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徕卡显微镜:三维超分辨率GSDIM显微镜

2013-10-16  发布者:admin 

蜂窝条块维持细胞骨架的轨道在水疱结构沿靶蛋白贩运。这些细胞成分的详细特征是了解细胞功能至关重要。基于单分子定位的超分辨率成像方法已经开始把这​​些小的结构成为关注的焦点。

GSDIM(地面的状态耗尽显微镜其次个别分子回报)可用于细胞车厢参与贩运蛋白质,如高尔基体和微管网络,以获得详细的关键洞察。随着新的的3D GSDIM技术徕卡SR GSD 3D),这些结构不仅解决横向,而且在第三个维度。的原理是基于使用的光学散光,以确定个别的荧光染料的精确的侧向和轴向位置。这种技术的另一个巨大优势是使用标准荧光和普通染色协议的可能性易于使用GSD向导简化的三维图像重建和处理。这种方法允许蜂窝结构具有横向分辨率下降到20纳米约70nm轴向分辨率的三维成像

 

 

Graphic_SR_GSD_3D

 

 1:个别荧光基团的三维定位。

  

高功率激光的徕卡SR GSD 3D系统可以切换广泛的荧光染料,可以在很短的时间,搜集了大量的光子荧光抗体和Alexa的染料,也用于古典萤光允许研究人员使用一套。高功率激光物镜具有160倍的放大倍率,另外单分子在高分辨率的精确定位。对于这样的精度,需要一段较长的时间。成像期内非漂流样本的前提是通过相扑(禁止运动)阶段的技术,最大限度地减少横向漂移不到20 nm/10分钟。

在三维可视化车厢蜂窝物流

徕卡SR GSD 3D系统是一种新型的本地化显微镜方法,在第三维度的高分辨率显示细胞车厢。要了解运输过程中的极化上皮细胞不同的细胞器的精确定位参与贩运蛋白质是必要的。利用高分辨率的GSD显微镜未能分析高尔基体基质蛋白GM130,线粒体的ATP合成酶ATP的-2B和detyrosinated的的微管(微管蛋白detyr)。MDCK细胞的野生型细胞,用冰冷的甲醇或4%PFA固定于盖玻片上培养一天。阻止将细胞用1%牛奶粉末或1%BSA(牛血清白蛋白)在PBS + +(PBS 1 mM的CaCl 2的和1 mM的MgCl 2的)和免疫染色,进行通过使用抗体针对GM130,ATP-2B或detyr微管蛋白。一抗标记抗体Alexa647耦合,用100mM的MEA(β-巯基乙胺)的PBS作为包埋剂。高尔基体标记的圆形结构GM130面临的高尔基体腔中(图2A)的超分辨率。除了​​2D图像的详细信息的落射荧光图像相比,第三维清楚地定义了使用的颜色渐变,该值指示从0-800 nm的z轴在此隔室中的细胞定位。虽然线粒体和微管中的2D,GSD图像(图2B),已经很好地解决三维GSD超分辨率图像显示线粒体定位在接近微管,表明这些细胞器和细胞骨架的轨道的移动。

 

蛋白质运输和上皮细胞分化

极性的上皮细胞的功能的器官的先决条件。他们建立一个单分子层的外表面上的脏器,器官和环境之间提供了一个阻挡和交换系统。上皮细胞的极化结构,其特征在于由两个不同的域的质膜,心尖朝向域的器官腔体和细胞 - 细胞和细胞 - 细胞外基质的接触发生时,基底域。这两种膜域分隔紧密连接,并表现出不同的蛋白质和脂质成分。为了保持这种极性,上皮细胞演变的一个非常具体的极化分拣他们的物镜膜蛋白质和脂类。

根尖蛋白质的分类需要的各种不同的途径到细胞表面的各种排序的信号。糖基肌醇(GPI)锚,以及参与的N和O-聚糖识别作为根尖排序信号。分选通路由所运输的脂筏蛋白的亲合性,可以细分。因此,存在的脂质筏依赖和非依赖途径。因此,蛋白质分离成不同的囊泡群体在高尔基体网络(TGN)或后高尔基体隔室

