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奥林巴斯显微镜:什么是共聚焦显微镜?

2013-10-16  发布者:admin 

共聚焦显微镜提供了比传统的宽视场光学显微镜的几大优势,包括深入现场,消除或减少的背景信息的焦平面(即导致图像退化)的控制能力,并有能力从厚标本收集串行光学部分基本键的共焦方法是利用空间滤波技术,以消除在标本的厚度超过了立即的焦点平面的聚焦光或眩光。已经有一个巨大的爆炸在激光共聚焦显微镜的普及,近年来,部分原因是由于相对容易地获得极高质量的图像可以从常规荧光显微镜标本准备,以及越来越多的应用在细胞生物学依靠固定和活细胞和组织成像。实际上,激光共聚焦技术被证明是以往任何时候都实现在光学显微镜中最重要的进步之一。

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在传统的广角光学落射荧光显微镜,常发生继发标本发出的荧光通过兴奋体积和客观焦平面功能在于掩盖分辨率。由较厚的标本(大于2微米),通常表现出荧光发射高度的最精细的细节丢失的问题是复杂的。共聚焦显微镜提供只有很小的改进在两个轴向(Z ;沿着光轴)和横向(X Y在试样平面)的光学分辨率,但是能够排除继发的焦平面中删除的区域,从得到的图像的荧光。虽然分辨率有所提高,比传统的宽视场技术的共聚焦显微镜,它仍然是相当少的比透射型电子显微镜。在这方面,激光共聚焦显微镜,可以考虑这两个经典的方法之间的桥梁。

图1给出的是一系列的图像比较选择viewfields,在传统的广角和激光扫描共聚焦荧光显微镜。人类髓质广角荧光荧光染色厚的部分展品大量眩光焦平面上方和下方的荧光结构(图1(a))。当成像激光扫描共聚焦显微镜(图1(D)),髓质厚部分揭示了一个显着的结构细节程度。同样地,整个兔肌肉纤维的宽视场荧光成像用荧光素染色,产生模糊的图像(图1(b)),缺少细节,而同一标本字段(图第1(e))揭示了在共聚焦显微镜的纹状地形。向日葵花粉颗粒的自体荧光产生一个模糊的轮廓基本的外部形态(图1(C)),但产生的内部结构没有迹象。与此相反,一个薄的光学部分相同的晶粒(图1(g)),用共焦技术获得显示的粒子芯部和周边包络之间发生显着变化。

历史视角

共聚焦显微镜的基本概念最初是由马文·明斯基在20世纪50年代中期(于1957年获得专利),当他是哈佛大学的博士后学生。明斯基在未染色的脑组织准备,并希望图像的神经网络,图像生物事件发生在他们生活系统的愿望驱使下。明斯基的发明仍然在很大程度上被忽视,因为最有可能缺乏强光源必要的成像和计算机需要处理大量数据的马力。明斯基的同事,M. David Egger和Mojmir Petran fabricated上一个20世纪60年代中后期,多光束激光共聚焦显微镜利用一个旋转(尼普科夫)磁盘检查未染色的脑切片和神经节细胞。艾格继续在这个舞台上,继续开发的第一个机械扫描的激光共聚焦显微镜,并于1973年出版了第一个可识别的细胞图像。在20世纪70年代末和20世纪80年代,在计算机和激光技术的进步,加上新算法的图像数字操纵,导致越来越大的兴趣在激光共聚焦显微镜。

碰巧的是,明斯基的专利过期后不久,实用激光扫描共聚焦显微镜设计工作手段翻译成一些研究者。荷兰物理学家G. Fred Brakenhoff开发扫描共焦显微镜在1979年,而几乎同时,科林·谢泼德的理论形成图像的技术贡献。布拉德·阿莫斯,托尼·威尔逊,约翰·怀特培育的概念及更高版本(在80年代末),在考试中的荧光生物标本展示聚焦成像的效用。出现在1987年第一个商业工具。在20世纪90年代,光学和电子学的进步,得到了更加稳定和强大的激光器,高效率的扫描镜单元,高通量的光纤,更好的薄膜介质涂料,和探测器具有降低噪音特性。此外,荧光染料激光激发线更仔细匹配开始合成。加上迅速发展的计算机处理速度,增强了显示器,大容量存储技术,20世纪90年代中后期出现,舞台已经搭好了一个虚拟的爆炸激光扫描共聚焦显微镜的应用程序,可以有针对性的数量。

