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尼康显微镜:荧光共聚焦显微镜的关键环节

2013-10-16  发布者:admin 

我们都知道,荧光显微照片显示的位置在一个组织的标记分子,对吗?好吧,也许不是。事实上,所有你可以的真的确定测量与大多数激光扫描共聚焦显微镜,荧光模式是在一个特定的时间收集的光子数量的某些功能。我们希望这是一个准确的衡量一个或两个有趣的参数 - 本地物浓度或当地的离子浓度。事实上,许多因素会影响实际存储在计算机内存中,在任何给定时刻的数值。

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甲图1中所示的流程图的一个通用的激光扫描共聚焦显微镜,示出一个数字“39”在文中提到的功能的位置。所示的系统是基于一个倒置的光学显微镜,其被配置为活细胞成像。在下面的文本称为单个组件被标记为图中的(a)至(克)以字母。该图包括三个光学部分,在不同的高度,沿Z轴方向通过抗体标记的果蝇胚胎,指定为Z1Z2Z3的

多年来,学生采取立体显微镜活细胞当然每年六月举行的加拿大英属哥伦比亚大学,编制了一份清单,这些外来因素。在第一年,增长到39个条目的列表,所以我们借用希区柯克电影的名字,我们的名单上。此后,名单继续成长!(在球场上的更多信息,可以发现在网络上的3-D显微镜课程布告栏)。

这篇文章虽然不能完全形容每学期,简洁和有用的解释。出现的条款与其他条款粗体字粗体字和许多互动。请注意,这些变量通常被认为是影响空间分辨率。因为降低分辨率转换成“把相同数量的令人兴奋的光子成一个较大的现货”,他们在这里列出。这降低了激发光强度 - 一个给定的分子所产生的光子的数量 - 和小部分,被检测到的这些。人们常常忘记,荧光共聚焦显微镜的正常信号电平对应的最亮区域只有10-20光子/像素。在这样的条件下,统计噪声,是一个重要的限制的空间分辨率比由阿贝方程定义:

在公式中,dmin表示在一个周期光栅,刚好可以分辨出来的最小间距,和被表示为在试样空间的横向距离; λ0是光在真空中的波长,NAobj和NAcond的目的和聚光透镜的数值孔径,分别。方程式建立的目的和聚光镜的数值孔径,对于一个给定波长的光,在确定图像分辨率的作用。

激光单元(图1(a))是照明源,并在一般情况下,所测得的荧光的激光功率电平成比例。虽然通常调节激光输出功率的总计,在每一行的多行的激光的功率量可能不会是,随着时间的推移可能在很宽的范围内变化。波长会影响光学性能,通过染料的吸收光谱,确定产生的荧光的量。

输出功率不稳定往往是噪声,它的不稳定通常是不到1%,但激光器可以变得越来越不稳定,因为他们的年龄。由于灰尘,未对准,或机械不稳定性可能会导致随机变化的10%-30%,连接光纤的光耦合的效率(如果使用的话)是至关重要的。

对准激光反射镜和反射特性可以是源长期漂移激光输出。由于是由激 ​​光反射镜的激光源,束指向误差和/对齐是重要的。的不稳定性在这里将显示为亮度变化,因为在视在源的位置的变化将改变耦合到大多数仪器中使用的单模光纤中的激光的光学系统的效率。

物镜数值孔径(图1(b))的影响由样品发射的光,可以收集到的馏分。从激光的光,这也是真实的。

物镜放大倍率的物镜入射光瞳的直径成反比关系。物镜才会正常运作,如果整个入瞳充满了令人兴奋的激光。底部填充会降低空间分辨率和强度的峰值。载入过多会导致,一些激光光线射入金属安装的目的和丢失,也降低了强度当场。

清洁度是很重要的,脏的光学系统产生更大和调光的斑点。 随波长变化的变速器(小部分入射的光,可以集中到一个点上,它的另一侧上的物镜)。小心使用一些相对较新,在红外范围内的多层光学 色和球面像差都使斑点较大,并且随波长而异。此外,球面像差与盖玻片的厚度和折射率的浸泡和嵌入介质强烈变化。

衍射的光学分辨率限制是不可避免的。它可以有效地扩大小于衍射极限的物体的形象,使他们比他们应该显得暗淡。

扫描系统(图1(c)),特别是变焦倍率的控制,确定试样处的像素的大小。奈奎斯特采样,像素应该是至少2倍小于最小的功能,你希望看到在你的标本。假设瑞利判据200纳米的分辨率,像素应该是小于100纳米。较大的欠生产,减少记录的亮度小的特点。

漂白率影响,变焦倍率的平方成正比。至于扫描速度,时间越长,在一个特定的像素停留时间,更多的信号将被检测到的越少,它会被扭曲的泊松噪声。在高扫描速度(小于100毫微秒/像素),信号来自染料,荧光衰减常数,比这更长的停留时间可减少。

光栅尺寸 -在变焦倍率一起,沿着栅格的边缘的像素的数目将确定的像素大小。更多的像素(1024×1024相对于512×512)使欠的可能性较小,但意味着必须在每个像素上花费更少的时间,收集的光子的数量减少,增加泊松噪声,或更多的时间来扫描放大图像和可能导致更加漂白。的光学元件或扫描镜可以引入对象的形状和图像之间的不一致,可能导致的几何畸变环境是很重要的:振动和杂散电磁场可引起多种设备,例如,冷却风扇。这些可能会造成镜不当,导致扭曲变形,可能会随时间而改变。

其他的光学系统包括传输,它描述了一定程度的吸收和反射损失的情况下,在光学元件,特别是中性密度或带通滤波器,分束器和物镜空气/玻璃界面 反射通常代表丢失的信号,但可能出现无关的亮点。标本结构。 镜子反射红外线和紫外线的波长可以是一个强大的功能,降低湿度和灰尘暴露。

