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尼康显微镜:共聚焦显微镜的基本概念

2013-10-16  发布者:admin 

比传统的光学显微镜,共聚焦显微镜提供了几个优点,包括浅景深,消除焦眩光,以及收集串行光部分的能力,从厚厚的标本。 在生物医学科学中,一个主要的应用共焦显微镜涉及成像无论是固定的或活的细胞和组织,通常被标记的一个或多个荧光探针。

共聚焦显微镜原理图

当使用常规的宽视场光学显微镜,仲由样品发出的荧光,出现相差的感兴趣区域的成像荧光样品往往干扰是在焦点的那些功能的分辨率。 这种情况是特别有问题的样品具有大于约2微米的厚度。 共聚焦成像的方法提供轴向和横向分辨率略有改善,但它是从图像中排除的“焦点”耀斑发生在厚荧光标记标本,最近的爆炸已造成仪器的能力在该技术的普及。 目前大多数的共聚焦显微镜是比较容易操作的,并已成为许多多用户成像设施的基本仪器的一部分。 由于未能在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的分辨率比在传统的宽视场光学显微镜比较好一些,但仍大大低于的透射型电子显微镜,它具有在某些方面之间的间隙桥接两个常用技术。 图1说明了在一个基本的共聚焦显微镜的配置的主要的光通路。

在传统的宽视场显微镜,沐浴在汞或氙光源的光从整个标本的图像可以直接用肉眼观察或直接投射到图像捕获装置或照相胶片。 与此相反,在共聚焦显微镜的图像形成方法是根本不同的。 的照明是通过扫描一个或多个,通常从激光聚焦光束的光的试样(图2),横跨。 扫描试样,以这种方式产生的图像被称为光学部分。 这个术语指的非侵入性的方法,通过该方法的仪器收集图像,使用聚焦光而不是物理装置第试样。

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共焦的方法提供了便利有用得多成像的活标本,使三维(z系列的)数据的自动收集,并改善使用多个标签的标本获得的图像。 图3给出了比较传统的萤光影像碘化丙啶染色的蝴蝶蛹翼上皮整装类似地区的共聚焦图像。 原子核在物流及供应链管理应用技术研发中心图像的分辨率,由于消除焦荧光耀斑有一个显着的改善。

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是目前使用最广泛的生物医学研究中的应用共聚焦变化。 重点是放在在此介绍的激光扫描共聚焦显微镜,因为它是最有可能的设计所可能遇到的新手用户。 生物成像领域内的其他替代设计的仪器在特定细分市场的青睐。 试样制备的协议可以使用,有轻微的修改,任何共焦仪器变种,以及其他方法生产的光学部分,如反褶积技术和多光子成像。

共聚焦显微镜的历史

共聚焦显微镜的发明,通常被认为是马文·明斯基,谁在1955年制作的工作显微镜。 共焦方法的发展主要是由欲望驱动图像生物事件发生,因为他们在生活组织( 体内 ),而,明斯基在未染色的准备工作生活的大脑成像神经网络的目标。 明斯基聚焦成像先进,并于1957年获得专利,其原理是受聘于所有现代的共聚焦显微镜。 图1示出共焦原理,采用荧光显微镜,这已成为最现代的用于荧光成像的共焦系统的基本配置。 明斯基的原始配置摆在前面的锆弧源点光源使用的针孔。

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光点的物镜聚焦在试样所需的焦平面,光通过第二物镜聚焦在具有相同的焦点作为第一个针孔(两个共焦的第二针孔) 。 不限光通过第二针孔发生一个低噪声的光电倍增管,其产生一个信号,从检体的光的亮度有关。 第二针孔防止源自到达光电倍增管中的试样的焦点平面的上方或下方的光。 使用空间滤波,消除了聚焦光或光晕,比飞机的焦点是厚的标本,聚焦的方法是关键。 在明斯基的著作中,他还描述了反射光显微镜,用一个单一的物镜和二色镜的安排,成为了目前使用的系统的基础版本。

为了构建一个图像聚焦原则,聚焦光斑必须以某种方式扫描整个标本。 由明斯基在原来的仪器内置束保持固定和移动标本本身振动阶段。 这种安排的优点在于,扫描光束的光轴上的显微镜,可消除大多数透镜的缺陷,从而影响了图像保持静止。 然而,生物标本,标本的运动可引起摆动和失真,从而导致在图像的分辨率的损失。 此外,它是不可能的注射阶段和试样移动的荧光标记的探针,例如在试样上执行各种操作。