完全集成的电子系统中,在光学显微镜的结构,它由一个或多个电子检测器,一台计算机(图像显示,处理,输出,和存储),和一些激光系统中起着核心的作用可以被认为是现代共聚焦显微镜波长选择装置和光束扫描组件结合。在大多数情况下,在各个组件之间的集成是如此的彻底,整个共聚焦显微镜,通常统称为数字或视频成像系统能够生产电子影像。现在被雇用这些显微镜进行例行调查,在分子,细胞和活组织,仅仅在几年前是不可能的。

共聚焦显微镜的原理

落射荧光激光扫描显微镜共聚焦原理图如图2所示。发出的相干光的激光系统(激励源)通过一个针孔孔径,位于在一个共轭面(共焦),在试样上的扫描点定位在前面的检测器(光电倍增管)和第二针孔孔径。由于激光二色性反射镜被反射,并扫描整个试样,在一个确定的焦平面,二次发射的荧光点在试样上(在相同的焦平面)传回通过二色镜,上面的共聚焦点集中探测器针孔光圈。

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显着量的荧光发射发生在点的上方和下方的物镜焦平面不是共焦针孔(称为对焦的光线在图2中),在孔径平面形式延伸艾里磁盘。因为只有一小部分的满分聚焦荧光发射是通过针孔孔径,大部分外来光的未检测到的光电倍增管和不向所产生的影像。二色镜,屏障过滤器,激发滤光器执行类似的功能相同的部件,在宽视场落射荧光显微镜。再聚焦共焦显微镜中的目标转移到新的共焦针孔的光的光源和检测器的孔的平面,成为在试样的激发和发射点。

在传统的宽视场落射荧光显微镜,整个标本进行强光照射,从一个不连贯的汞或氙弧放电灯,二次荧光发射所产生的影像可直接在目镜观察或投影到的表面的电子阵列检测器或传统胶片平面。在这个简单的概念相反,在共聚焦显微镜的图像形成的机理是根本不同的。正如上面所讨论的共聚焦荧光显微镜包括多个激光激励源,一个扫描头,带有光学和电子元件,电子检测器(通常是光电倍增管),以及计算机采集,处理,分析,和显示的图像。

扫描头是在共聚焦系统的心脏,并负责光栅化的激发扫描,以及从检体收集的光子信号所需要的组装的最终图像。一种典型的扫描头包含从外部激光光源,荧光过滤器设置和调整为不同荧光波长的色镜,光栅扫描振镜反射镜系统,可变针孔孔径产生的共聚焦图像,光电倍增管检测器的输入。扫描头组件的总布置图3为一个典型的商业单元。

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在落射照明扫描共聚焦显微镜,激光光源和光电倍增管检测器都从试样分离的目的,它的功能作为校正的冷凝器和客观组合。内部荧光过滤器组件(例如作为激发和屏障过滤器,二色性反射镜),中性密度滤光片都包含在扫描单元(参见图3)。干扰和中性密度过滤器被安置在旋转炮塔或滑块,可以被插入到光路中,由操作员。激发激光束扫描单元被连接到一个光纤耦合器,然后由光束扩展器,使薄膜的激光束的手腕,以完全填充的目标后部孔(在共聚焦显微镜中的一项关键要求)。扩展的激光通过显微镜的物镜的光由耦合在整个试样平面栅格图案的检流计镜(点扫描)扫描形成一个强烈的衍射光斑。

扫描单元的最重要的组件之一是针孔的孔径,作为上面直接放置在光电倍增管前的共轭像平面的空间滤波器。通常包含几种不同直径的孔的旋转转塔上,使操作员调整针孔尺寸(和光学部分的厚度)。二次荧光由物镜收集退扫描相同的检流计反射镜形成的栅格图案,然后通过屏障过滤器才达到针孔孔径。光圈用于排除从聚焦位置的上方和下方的焦平面上,而是投射到艾里磁盘具有的直径要大得多,比形成图像的光圈值的功能的荧光信号。这些过大的磁盘,分布在一个比较大的区域中,使只有一小部分的光通过小孔原产于平面相差的焦点。针孔的孔径也可以消除通过光学系统的杂散光。耦合的孔径限定点的扫描针孔空间滤波器,可在共轭像平面是共焦显微镜的一个基本特征。

