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徕卡显微镜:膜片钳技术

2013-10-16  发布者:admin 

特别是在神经科学,生理的离子通道一直感兴趣的主要话题。膜片钳技术的发展,20世纪70年代中后期,电生理学家新的前景。它允许高精度电流录音不仅整个细胞,同时也切除蜂窝补丁。即使单通道开幕活动进行调查。然而,由于其复杂的技术,物理和生物的背景中,需要高灵敏度的设备和实验者所需量庞大的技能,电仍然是在实验室的日常工作​​中最具挑战性的方法之一。

 

 

 

Fig_2_Neuron_with_a_patch_pipette

 

 2:使用相位对比图像的补丁吸管连接到一个培养的小鼠海马神经元的细胞膜。德国波鸿鲁尔大学,阿瓜多Ainhara博士的礼貌

 

 

 

配置

根据不同的研究兴趣,不同的配置都可以使用。细胞贴附模式膜修补程序保持不变(图3)。的修改的细胞连接模式是松散的膜片在这种情况下,移液管没有紧密地密封的膜,但仅松散地连接到它。此模式通常用于记录神经细胞的动作电位的。它的优点是不影响组合物的细胞质。然而,另一方面,不能被控制的细 ​​胞内环境。

成孔剂(通常是抗生素)应用通过补丁吸管的查询结果中的穿孔膜片保证离子的连续性,但是,保证电极内液,细胞内的蛋白质,不洗涤。最常用的膜片钳模式是全细胞模式(图3)。要实现这一模式,膜修补程序被打乱通过短暂申请吸力强劲。的移液管的内部,成为连续的细胞质中。这个方法是用来记录从整个细胞的电势和电流。全细胞测量的研究人员可以选择两种配置之间的电压钳位电压保持恒定和电流记录模式,在该模式下,或其中电流被保持恒定的电流钳模式和中膜电位的变化可以得到遵守。

此外,它也可以只从一个小的补丁,而不是整个细胞记录电流。这就提出了一个记录单一渠道的机会。补丁可定向补丁吸管内的两个不同的方向。为了实现内到外的配置的补丁吸管连接到细胞膜和,然后缩回折断一小片膜(图3)。在这种情况下,胞浆膜表面的露出。这通常被用来进行调查的暴露于细胞内表面的介质的优点是,可以进行修改,单个信道的活动。

如果物镜是研究线索,如神经递质的影响外,配置(图3)应选择。在这种情况下的移液管在全细胞配置缩回,导致膜的断裂和重排。在此配置中,细胞外表面暴露,从而可以很容易地应用于细胞外线索。

 

 
Figure-3b
 3:四个膜片钳记录方法:细胞贴附:当吸液管是在最接近细胞膜,温和的吸力被施加到获得移液管和膜之间的紧密的密封。全细胞:通过应用另一个简短,但吸力强劲,细胞膜破裂和吸管进入到细胞质。内到外的:在细胞贴附模式,移液管收缩和修补程序是分开的膜的其余部分,并暴露在空气中的。的细胞质的膜表面被暴露。外:在全细胞模式,导致两小块膜重新连接并形成一个小泡状结构与细胞质面朝内液吸管缩回。
 
 
 
 

要求

膜片钳实验可以进行培养细胞,急性分离细胞或急性vibratome的片,它允许在自然环境中细胞的电生理特性的调查。感兴趣的离子通道也可以在一个共同的细胞系(如HEK293,CHO,LNCaP细胞)进行分离和异质性表达。

根据样品的,无论是一个倒置的(培养细胞)或需要一个直立的固定载物台的显微镜(片)与一个稳定的平台。如果急性切片的细胞​​进行了研究,红外DIC建议可视化膜。应放置在显微镜上防振表可能是致命的,因为任何移动的移液管和膜之间的密封。

显微需要精确移液管。形成很细的移液管,通过加热和拉小的玻璃或石英毛细管。吸液管尖端的直径为1微米左右,封闭膜修补程序,其中包含只有少数或者甚至只是一个离子通道。移液管的尖端热抛光获得的高电阻膜的密封件压在微段。充满了一个解决方案,或者类似的细胞外溶液或细胞质中,根据在记录模式下的移液管。吸移管被安装在显微向细胞膜,以允许精确的动作。

