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尼康显微镜:活细胞成像的光学系统和探测器的要求

2013-10-16  发布者:admin 

在活细胞的调查设计的光学显微系统时,主要考虑因素是检测器的灵敏度(信号 - 噪声),所需要的图像采集速度,和标本的可行性。相对较高的光强度和较长的曝光时间,通常采用在记录图像固定的细胞和组织(如漂白为主要考虑因素),必须严格避免工作时,与活细胞。在几乎所有的情况下,活细胞显微镜代表实现最佳的图像质量,并保持健康的细胞之间的一种折衷。不必要的采样时间点,使细胞过度的照明水平,而不是实验设置的时空分辨率应限于调查的物镜相匹配。

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原则上,理想的活细胞图像采集系统是不够敏感,从弱荧光标本,同时记录所有动态过程足够快取得优异的图像。此外,该系统将有足够的分辨率,捕捉最细微的标本细节和宽动态范围,能够准确测量非常微小差别强度。不幸的是,这些条件中的任何一个优化仅在牺牲其他实现。因此,目前不可能设计一个通用的活细胞成像系统,这将是非常可能的调查范围为整个。相反,研究者必须妥协,确定最重要的参数进行优化,同时仍试图限制那些被认为不太感兴趣的变量所作的牺牲。显微镜配置中底,最终决定于所涉及的摄像模式(次),在实验过程中,标签协议的难易程度,和可用的设备保持试样活力​​的必需品的要求。

图1中显示的是现代倒究级组织培养显微镜配备4的摄像头的端口,每个端口耦合到一个不同的为特定的成像模式下的摄像头设计。在大多数情况下,这种设计直接为100%的光到一个端口(一个端口上进行一次),显微镜或分割光相机之间的港口和目镜80:20。对于在低光照水平的关键成像,研究者应当确保最敏感的摄像机连接到一个端口接收由样品发射的光100%。在图1中,全彩色CCD摄像机的港口底部(一)接收来自物镜的光不反射的反射镜或棱镜,并在这种情况下,采用图像乘以在明视场模式下的标记的荧光的样本(或染色标本) 。高性能电子数字乘以(EMCCD)相机(B)连接到右侧端口的使用,表现出非常低的水平的荧光图像标本。微分干涉对比成像深入厚的组织的红外光,具有传感器的相机((三);左侧端口))与在700纳米和1000纳米之间的高量子效率是必要的。最后,对于高分辨率的单色成像通过全内反射和其他荧光技术,珀耳帖冷却的相机((四),前端口)与相对较小的像素(6微米)是理想的。的配置,例如在图1中所示的是昂贵的,但可以是非常通用的核心成像设施。

使用了广泛的对比增强成像模式,在光学显微镜进行活细胞成像。调查的大多数涉及某种形式的荧光显微镜,通常耦合到一个或多个透射光技术。荧光技术包括传统的广角落射荧光,激光扫描共聚焦,旋转盘横扫场共聚焦,多光子,全内反射(TIRF),荧光相关光谱,寿命成像(FLIM),光敏,激光捕获。作为一个子集,专门的成像方法,如多色成像光谱成像,共存,时间推移序列,漂白恢复技术(FRAPFLIPFLAP),共振能量转移(FRET),斑点显微镜(FSM),膜片钳往往是耦合到一个或多个主要成像模式。可以补充传统的明视场模式下,包括微分干涉相差(DIC),霍夫曼调制对比度(HMC),相位相反的荧光技术,作为荧光探针本地化的确认。在几乎所有情况下,每个的显微镜配置需要一些独特的考虑,必须实现成功的活细胞成像。不管显微镜和数码相机系统成像的活细胞和组织中,两个最重要的限制因素是维持细胞生存力和实现可能的最高信号电平,背景噪声和自体荧光。