无论照射光束进行扫描的方法,使整个试样,试样的图像必须出示。 没有形成一个真正的图像在明斯基的原始设计,而是从光电倍增管的输出被翻译成图像在屏幕上的军事盈余的持效期长示波器有没有准备录音。 继首张他的发明,明斯基后来写道,在他的显微镜下的图像质量是不是很令人印象深刻,因为在示波器显示屏的质量并没有因为取得可怜的分辨率显微镜本身。 现在很清楚,技术不是明斯基在1955年充分展示了共焦方法的潜力,特别是对生物结构成像。 他指出,这可能是一个原因,共聚焦显微镜不能立即由生物群落,谁是拥抱,仍然是一个非常苛刻的组,其图像质量。 当时,他们有可用的光学显微镜具有优良的光学,并可以很容易地查看和拍摄明亮的彩色和高分辨率彩色薄膜丰富多彩的病理组织切片上。 在今天的激光共聚焦显微镜,图像串行内置的光电倍增管的输出或使用一个装有电荷耦合器件的数字相机,直接处理在计算机成像系统,一个高的的分辨率的视频监视器上显示的拍摄,并输出硬拷贝设备,以优异成绩。 信息流在现代激光扫描共聚焦显微镜框图如图4所示。

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光学显微镜的基本光学系统的几十年来基本上保持不变,因为仪器所取得的最终分辨率是由光的波长,物镜和试样本身的属性。 对比的标本,以及其他相关的技术与光学显微镜的方法所使用的染料,在过去的20年里显着改善。 共焦方法的发展和完善是一个直接结果的复兴已经在光学显微镜主要刺激的现代科技的进步。 明斯基的共焦设计本来是一个利益的一些重大的技术进步已逐渐成为生物学家和其他显微镜(或更实惠)。 其中有稳定的多波长激光为改善点光源,改进的双色镜,敏感的低噪声光电探测器,快速增强了可用性,价格实惠的大容量内存芯片,先进的图像分析软件包,以及高分辨率的视频与图像处理能力的微型计算机显示器和数字图像打​​印机。

这些技术的自主开发,自1955年以来,已逐步纳入共聚焦成像系统。 作为一个例子,数字图像处理技术被首次应用有效地在20世纪80年代初由伍兹霍尔海洋研究所的研究人员。 使用他们称之为“增强视频显微镜”,他们能够如微管,只是超出了光学显微镜的理论分辨率的图像蜂窝结构。 分辨率明显增加,使通过使用光照水平低硅愈演愈烈物镜(SIT)数字图像处理器连接到摄像机捕获的图像的数字增强。 使用微分干涉相差(DIC)的光学成像的蜂窝结构,并使用数字处理方法,进一步增强图像。

的分类,激光共聚焦显微镜的设计通常是试样进行扫描的方法,通过该方法的基础上。 两个基本的扫描装置扫描的阶段或照明光束,并且有至少有两个根本不同的光束扫描的方法。 明斯基原来的设计是一个阶段的扫描系统,这是由一个原始的音叉装置驱动,并在建立一个图象,它是相当缓慢的。 现阶段扫描共聚焦已经从最初的概念设计,主要用于在材料科学中的应用,如微型芯片业。 根据这一原则的系统最近已成为流行在医学领域的应用,涉及微芯片上的DNA筛查。

最成像的生物系统的一个更实际的选择是扫描的照明束在一个固定的试样。 这种方法是许多研究显微镜,盛行的今天,已经演变成系统的基础。 共聚焦显微镜中所涉及的技术细节没有处理,在此介绍,但基本上是两种根本不同的光束扫描的方法使用多束扫描和单光束扫描。单束扫描是目前国际上最流行的,是在激光共聚焦显微镜使用的方法。 在这里,扫描光束是最常见的通过使用一个帧每秒的速率由电流计驱动的计算机控制的反射镜来实现。 为了实现更快的扫描速度,在附近的视频帧速率,某些系统中使用的声光器件,或摆动的反射镜。 另一种方法使用两束光的实时扫描,通常依赖于使用某种形式的纺丝尼普科夫盘。 这种系统已经被来自串联扫描显微镜(TSM),与荧光标记的样本采集图像,使它们更有效率的改进。图5示出这样一个改进的系统,它采用双尼普科夫盘和微透镜,以提高检测的低荧光水平的实时图像采集。

