功能。

也许在这方面一直是最壮观的发展引进新的收获来自单体红色荧光蛋白,通过定向诱变定位的Q66Y67残留的荧光蛋白反映类似颜色的荧光发射光谱轮廓(见表1和图5)水果命名,这支队伍的单体荧光蛋白表现出极大值在560至610纳米的波长范围。通过反复的体细胞突变产生进一步扩展这个类荧光蛋白质发射波长650纳米。这些新的蛋白质基本上填补之间的差距最红移水母荧光蛋白(如金星),珊瑚红色荧光蛋白。虽然这些新的荧光蛋白质缺乏必要的亮度和稳定性,许多成像实验,它们的存在是令人鼓舞的,因为它表明不测明亮,稳定,单体荧光蛋白在整个可见光谱。

光学荧光笔

在荧光蛋白研究中最有趣的发展之一,一直是应用这些探针分子光荧光笔(见表2),它的结果的外部的光子刺激或时间的推移改变颜色或排放强度。作为一个例子,本机水母肽的单点突变创建一个绿色荧光蛋白(被称为PA-GFP),使从紫外到蓝色光转化的激发峰在400纳米范围内的光被照明的光活化的版本未转化的PA-GFP具有相似的配置文件(约395至400纳米)与野生型蛋白的激发峰。激发峰在488纳米光转化后,增加了约100倍。此事件唤起PA-GFP的未转化的和转换池的非常高的对比度之间的差异,是有用的细胞内的分子亚群的动态跟踪。图6所示的(a)是含有PA-GFP的488纳米氩离子激光激发成像前(图图6(a))和之后(图图6(d))的光转化在细胞质中被转染的哺乳动物细胞生活405纳米的蓝色激光二极管。

的选择光学荧光笔的性质
蛋白质 
(缩写)
激发 
最大 
(纳米)
发射 
最大 
(纳米)
磨牙 
灭绝 
系数 
量子 
产量
体内 
结构
相对的 
亮度 
(EGFP%)
PA-GFP(G) 504 517 17,400 0.79 单体 41
PS-CFP(C) 402 468 34,000 0.16 单体 16
PS-CFP(G) 490 511 27,000 0.19 单体 15
PA-mRFP1(R) 578 605 10,000 0.08 单体 3
CoralHue-TandemG) 508 518 98,800 0.88 四聚体 259
CoralHue-TandemR) 572 580 60,400 0.33 四聚体 59
wtKikGR(G) 507 517 53,700 0.70 四聚体 112
wtKikGR(R) 583 593 35,100 0.65 四聚体 68
mKikGR(G) 505 515 49,000 0.69 单体 101
mKikGR(R) 580 591 28,000 0.63 单体 53
dEosFP-Tandem(G) 506 516 84,000 0.66 单体 165
dEosFP-Tandem(R) 569 581 33,000 0.60 单体 59
mEos2FP(G) 506 519 56,000 0.84 单体 140
mEos2FP(R) 573 584 46,000 0.66 单体 90
Dendra2(G) 490 507 45,000 0.50 单体 67
Dendra2(R) 553 573 35,000 0.55 单体 57
CoralHue Dronpa(G) 503 518 95,000 0.85 单体 240
Kindling(KFP1) 580 600 59,000 0.07 四聚体 12
表2

光学荧光笔,也可以采用其他荧光蛋白。 三光子激发(小于760纳米),红色荧光蛋白的荧光蛋白是能够将正常的红色荧光绿色。 这种效应可能是由于红色荧光蛋白,红色的发色团,从绿色状态中观察到的荧光光漂白选择性。 定时器红色荧光蛋白变种几个小时的过程中逐渐变成明亮的绿色(500纳米排放),以鲜红的(580纳米排放)。 绿色到红色荧光的相对比例可以被用来收集用于基因表达的调查的时间数据。