优化信号噪声活细胞成像

固定和活细胞成像的根本区别在于,前者的研究者提供了充足的纬度定义图像采集参数,如找到合适的视场,并确定曝光时间,以及调整电子增益设置,读出率,和偏移值。在大多数情况下,其结果是,它是可以(与充分染色固定的标本)收购利用的照相机系统的整个动态范围的图像,从而产生最佳的信号噪声比。不幸的是,情况是不同的活细胞成像参数上的限制所施加的严格要求保持细胞活力。常常活细胞与获得的图像中,试样的强度只有少数几个灰度级高于背景。在这种情况下,最重要的成像代价变成暗电流和读出噪声水平的检测器系统。经济的相机通常具有更高的噪音水平,从而导致不​​太均匀的背景图像,从检体的信号,越来越严重的读出速度增加的效果,即经常掩盖。在几乎所有活细胞成像应用中,探测器的选择是至关重要的,在确定一个实验的成功或失败。

检测器产生的噪声在数字成像中的四个主要来源,泊松拍摄噪声(由于随机性质的光子通量)和杂散光的照明系统在大多数情况下,系统地降低噪声,可以通过仔细选择的检测器和优化的照明条件。几乎每一种类型的光子探测器到每个测量记录与设备引入某种形式的噪声。在激光扫描和多光子显微镜使用的光电倍增管内产生杂散的电子信号放大系统。同样,电荷耦合器件(CCD等),利用宽视场,反褶积,全内反射,旋转盘,和扫掠字段显微镜表现出与每个像素相关联的背景暗电流在CCD和光电倍增管设计的改进,包括冷却装置,以非常低的温度,减少了暗电流的贡献,以非常低的水平。然而,特别是在读取每个像素的CCD的情况下,将模拟信号转换成数字相当于贡献了额外的噪声分量被称为读出噪声,在当前一代的冷却的数码相机系统的主要噪声伪 ​​影。

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图2所示是相互依存的活细胞成像的读出速度和图像质量的数码相机的灵敏度。标本是一种文化的单体Kusabira橙(MKO)荧光蛋白和人α -微管蛋白TRITC滤波器组合广角成像荧光照明和灰度摄像系统操作的读出速度的融合表达的宫颈癌细胞(HeLa细胞线)10或1.25百兆。当相机的CCD被关闭了(不接收光),背景噪声显着降低时,读出速度慢时,描绘在图2(a)和2(二)分别为10和1.25兆赫的速度,。这种差异不严重影响相机的性能时的曝光时间可以调整,以利用整个动态范围,就证明了类似的在图2(c)和图2(d)的图像质量。然而,在低光照条件下,读出速度较慢(图2(f))提供了优异的图像质量。图2(e)和2(六)中的图像被捕获在约低10倍的光强度比与图2(c)和图2(d)。降低照明度另一个5倍,产生的效果表现得更为明显,如示于图2(g)和第2(h),其中的读出速度较慢,提供了一个勉强可以接受的图像(图2(小时)),同时快速读出模式(图2(g))没有。

一个成功的数字成像实验需要在整个视场和连续图像之间的空间照明模式标本是恒定的。根据不同的照明源,通常横跨试样字段的光学性能是相当恒定的(称为空间不变性)在显微镜使用钨卤素灯。然而,在激光扫描显微镜中,传送到一个特定的像素的照射剂量可以为每个扫描变化。此外,汞等离子弧放电灯源一般采用在宽视场荧光显微镜不提供均匀强度的整个频谱,而是产生离散的特定波长的高强度的峰。氙气灯,与此相反,在可见光谱范围内表现出一个更为均匀分布的强度分布图,但缺乏在紫外区(通常避免在活细胞成像的照明范围)。

组合弧放电灯(例如,金属卤化物灯),具有的属性之间的中间汞和氙气的混合物,显示出除了提供连续光谱从紫外到红外的也许是最好的特性,这两个物种强大的汞线。无论光源,照明场可以呈现几乎均匀放置灯箱和显微镜的光学列车照明输入端口之间的光纤(或液体光导)。然后可以使用平场算法计算纠正任何剩余的照明梯度视。重要的是要注意,灯的输出功率的时间变化,它可以改变从平均10%,未校正光纤,需要一个稳定的电源的应用。