对比广角和共聚焦显微镜的相似性和差异时,往往是有用的,比较字符和几何技术用于照明的标本。传统的宽视场落射荧光显微镜的物镜聚焦在宽的光锥在一个大的试样的体积,这是均匀地,同时点亮(图4(a)中示出)。大部分的荧光发射定向背对着显微镜物镜(根据数值孔径)收集并投射到目镜或探测器。其结果是一个显着的量的信号,由于背景光发射的和自体荧光源自区域的上方和下方的焦平面上,从而严重降低的分辨率和图像的对比度。

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的激光共聚焦显微镜的照明源是第一物镜后孔径扩大到充满,然后聚焦透镜系统的一个非常小的点的焦平面上(图4(b)条)。照明点的大小范围从约0.25到0.8微米的直径(取决于物镜的数值孔径)为0.5〜1.5微米,深亮强度。共聚焦光斑大小是由显微镜设计,波长入射激光的,客观的特点,扫描单元设置,试样。图4展示的是典型的照明锥体的宽视场(图图4(a))和点扫描共聚焦显微镜(图4(b))在同一数值孔径之间的比较。的宽视场显微镜试样的整个深度在很宽的区域被照亮,而样品被扫描以精确聚焦在焦平面的共聚焦显微镜中的点为中心的照明。

在激光共聚焦显微镜,延长标本的形象产生聚焦光束扫描整个定义的区域在光栅图案由两个高速振荡镜振镜电机驱动控制。的一个反射镜的移动,由左到右的光束沿x横轴,而其他转换的y方向的光束沿着x轴的每一个扫描后,该光束被迅速运回的开始点,并沿y轴的上移,以开始一个新的扫描中的处理被称为反激式在回扫期间的操作中,图像信息被未收集。以这种方式,在一个单一的焦平面在试样上的区域感兴趣的激发的激光照射来自扫描单元。

由于每个扫描线通过沿试样的横向的焦平面,荧光发射由物镜收集,并通过共聚焦光学系统传递回。扫描反射镜的速度相对于光的速度是很慢的,所以如下的二次发射的光路是相同的原来的激发光束沿着光轴。返回的荧光发射通过检流计式反射镜系统被称为为descanning在离开扫描镜,荧光发射通过直接通过二色镜,聚焦在探测器针孔孔径。在试样激发光通过光栅扫描模式不同,荧光发射针孔孔径保持在一个稳定的位置,但强度随时间波动的照明点横越激发试样产生变化。

通过针孔孔径的荧光发射,被转换成模拟电信号,由光电倍增管具有连续变化的电压(对应于强度)。的模拟信号是周期性采样,并转换成像素由模拟到数字(A / D)转换器安置在扫描单元或随附的电子柜。的图象信息被暂时存储在计算机的图像帧缓冲区卡,并在监视器上显示。重要的是要注意,一个试样的共聚焦图像重建,逐点,从由光电倍增管和相应的电子发射光子信号,但从来没有作为一个真正的图像,可以观察到通过显微镜目镜存在。

激光扫描共聚焦显微镜配置

基本显微镜的光学系统的特点,从根本上保持不变,几十年来,由于工程目标设计,大多数样品的静态属性,而事实上,该决议是由光的波长的限制。然而,荧光探针,添加生物标本,并与光学显微技术和其它技术的对比,有显着改善。共焦方法的爆炸性增长和发展的直接结果是光学显微镜的复兴已经在很大程度上得益于现代光学和电子技术的进步。其中有稳定的多波长激光系统,提供更好的覆盖范围的紫外线,可见光和近红外光谱区的,改进的干涉滤光器(包括二色性反射镜,障碍物,和激发滤光片),敏感的低噪声宽频带探测器,并更强大的计算机。后者是成本相对较低的存储器阵列,图像分析软件包,高分辨率的视频显示,和高品质的数字图像打​​印机。的信息流通过一个现代的共聚焦显微镜的示意于图5。

虽然许多这些技术已经独立开发为各种专门针对性的应用程序,他们已经逐渐被纳入主流的商用激光共聚焦显微镜系统。在当前的显微镜系统,设计的分类的基础上利用该技术来扫描试样。都可以完成翻译阶段中的XYZ方向的扫描,而激光照射点的被保持在一个固定的位置,或者本身可以被光栅扫描整个试样的光束。由于三维翻译的阶段是既麻烦又容易振动,最现代化的仪器采用某种类型的光束扫描机制。