被称为PS-CFP,来自绿色荧光蛋白变体的诱变,甲光开关的光学荧光笔,已观察到过渡从青色到绿色荧光照明后,在405纳米(注意在图6(b)和6的中央细胞的光转化(e)条)。 以作为单体时,该探头是潜在有用的,在光漂白,光转换和光活化的调查。 然而,从PS-CFP的荧光是约2.5倍的调光比PA-GFP和其他方面的光转化效率(荧光发射的光转化的40纳米移位小于观察到相似的探针)荧光笔差。 荧光蛋白或相关的其他诱变,得到更有用的变体,在该波长区域有可能。

光学荧光笔荧光蛋白

从珊瑚和海葵物种克隆荧光蛋白光学荧光笔也被开发隔离的石珊瑚,photoconverts从绿色到红色,在紫外线的存在,一种荧光蛋白。 与PA-GFP,荧光枫转换发生从它的照明光谱上不同的光的吸收。 不幸的是,这种蛋白是一种专性的四聚体,使得它不太适合毛皮使用作为比PA-GFP的表位标签。 另一个四聚体石珊瑚(Lobophyllia hemprichii)荧光蛋白的变种,称为EosFP(见表2),发出明亮的绿色荧光,用紫外光照射时,在约390纳米的橙红色。 在这种情况下,光谱的移位所产生的光引起的变形例,相邻的发色基团的肽主链中包含一个停顿。进一步诱变的“野生型”EosFP蛋白产生单体的衍生物,这可能是有用的构建融合蛋白。

第三非水母光荧光笔, 点燃荧光蛋白(KFP1)的已开发非荧光生色分离Anemonia苏卡达,现在市售(Evrogen)。 点燃荧光蛋白不会出现排放,直到照亮绿灯。 在一个短暂的红色​​荧光的低强度的光的结果,超过了几分钟的衰减(参见图6(c)中的线粒体)。 照明用蓝色光线立即点燃的荧光淬灭,允许严格控制荧光标记。 与此相反,高强度的照明导致不可逆的火种,并允许稳定的高亮显示类似的PA-GFP(图6(f)条)。 在拥挤的环境中追踪粒子的运动时,能够精确地控制荧光格外有用。 例如,这种方法已经成功用于跟踪开发爪蟾胚胎和个人PC12细胞中线粒体的运动神经板细胞的命运。

由于光学荧光笔继续发展,荧光蛋白,可用于光学标记应走向光明的发展,单体,可以很容易光转换和颜色的发射,显示了广泛的变种。 加上这些进步,显微镜在细胞生物学实验室,配备照明荧光观察模式和区域标记之间的顺利协调将变得司空见惯。 最终,这些创新有潜力做出显著成绩的信号转导系统在空间和时间上的动态。

荧光蛋白载体和基因转移

荧光蛋白是相当灵活的,并已成功地应用在几乎每一个生物学科从微生物系统生理学。 用于基因表达研究,在培养的细胞和组织,以及活的动物,这些随处可见的探针作为记者,是极其有用​​的。 荧光蛋白在活细胞中,最常用的蛋白质,细胞器,和其他细胞区室的定位和动态跟踪。 已经开发了多种技术,构建荧光蛋白融合的产品和增强其表达在哺乳动物和其他系统中。 主要车辆引入到细胞中的荧光蛋白嵌合基因序列是基因工程细菌的质粒和病毒载体。

荧光蛋白基因的融合产物,可以被引入到哺乳动物细胞和其他细胞,使用适当的载体(通常是质粒或病毒)或瞬时或稳定。 在短暂的,或暂时的,基因转移实验(通常称为“ 瞬时转染),质粒或病毒DNA导入宿主生物体不一定整合到染色体,但可以在很短的一段时间内的细胞质中表达。 表达的基因的融合产物,容易使用一个过滤器组兼容的荧光蛋白质的荧光观察监测中,通常会发生在一段转染后的几个小时,持续72至96小时后的质粒DNA引入哺乳动物细胞。 在许多情况下,质粒DNA可以被整合到基因组在一个永久的状态,以形成稳定转化的细胞系。 瞬时或稳定转染的选择取决于调查的目标。