光子通量的测量本质上是一个统计过程中,与信号检测的不确定性因素。称为泊松散粒噪声(如上所述),净效应是,对于N个光子的测量的不确定性等于Ň,这也是的信号-噪声比的平方根最大化的信号的光子数(N)直接导致在信号与噪声和图像对比度的改进。提高信号的最简单的方法是收集更多的光子,通常采取长时间曝光或激发照明水平不断提高,但这些措施还可以增加光毒性和妥协细胞活力。甲第二,也许更有用的替代方案,以提高探测器的灵敏度。

为了克服低光照水平与活细胞成像,现代数字CCD相机可以配置称为分级(详见图3和图8)实施过程提供一个显着的敏感性增加在正常读出的量传输到读取寄存器中,然后将其按顺序分析的水平像素行中的像素的CCD。在离散化的图像,从图像传感器上的一组相邻的像素(例如,一个2×2或4×4块)相结合的信号(光电子),并分配到一个单一的像素值的读出数组中。这是通过转移到串行读寄存器(例如,两排为2×2像素合并4×4像素合并和四行)的多个平行的行的像素,然后读取组2,3,或多个像素一起。在2×2像素合并的情况下,有两倍的分辨率损失,信号增加了四倍,和2倍的改善信号对噪声。显然,改善信号限定的应用程序可以是显着的,虽然上面的空间分辨率的成本。

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图3示出了使用水平的不断提高分箱相结合的相邻像素的空间分辨率和拍摄的数字图像的最终尺寸的影响。的试样是培养赤麂鹿皮肤成纤维细胞表达的融合mCherry荧光蛋白(红色pseudocolored)和人的β -肌动蛋白,它定位于,包括的丝状细胞骨架网络的应力纤维。如与荧光蛋白标签,通常观察到的细胞,显示高定位精度往往是那些表达的融合产物,在很低的水平,显着降低了可用的信号。由于没有分级启用(图3(a)),信号过低时产生的曝光时间可以忽略不计的光毒性和光漂白区分。离散化2×2和4×4的逐渐增大的信号电平,但在成本,空间分辨率(图3(b)和图3(c))。最亮的图像是由离散化的8×8像素(图3(四)),但遭受急剧的分辨率的损失。很重要的一点要注意的是,图像的尺寸按比例下跌增加结合在分级过程中的像素数量。例如,在图3中未像素合并(1×1)的图像本来是1360×1024像素,而(2×2),(4×4)和(8×8)离散化的图像是680×512,340所述256,和170×128像素。为说明的目的在图中,这些图像已经被缩小尺寸。同样,一台数码相机,具有512×512的显示尺寸,以类似的方式离散化时,产生256×256,128×128和64×64像素的图像。

在分级的概念的一个关键点是,除了读出噪声分级过程后发生,因此,即使几个像素结合,只有一个读取事件每合并像素。与此相反,如果一个2×2像素框中,然后计算平均数据收集后,其结果将是不如分箱,因为由四个像素中的每一个的单独的读出噪声的贡献。因此,尽管分级牺牲空间分辨率,但一个显着增加,导致信号噪声比,一个特别有用的优势进行实验时,要求低光照水平和较短的曝光时间上的光敏细胞。在活细胞成像的关键参数通常是能够探测到微弱的荧光信号,而不是空间来解决这些问题,所以图像的力度和速度的增加收购所带来分级超过抵消分辨率的损失。作为一种替代分级,许多高性能相机使研究者通过阅读只有一个子数组或完整的CCD阵列,一个有用的机制,以保持空间分辨率的同时,减少了大量的利息选定区域,以减少图像采集时间时间细胞暴露于有害的照明。