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在现代的共聚焦显微镜,两种根本不同的光束扫描技术已被开发。 单束扫描,在大多数的商业激光扫描显微镜比较流行的方法之一,使用计算机控制的一对检流计镜扫描试样在大约每秒一帧的速率的栅格图案。使用声光器件或摆动镜,可以实现更快的扫描速率(视频速度附近)。与此相反,多光束扫描共聚焦显微镜配有一个旋转的尼普科夫盘含有的针孔阵列和微透镜。这些工具通常使用电弧放电照明灯,而不是,激光器减少试件破坏和实时图像采集过程中,提高了检测的荧光水平低。的多束显微镜的另一个重要特性是它们能够容易地捕捉图像,用阵列检测器,如电荷耦合器件(CCD)摄像系统。

所有激光扫描共聚焦显微镜的设计是围绕着传统的直立或倒置研究级光学显微镜。然而,而不是标准的卤钨灯或汞弧放电灯,作为光源,以激发荧光团在试样中使用的一个或多个激光系统。图像信息的收集逐点与一个专门的检测器,例如一个光电倍增管或雪崩光电二极管,然后由主计算机,也控制扫描反射镜和/或其他装置,以便收集和显示图像的数字化处理。经过一系列的图像(通常是串行光学部分)已经采集并存储在数字媒体上,分析可以利用许多图像处理软件的主机或辅助计算机上可用的软件包。

共聚焦显微镜的优点和缺点

激光扫描共聚焦显微镜的主要优点是能够通过荧光样品的厚度范围为50微米或以上的连续生产薄的(0.5〜1.5微米)的光学部分。收集图像系列协调显微镜微调对焦机制(使用步进电机)的增量变化与连续图像采集的每一步。图象信息被限制为一个明确定义的平面上,而不是从远程位置在试样所产生的信号被复杂。以上的宽视场的技术,由于背景荧光的和改进的信号与噪声的减少,显着提高对比度和清晰度。此外,光学切片消除了物理切片和传统形式的显微组织标本的荧光染色过程中发生的文物。非侵入性的共聚焦光学切片技术使具有增强清晰度的条件下的各种活的和固定的标本的检查。

奥林巴斯显微镜

共聚焦显微镜的软件产品的,光学部分是没有限制的垂直横向平面x- y,但也可以在横向平面收集和显示。x - zy - z平面的垂直部分(显微镜光轴平行)可以很容易地产生的大多数共聚焦软件程序。因此,试样出现,就好像它一直切片在一个平面上的垂直于横轴。在实践中,垂直部分相结合,沿z 轴方向与该软件采取了一系列的xy扫描,然后突出的荧光强度,因为它会出现显微镜硬件应该能够实际执行的垂直剖面图。

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在图6示出一个典型的堆栈通过向日葵花粉粒露出内部的自发荧光发射波长中的变化的光学部分(通常称为z轴系列)。垂直于z轴(显微镜光轴)使用双氩离子(488纳米;绿色荧光)和绿色的氦/氖(543纳米的红色荧光)激光系统的光学部分都集中在0.5微米的步骤。花粉粒从这个物种范围20至40微米,直径广角荧光显微镜(参见图1(c))产生的图像模糊,缺乏对内部结构的细节信息。虽然只有12通过这一系列的超过48采集图像的列中所示,它们代表个别相隔的距离为大约3微米的焦平面的内部晶粒结构,并提供一个很好的指示。

在标本比花粉粒更复杂的,复杂的相互连接的结构元件可以是难以辨别,从顺次获取通过用激光扫描共聚焦显微镜的试样的体积大型系列光学部分。然而,一旦已经收集到足够一系列的光学部分,它可以被进一步加工成的试样,使用体绘制计算技术的三维表示。这种方法是在共同使用,以有助于阐明许多生物调查中的细胞和组织的结构和功能之间的相互关系。光学部分,以确保有足够的数据被收集,以产生一个有代表性的卷映像,应记录在适当的轴向(z步骤)间隔,以便反映在图像中的试样的实际深度。