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目前有两种方法共聚焦显微镜在使用用于生产光学部分:卷积和多光子成像。 他们技术上的不同,但像聚焦的方法,都是基于传统的光学显微镜 解卷积算法使用基于计算机的计算和消除焦荧光图像信息。 由于更高效的算法和更快的微型计算机,这种技术已经成为一个实际的成像选项。 多光子显微镜使用相同的扫描系统的激光扫描共聚焦显微镜,但不要求在检测器的针孔孔径。 针孔是不必要的,因为激光激发荧光染料的标签仅在对焦点,从而消除了out-of-聚焦发射。 成像的生物体组织中的一个额外的好处是,在试样中,由于从激光束吸收的能量减少降低光漂白。

传统光学显微镜形成围绕其内置的激光扫描共聚焦显微镜的基础。 取而代之的是钨或汞灯,激光作为光源使用,并结合一个敏感的光电倍增管(PMT)检测器,和一个计算机控制扫描反射镜或其他扫描装置,以便收集和显示图像。 采集后的图像被存储在数字媒体,并且可以分析任何的众多图像处理软件产品的可使用显微镜系统的计算机或第二台计算机。

通过激光扫描共聚焦显微镜的设计,照明和探测被限制到一个单一的衍射限制的点在试样。这一点上的照明带来集中在试样通过物镜,并穿过它,使用某种类型的扫描装置在计算机控制下的扫描。 从检体的光点的序列中检测由光电倍增管通过一个针孔(或在某些情况下,狭缝),构建成一个图像,并从PMT的输出由计算机显示的。 虽然未染色的试样从试样反射回来的光可以被视为使用,他们通常被标记为与一个或多个荧光探针。

更多的商业的成功LSCMs,在文献中报道1990年左右,发育生物学家遇到一个令人困惑的根本问题。 许多免疫荧光标记的胚胎内部结构和具体的大分子后两细胞阶段,使用传统的荧光显微镜图像是不可能的,因为细胞数量增加,整体成交量仍然大致相同的胚胎。 这意味着,随着越来越紧密的包装细胞,从任何给定的焦平面还干扰的图像分辨率,满分细胞的荧光增加。

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工作的问题上一组研究人员发现,没有共聚焦系统时可用的满足他们的需求。 的时间的技术,包括扫描显微镜,在产生图像的速度太慢,以约10秒为一个图像,多光束扫描仪器,这是不实际的荧光成像在那个时候在其发展阶段。 A激光扫描共聚焦显微镜设计,适合常规荧光显微镜,连同其他几个人在同一时期开发的精密仪器,生物医学界现已从一些商业厂商,成为一个先行者。 当前可用的系统(尼康E1000)的一个典型例子在图6中示出。

在开发的专用仪器,光学部分的厚度可以变化,通过调节在光电检测器前的直径的针孔。 相比一些其他的设计,使用一个固定针孔大小,这种光学成像生物结构的变化是非常灵活的。图像可以通过减少试样在扫描该区域的面积,并把扫描到的信息进行存储或显示的数字阵列相同的大小(以类似的方式改变放大率的扫描型电子显微镜放大没有丧失决议)。 做到这一点的能力赋予一个物镜的倍率范围内,和成像时罕见的或瞬态事件可能被遗漏或丢失,如果必须改变透镜的位置,可以是非常有用的。

由于现在可从商业供应商的LSCMs的复杂性和灵活性,在最近几年一直在共聚焦显微镜的普及了巨大的爆炸,有许多多用户购买这些工具优先电子显微镜实验室。 共聚焦显微镜的优势相对容易地获得极高质量的图像可以从传统的光学显微镜标本准备,并在其大量的应用在许多领域目前的研究兴趣。

行之有效的第一代LSCMs的固定的标本,他们使用从激光的光能量,但非常浪费,往往杀死活标本,除非采取非常谨慎,以保持自己的生存能力,同时他们被成像。 尽管有局限性,影像显微镜所产生的固定材料是如此之好,生物成像专家聚焦的方法完全接受。 技术方面做了改进,在随后的几代仪器的成像过程中的每一个方面。 此外,较新的工具的人体工程学设计和可用性的很多改进,使之对应,改变过滤器的组合,并调整激光功率,现在通常由软件控制,更容易,更费时。 现在是可能的图像同时三个荧光染料,比顺序。 的图像处理阶段,也更加发达,由于改进的,更可靠的软件,并更迅速地与更多的磁盘存储空间和更多的计算机,且成本较低,随机存取存储器。