为了克服传统的高性能CCD相机的应用需求快速帧速率捕捉在极低的光照水平的缺点,放大微弱信号以上的CCD读出噪声地板厂商都推出了一个创新的方法。通过将一个片上的乘法增益寄存器,电子倍增的设备(EMCCDs)实现典型的强化或电子轰击CCD的单光子的检测灵敏度,在低得多的成本,而不会影响传统的CCD结构的量子效率和分辨率特性。EMCCDs的显着特点是将产生倍增增益硅子结构(参见图4)内通过的过程中,碰撞电离在传感器芯片上的一个专门的扩展串行寄存器高于的光子产生的电荷的读出噪声,即使在高帧速率,并适用于任何当前CCD传感器的配置,包括背照式设备。

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甲EMCCD相机系统的显着优点是,它们是大大减少制造成本加剧的CCD相比,由于直接结合到CCD结构的信号的放大级。对于重要的活细胞与低强度的信号,如单分子成像中所遇到的,全内反射,旋转盘和扫掠字段共聚焦显微镜,钙离子或其它离子通量的测定,时间分辨三维显微镜调查EMCCD提供其他传感器专为低信号水平的显着优势。此外,与传统的荧光成像技术的较高的信号电平时,EMCCD系统的极端敏感性,允许较低的荧光基团的浓度和/或降低来自激励源的功率电平的应用,因此,可降低光毒性和光漂白的荧光探针。

显微镜的光学系统

针对活细胞成像应用的显微镜​​都必须配备一个高品质的框架构造坚固的复合材料或铝及应稳定牢固地安装在无振动平台。外部光的表面以及模块外壳(聚光镜,灯箱,物镜转盘等)应保持干净的状态和周围环境的显微镜应无粉尘和相对湿度较低。在持续所需的活细胞成像的例行程序,以确保使用科勒照明的原则对准显微镜的光学路径和隔膜。实验室房间壳体显微镜受益的能力,以减少所有开销照明,以减少的杂散光进入通过目镜的显微镜或样品室的水平。

电子数码相机系统通常安装到​​显微镜体通过一个或多个相机使用专门的适配器端口。研究级显微镜通常配备多个端口,使连接几台摄像机同时进行(见图1)。尼康显微镜,采用多种成像模式,使相机的优化配置,为每个对比度增强技术,可以快速访问,必要时,此功能特别有用。身体内的显微镜,反射镜,分束镜,棱镜级联策略性定位,以反映图像形成光波相机的各种端口和目镜。重要的是要注意,任何图像采集期间发送到目镜的光这样做上面的费用发送到照相机的光,因而降低了信号 - 噪声电平。因此,配备显微镜,口方向控制应调整到100%的光传送到相机端口用于收购光子荧光图像有限。

物镜的选择是至关重要的,从检体收集的最大信号,并将其传送到显微镜的光学列车。在光路中,如镜,分光镜,投影镜片,过滤器和棱镜的元素数量过多会严重的降低拍摄的图像信号噪音水平必须保持在绝对最低。在荧光成像中,具有非常高的数值孔径的物镜需要从检体收集的光的量最大化。数值孔径,它定义了多少光线可以从单点源收集的镜头,可以说是最重要的考虑因素,在选择物镜为活细胞成像。这个值是刻在物镜桶和范围从0.25低倍率(10倍)干油浸版本(通过100倍40倍)物镜为1.20和1.45。在数学方面,数值孔径表示为:

数值孔径(NA)=折光指数(η)×镜头接受角(Sin(θ))