EYFP内质网局部矢量图

有用的荧光蛋白基因转移实验的基本的质粒载体配置有一些必要的组件。 必须包含该质粒的原核细菌的DNA复制起点和抗生素抗性基因的核苷酸序列编码。 这些元素,通常被称为班车序列,允许进行传播和选择的质粒哺乳动物转染的载体,以产生足够数量的细菌宿主内。 此外,该质粒必须包含一个或多个控制开始信使RNA的转录,哺乳动物的多聚腺苷酸化信号,一个内含子(可选),和在哺乳动物细胞中的基因的共同选择的真核细胞的遗传元件。 转录元件是必要的哺乳动物宿主,表达感兴趣的基因融合产物,并选择基因通常是一种抗生素,含有质粒的细胞赋予阻力。 这些一般功能根据质粒的设计而有所不同,和许多载体有广泛的适合于特定的应用程序的附加组件。

成功的哺乳动物转染实验依赖于使用的高品质的质粒或病毒DNA载体,是相对自由的细菌内毒素。在原生状态,环状质粒DNA分子表现出三级超螺旋构象扭曲周围的双螺旋结构本身几次。很多年了,超螺旋质粒和病毒DNA纯化方法的选择是在插层剂(如溴化3,8 -二氨基-5 -乙基-6 -苯基菲啶溴化或碘化丙啶等)的存在下氯化铯密度梯度离心法。该技术中,这是昂贵的设备和材料,偏析从线性染色体和缺口的环状DNA超螺旋的DNA(质粒)根据浮力密度,使收集的高纯度质粒DNA。最近的,简化的离子交换柱色谱法(通常被称为一个小量制备)在很大程度上取代了繁琐和耗时的离心协议在一个相对短的时间内产生大量的无内毒素的质粒DNA。

已经开发了专门的细菌突变体,被称为主管细胞,为方便和相对廉价的扩增的质粒载体。该细菌含有调色板的突变,使他们特别容易受到质粒复制,并且已经在一个过程称为转化穿过细胞膜和细胞壁的DNA的化学通透改造后的细菌生长至对数生长期的存在的选择取决于质粒的抗生素。细菌培养,离心浓缩和裂解用碱性洗涤剂溶液中含有的酶降解污染的RNA干扰。的溶胞产物,然后过滤,并放置在离子交换柱。不需要的物质,包括RNA,DNA,蛋白质,从柱中彻底洗涤前使用高盐缓冲液中洗脱的质粒DNA。醇(异丙醇)沉淀浓缩物,这是通过离心收集,洗涤,并再溶解在缓冲液中的洗脱质粒DNA。纯化的质粒DNA转染实验上班做好准备。

在哺乳动物细胞中的脂质介导的转染

用于转染的哺乳动物细胞必须是在良好的生理条件下,生长于对数生长期,在手术过程中。宽谱已商业化开发的转染试剂,优化培养细胞摄取质粒DNA。这些技术的范围从简单的磷酸钙沉淀,螯合的质粒DNA在脂质囊泡,保险丝细胞膜和细胞质中提供的内容(如图8所示)。统称为脂质体转染法,脂质为基础的技术已经满足了广泛的接受,因为它的有效性,在大量流行的细胞系,它是目前大多数转染实验的首选方法。

最后,在荧光蛋白应用的巨大潜力,为工程的生物传感器是刚才被实现。生物传感器的构造的数量正在迅速增长。通过使用结构信息,这些探针的发展已导致提高了灵敏度,并且将继续这样做。当然这些努力的成功表明,几乎所有的生物的参数将是可衡量的,使用适当的荧光蛋白为基础的生物传感器。