盖玻片的厚度是最昂贵的光学元件,最有可能被不小心选择。它应该是170±5微米的厚度。至于浸油,其折射率必须精确匹配所使用的物镜。这可能只发生在一个小的温度范围内,或者,也可以是自定义混合。聚焦平面的位置是很重要的,因为一个特征略高于或低于对焦平面比的焦点的平面中的功能,会出现调光器。收集三维数据时,还必须实行奈奎斯特采样的z平面的间距。最后,机械漂移的载物台,可能会导致实际的对象平面的成像随着时间而改变。

感兴趣的染料的浓度可能是你正试图测量 渗透到(或空间排阻)标本往往是离子强度和pH的函数。吸收截面是由染料分子将被吸收的激动人心的光子通量的分数的测定。它的共轭探头,pH值,特定的离子浓度,离子强度的影响的方法。

量子效率描述了从一个令人兴奋的光子吸收的能量将被重新作为荧光光子辐射的机会。它是一种强的波长的函数,还受pH值,离子浓度,离子强度和染料-蛋白质相互作用。 发生单线态饱和,大于一毫瓦的激光功率时,使用具有高数值孔径的物镜。然后,光的强度足以将大部分的染料分子接近交叉成激发态,有效的减少了染料的量子效率。

装载是指你投入你的手机的染料量。重要的变量包括的染料分子的数目/抗体或其它蛋白质标记,和协议,用于固定/通透 淬火附近的其他人从一个染料分子发出的荧光的吸收。 卸载是指染色,在细胞中,但现在已经被抽出,或以其它方式失活。

基材反应率,适用于染料的荧光性质,他们在细胞的离子或其它分子的相互作用有关。像素住的微秒的量级,所以有可能没有足够的时间,以达到平衡。 Prebleaching指漂白的染料在本测定之前。

条块的再分配是由细胞内过程的染料, 染料/染料的相互作用不仅指淬火刚才提到的,而且荧光共振能量转移(FRET)。出现这种情况时的发射光谱的第二个染料分子的吸收光谱,相差几纳米的一种染料重叠。 FRET可以导致只是在第二染料的发光波长的光的发射。通常情况下,如果第二个分子中没有荧光,荧光丢失或骤冷。在试样上的影响,染料可能会影响许多环境变量包括试样的可行性的恶化。

试样的折射率(图图1(d))和其包埋剂将确定存在的球面像差的严重程度。即使观赏水生物标本使用水物镜,本场比赛是不可能是完美的,甚至是贴身。此类型的球面像差的信号损失的增加穿透深度是主要原因。

用正确的折射率和色散(折射率随波长的变化),重要的是使用浸油此外,请务必将作为浸泡介质中的镜头有没有气泡。检查通过集中向上和向下伯特兰透镜用于调整你的相位环。

试样至关重要的状态可能会影响的实验结果的,因为,例如,死亡的细胞有不同的形状,大小和比活的离子环境。 自发荧光是指内源性荧光化合物的存在下。这些分子的效率可能会发生变化,pH值,离子浓度,代谢状态。附加的自体荧光,可通过将不正确的固定,特别是当使用戊二醛。

折射结构或细胞器之间的物镜和焦点的平面,例如,外球面球脂质,重新聚焦光束到一个完全陌生的位置。较小的特点,可能有较小的影响,但出的光束的散射光强度降低激发点,因此,检测到的信号的折射功能。其累积效应也具有远高于水的折射率的细胞。

聚焦平面的上方或下方的高度染色的结构存在或不存在于z分辨率是有限的。大型结构还可以吸收大量的兴奋的光芒,如果高度染色。

的信号,通过针孔(图第1(e))的针孔(或大小),这是通常被设置为等于艾里斑的直径的平面的直径的平方成正比针孔 对齐是重要的,应与针孔的中心重合的图像的激光聚焦到样品上,然后通过光学系统重新聚焦回。

该检测器(图1(g))通常是一个光电倍增管(PMT)。检测到的信号是成正比的量子效率实际的最共焦的工具中使用的光电倍增管的量子效率从约15%下降到约4%,在光谱的红端的蓝色端。至于响应时间:大多数荧光信号可以迅速放大,但其他国家,如跨膜电流探测器,响应速度很慢,慢扫描速度必要。

PMT电压决定了扩增的PMT。增加了50伏对应至约两增益的一个因素。要注意的是光电倍增管的黑电平(亮度)控制允许的任意一个提出的数字化仪从信号量的加法或减法。应设置的黑电平中的最暗部分的图像,使该信号电平是5-10的数字单元。

有许多可能的噪声,都将扭曲的入账价值。通常情况下,光电倍增管产生的暗电流噪声,是比较小的信号电平。然而,这同样允许成为温水或观看时光线染色标本对红色敏感的光电倍增管。除了 ​​从任何杂散光,可能无意中达到的PMT,剩下的主要噪声源是泊松噪音或统计。这是等于记录,可在给定的像素的光子数的平方根。其结果是,在较高的信号电平变大,即使信号与噪声的比率提高。

数字化中,通常使用一台计算机(图1(g))应该是线性的。数字转换器的“8位”显微镜的电子信号必须是要被记录在1和255之间的尺寸。由于噪声统计,10和220之间的值,是更安全。数字转换因子是指检测到的光子的数目和存储的号码之间的比率。这取决于对光电倍增管的电压和其他的电子增益,但通常为约30正常标本记录,可对8位工具。

记住,要准确地测量这些因素之一,一个人必须持有其他38个常数。祝你好运!

 

dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)