因此,物镜的聚光能力的前透镜之间的介质,能够有助于最大限度衍射光线的角度的正弦值(θ乘以试样的折射率(η是由图像形成。此外,产生的图像的分辨率由物镜的数值孔径的函数。根据瑞利判据的(保守估计),分辨率是相等的照明的波长和物镜的数值孔径除以乘以一个常数(0.61)。此外,数值孔径定义的强度(亮度)的图像,这是与数值孔径的四次方成比例,但只成反比的放大倍率的第二功率。因此,小数值孔径的增加,可以产生显着改善的信号。出于这个原因,活细胞荧光成像,通常需要最高的数值孔径物镜耦合到高折射率的浸没介质(油或水)。

正如上面所讨论的信号的亮度的物镜放大倍率的平方成反比,从而使较低倍物镜往往是有益的,当昏暗的样品成像。例如,如果信号-to-noise比成为与100x物镜的数值孔径1.4,改变到一个类似的数值孔径,将提供一个显着的改善的亮度的60倍或40倍的物镜成像的标本中的限制因素。事实上,一个特定的荧光功能成像时出现几乎3倍的亮度与60倍与100倍的物镜(数值孔径为1.4)。所观察到的强度也是一个函数,对传输质量的变化的物镜,它始终是值得考虑的放大倍数和像素合并在一起,以评估一个特定的实验所需的最终放大倍数。

用于成像多重标记的固定细胞(和在某些情况下,活细胞),良好地校正色差的整个可见光谱范围(包括从400到700纳米;称为apochromats),具有平坦的成像平面(简称物镜平场或PLan)被认为是理想的。不幸的是,复消色差和复消色差计划的物镜,以及那些用来捕捉更广阔的视场,不可避免地含有多个光学元件(镜片)比不太精确的物镜(消色差透镜萤石)。矫正度数高,使这些物镜用于透射光技术,用最少的文物包括相衬和DIC。然而,结果是,光吞吐量牺牲最佳的光学矫正,因此有固定细胞成像效果不大,但在活细胞成像往往适得其反。此不足之处是最好的证明了一个事实,即平场复消色差高数值孔径为1.4,这在理论上应该比类似100x物镜亮约6倍,40倍的物镜是在实践中,只有约4倍,明亮。无论如何,40倍和60倍的物镜仍然提供最亮的图像,可以实现在光学分辨率的极限。

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图5中所示的数值孔径的原理的分辨率和图像的亮度方面的重要性的一个例子。样品是培养贴壁的非洲绿猴肾上皮细胞(CV-1行)的质粒载体转染编码增强型绿色荧光蛋白融合到线粒体靶向的核苷酸序列从人类细胞色素C氧化酶亚基VIII。的质粒转染的哺乳动物宿主的转录和翻译后的线粒体定位信号是负责细胞线粒体网络的荧光蛋白嵌合体在整个运输和分配。管状线粒体随后可以可视化使用荧光显微镜。

在图5中,使用具有相同的光学校正(方案萤石)和数值孔径(1.3)的物镜成像的相同的视场,但与从40倍到100倍的放大倍率。尽管像素的数目和检测器的条件下,利用在图5中收集的图像是相同的,线粒体是明亮的成像时,通过40倍物镜(图5(a),注意,图像已被调整到一个共同的大小)。相比之下,更高的放大倍率60X和100X的物镜(图5(b)和图5(c),分别为),100倍的图像几乎不产生逐渐变暗的图像。此物镜,仍然可以使用的图像试样,但检测器的增益,必须显着增加,导致恶化的信号 - 噪声比,并通常次于图像。请注意,物镜的分辨能力(图5(d)到第5(f))是可比较的,因为在相同的数值孔径值。

从图5中的数据,将收集到的基本概念之一,是为了避免过度放大时,选择物镜为活细胞成像荧光蛋白(和其他的荧光团,为此事)。简单地增加数字放大(变焦)在共聚焦显微镜图像采集,图像大小相当于100倍的镜头(图5(D)和5(e))的40倍或60倍的物镜结果。这两个物镜的分辨率是一样的,因为他们有相同的数值孔径值。不应被视为相对次要的放大倍率参数表明,使用60倍或100倍的物镜是不是有利。事实上,选择高倍率的物镜通常是必要的,当使用宽视场显微镜的成像非常小的物体,如过氧化物酶体或分泌颗粒,。由于图像的大小相对于检测器尺寸起着重要的作用,在确定空间的采样频率,确定的最佳放大倍率的数字照相机系统(CCD像素的大小和中间倍率)的参数。因此,物镜的最佳选择通常取决于仪器的光学结构的,除了一个特定的实验的具体要求。