伴随商业聚焦工具的软件包能够产生复合和多维视图的光学部分采集的数据从Z系列形象栈。可以采用三维软件包,创建一个三维代表性的标本(图7)或视频(动画)序列编制的标本量的不同意见。这些序列经常模仿旋转或类似的空间变换,增强了试样的立体字升值的效果。此外,许多软件包使调查进行测量的长度,体积和深度,特定的参数的图像,如不透明度,可以交互的改变,还以显示内部结构,在不同层面内的试样。

通过串行光学切片标本典型的三维表示的是图7中给出。花粉粒在图1和图6中所示的光学部分,合并产生的真实视图的外表面(图7(a)条),因为它可能会出现,如果通过扫描型电子显微镜检查。利用构造的三维模型的算法,使用户能够检查通过360度旋转花粉。的组织培养细胞中,在图7(b)中是来自于转染的中国仓鼠卵巢(CHO)线,并与嵌合质粒载体含有绿色荧光蛋白和人类免疫缺陷病毒(HIV)在细胞核中表达的蛋白质,是(因此,贴标核区)。厚的组织切片也很容易被以三维光学部分构造。几种荧光团标记的小鼠小肠部分,图7(c)中示出,在从一摞45的光学部分。

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在许多情况下,产生一系列的光学部分的复合材料投影视图提供了一个三维的试样比一个多维视图有关的重要信息。例如,荧光标记的神经元具有在组织切片中的许多薄的,扩展的过程是困难的(如果不是不可能的话)使用宽视场中的技术,由于聚焦模糊的图像。共聚焦超薄切片,每个相同的神经元揭示了几个扩展部分,但这些通常出现零散的条纹和圆点和缺乏连续性。创建压扁了一系列的光学部分神经元的综合意见,就会发现所有的扩展过程中大家关注的焦点,具有明确的连续性。结构和功能的分析的其他细胞和组织切片也有利于从复合材料的观点,而不是,或再加上,三维体绘制技术。

在共聚焦显微镜中的进展成为可能的活细胞和组织,包括图象信息作为时间的函数的多种颜色(使用两个或更多个荧光团)中的xyz尺寸的多维视图个人形象栈批量加工后,得出的数据可以显示实时三维彩色视频序列。需要注意的是,不同于传统的广角镜,利用共聚焦显微镜,荧光染料在乘法标记的标本出现在寄存器。无论是从时间推移进行的实验在较长期间内,或通过在短的时间内更小的帧的实时图像采集时态数据可以被收集。使用多维共聚焦显微镜在细胞生物学中的一个强大的工具的潜力继续成长为新的激光系统的开发,以限制细胞损伤和计算机处理速度和存储容量的提高。

扫描共聚焦显微镜的其他优点包括:能够调整倍率的电子通过改变由激光扫描的区域,而无需改变目标。此功能被称为缩放因子,通常是通过改变激光扫描采样周期来调整图像的空间分辨率。增加的变焦倍率降低试样的扫描区域,同时降低扫描速率。其结果是可比的长度,从而增加图像的空间分辨率和主机上的电脑显示器显示倍率沿增加的样本数。共焦变焦显微镜的光学分辨率低数值孔径和放大倍率目标时,被用来收集数据,通常采用数字图像分辨率相匹配。

所收集的共聚焦显微镜的光电倍增管(或类似的检测器)的模拟图像数据的顺序数字化有利于计算机图象处理算法的转化成离散的数字增量,对应于光强变化的连续电压流。另外的好处和处理数字数据产生的速度,图像可以很容易地准备打印输出或出版的。在精心控制的实验中,也可以通过以下方式获得的定量测量空间的荧光强度(静态或作为时间的函数的)的数字数据。

共聚焦显微镜的缺点主要是有限的可与普通激光器(以下简称为激光线),这发生在很窄的频带,并且是昂贵的生产,在紫外区域的激发波长的数量有限与此相反,传统的宽视场显微镜使用基于汞或氙弧放电灯提供全范围的激发波长在紫外,可见和近红外光谱区的。另一个缺点是有害的高强度激光照射到活细胞和组织(最近已经解决一个问题,通过多盘共聚焦成像尼普科夫)性质。最后,成本高,采购和经营的多用户共聚焦显微镜系统,其范围可以高达幅度高于可比的宽视场显微镜的顺序,往往限制了他们实现在较小的实验室。这个问题可以容易地克服由成本分摊显微镜系统服务的一个或多个部门的核心设施。最近推出的个人共聚焦系统竞争力的驱动低端共聚焦显微镜的价格,并增加了一些个人用户。