使用氯化银线的电流的电导。将染液的电极,这也是一种氯化银焊丝,设定的电流值为零。一个低噪声晶体管差分放大器连接到计算机进行数据采集和数字化。可以购买特定的软件来控制的放大器和分析数据。一个示波器也可以用于监视的电流。如果需要,可以添加灌注系统的设置。物质可以被应用通过灌注铅笔或通过使用一个POC(灌注开式和闭式)室。

应用

膜片钳实验中被用来接近生理问题,种类繁多的,不仅在神经科学。在过去的二十年期间,膜片钳记录也变得越来越重要,在非兴奋细胞离子通道的调查。这也是一个很重要的方法在医学研究中,因为许多疾病都与确定的离子通道的故障。药理研究,自动化膜片钳是用来筛选烈性物质的离子通道修改。

膜片钳记录,也可以结合如Ca 2 +成像与活细胞成像方法在这种情况下的Ca 2 +敏感的荧光染料被施加到通过补丁吸管细胞。同时记录膜电流的荧光变化。pH值或Cl -敏感的染料,可以进行类似的实验

历史背景

路易吉·伽伐尼的开拓性工作的18 世纪和工作的埃米尔·杜Bois-REYMOND的,约翰内斯·彼得·米勒和赫尔曼·冯·亥姆霍兹的19 世纪开始,细胞膜和细胞兴奋始终重大利益进行研究,对神经的系统。艾伦·劳埃德·霍奇金淋巴瘤和安德鲁·赫胥黎于1952年揭示了离子通道的动作电位的事件,使用的电压钳技术,并于1963年被授予诺贝尔生理学和医学奖的杰出工作。 

在这个时候,只能施加的电压钳位到相当大的细胞,作为尖锐的微电极,需要穿透细胞膜。在20世纪70年代后期,伯特索克曼和埃尔温·内尔精致的电压钳技术,并第一次跨越的青蛙骨骼肌膜补丁解决了单个通道电流。他们还荣获了诺贝尔生理学和医学奖(1991年)。下一个突破是发明于1980年由恩斯特索克曼千兆密封,极大地提高了信号噪声比,并允许更小的电流记录。

电,率先在特殊的生物物理实验室,现在已经扩大到基本的生物学和医学研究,并成为在神经系统中的单个细胞或整个蜂窝网络的行为进行调查的最重要的工具之一。

基本原理

膜片钳技术允许一小甚至单离子通道的调查。因此,它是特殊的兴奋细胞,如神经细胞,心肌细胞和肌肉纤维的研究兴趣。

单离子通道进行每秒约10亿离子。然而,电流只有几皮安。记录在这个量级的电流是相当具有挑战性,不仅为研究员​​,同时也为设备。原则上,薄板玻璃或石英一钝头的移液管被密封到膜(图2,3)。

吸入被施加到辅助密封在千兆欧姆范围内的高电阻的发展。这种紧密的密封电隔离膜补丁,表示所有助熔剂膜补丁的移液管流入的离子,并记录由氯化银电极连接到一个高度敏感的电子放大器。浴电极是用来设置为零电平。

为了防止在膜电位的改变,类似于通过膜流动的电流所产生的机制(图1)作为一个负反馈放大器的补偿电流。

细胞的膜电位的测量和相比,命令潜力。如果有命令潜力和测量之间的差异,将被注入的电流。这种补偿电流将被记录,并允许膜电导的结论。膜电位可以被操纵独立的离子电流,这使得膜通道的电流 - 电压关系的调查。

基本原理膜片钳记录

 1:基本原理膜片钳记录。含有电解液的玻璃移液管紧密地密封到细胞膜上,从而电隔离膜补丁。熔剂通过通道中的电流,因此,在此修补程序的移液管的流入,可记录的电极,其连接到差分放大器的一个高度敏感的。在电压钳位配置中,电流被注入到细胞中,通过负反馈回路补偿膜电位的变化。录制该电流使膜电导的结论。