分拣过程涉及许多蛋白质,是必不可少的正确交付货物的蛋白质。一个重要的排序受体是半乳糖凝集素-3。它可以由于它们的糖基化的具体货物绑定到传输到正确的质膜此外,细胞骨架肌动蛋白微丝和微管形成的轨迹在这个过程中所涉及的分泌泡和细胞器的运动。都需要特别长的段落在细胞内的微管。它们包括α-和β-微管蛋白的聚合二聚体的亚基。翻译后修饰,如微管蛋白的酪氨酸残基,其中α-微管蛋白的C端结构域添加或删除tyrosination detyrosination,需要正确交付货物的顶膜

高度解决GSDIM图像描绘沿着单个分子的分布这些修改,并可以解决细胞成分中所涉及的极化蛋白贩运详细。

 

 

 

 

三维GSD的原理

衍射障碍限制了传统光学显微镜的成像分辨率的横向尺寸在200-300纳米和500-800纳米的轴向尺寸,留下许多细胞器和结构无法解决的。许多蜂窝结构要小得多,如高尔基体潴像煎饼间隔排列<100 nm的分开,ATP合酶相隔间距10纳米内线粒体膜,微管是由二聚亚基形成空心棒25纳米外径。一些方法已被用来克服这个衍射极限,以二维的超分辨率显微镜技术,如受激发射损耗(STED)显微镜,光活化定位显微镜(PALM),随机光学重建显微镜(风暴),其次是个别的基态耗尽分子的回报(GSDIM)显微镜。直接随机光学重建显微镜(dSTORM)的最近的3D GSDIM显微镜(徕卡SR GSD 3D),蜂窝室就可以解决的第三个维度。

在dSTORM GSDIM显微镜的荧光的确切位置,确定基于时空分离的原则。这就需要开关之间的打开和关闭状态,然后顺序读出的荧光染料。在一个实验的开始,大部分的荧光染料转移到一个长期生活的黑暗状态(关闭状态),通过采用高强度激光。只有单分子将返回到ON状态随机切换回之前的黑暗状态,并发出荧光的时间很短。这些分子的荧光信号周期,从暗到亮的状态,回到黑暗状态,随着时间的推移被记录。最后,超分辨率图像重建的图像由数千

将被描绘成一个点扩散函数(PSF)几百纳米大小的荧光信号。但是可适应的PSF /调整的一个两维高斯函数本地化的分子的确切位置。分子的位置的精确度依赖于信号强度,即收集的光子的数量的分辨率是通过增加检测时间上彼此分离的单荧光斑点。

为了使定位在z方向上的单荧光团,用于引入到显微镜的成像路径中的柱面透镜的散光效果。其结果是荧光点的椭圆率和方向的变化取决于其在z维度的位置,从而使三维重建。当在焦平面的荧光,图像出现一轮。当荧光团是下面的重点,在垂直方向上的图像的光点形状是细长的,反之,高于的焦点位置时,它是当场在水平方向上延伸。

 

A)

  • Golgi-WF
  • Golgi-2D-GSD

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

B)

 

  • Mito-MT-WF
  • Mito-MT-2D-GSD

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 2:广角镜,2D GSDIM和3D GSDIM显微镜的比较。
)MDCK细胞培养盖玻片,固定和高尔基体基质蛋白gm130/Alexa647免疫染色。比例尺条为2μm 
B)的盖玻片上生长的MDCK细胞中线粒体的ATP合成酶固定和染色使用抗ATP-2B使用一个反detyr的微管蛋白抗体的抗体和微管。两人被打成Alexa647耦合二次抗体。比例尺条为2μm。渐变的颜色表示的x轴0-800纳米。

展望

超分辨率GSDIM的有助于阐明本地化的组件中所涉及的更详细的极化蛋白贩运,因此揭示以前悬而未决的运输机制。三维GSD的图​​像显示了在常规落射荧光图像分辨率提高,而且,它提供了,这不是所提供的2D图像的3D信息。使用在三维的这个超分辨率技术,这将有可能监测蛋白运输通路的多个组件,如运输小泡,在未来。徕卡SR GSD 3D是一个新的超分辨率显微镜多应用平台,包括TIRF,广角和超分辨率更深入的了解,使基本过程在细胞内。