在情况下,信号噪声比分辨率更重要,它往往是一个更好的选择,利用下校正(更少的光学元件)具有显着更高的光吞吐量物镜。时,应注意也可用于通过包含显着降低光透射的光学元件,如相衬物镜的振幅降低板的物镜的成像。这种光的减少的电平是很少的传输模式中的一个问题,但可以显着减少在荧光成像的信号电平(由15%至20%)。出于这个原因,阶段物镜不应该被用于活细胞成像,低丰度的探头,除非实验的协议需要相衬和荧光图像的叠加。同样,当组合使用荧光​​和DIC图像正在收集,偏振光仪(约30%)降低了信号通常是放置在共享的光路正下方物镜和获取荧光图像前应除去。

在光学显微镜的列车存在的任何缺陷会影响最终图像中的信号噪声比。在活细胞成像与高数值孔径物镜,球面像差是最常见的神器,必须加以克服。此像差产生从洗澡的细胞(通常的折射率为1.33的水溶液)和物镜液浸介质的折射率的介质之间的不匹配。球面像差通常表现为不均匀的传播使得显着伸长,扭曲的图像的一个点沿着光轴的焦点。因为该信号被分布在一个更大的体积中存在的像差,信号 - 噪声比降低。此问题是更严重的进深比它厚的组织与盖玻片(通常只有几微米厚)上的贴壁细胞,可以在很大程度上消除了使用的水是更紧密匹配的折射率的浸没透镜成像时培养基中。作为替代方案,浸没介质的折射率或盖玻片的厚度可以调整。重要的是要注意,折射率随温度的变化,因此,液浸介质的最佳组合和盖玻片的厚度会有所不同在室温至37度摄氏。较新的浸没物镜校正铤可以用来对抗由温度引起的折射率的波动。

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图6给出了显微镜的光学系统(图(a))和检测器(数码相机,图(b))进行活细胞的调查是显着的局限性。的检体是由一个单一的间期核粘附袋鼠大鼠肾上皮细胞(PTK2线)表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的稠合的组蛋白H2B序列(定位在细胞核中),在宽视场荧光成像与外延照明。的最高分辨率的图像的右上角的下面板(一)中的光学系统,并在较低的左上角的图(b)中的数字照相机系统。在活细胞的显微镜,光学系统确定可用于对比的产生,以及规定的物理分辨率的限制,这是由物镜的数值孔径和波长的照明的光的数量。随着照度增加(运行在面板(一)从顶部到底部),在光子计数噪声变得不那么明显和图像质量的显着提高。同样,作为增加光学分辨率(左到右面板(一)),的细胞核中的更小的细节变得更加显而易见。

数字摄像系统的捕获数据根据离散的光照水平和空间分辨率元素(图(b),图6)从显微镜和样品的光信息。由于像素尺寸的增大(左到右面板(B)),许多功能的小细节变得模糊和图像获取块状,外观几乎不(在面板的右下角的角落(b)条)。减少用来捕捉并显示图像(底部到顶部面板(B))的灰度级的数量减少遮光,只留下功能,具有非常高的对比度面板(B)(上排)。请注意,这两个因素共同提供信息。再次,在活细胞成像实验中,收集的信息的量应该是调查的要求成比例。

各种过滤器和镜子,专为活细胞成像显微镜直接和微调照明和发射光的波长的档案,因为它从光源通过显微镜(标本),然后探测器。与对比度增强的光学系统在传输模式下,改性光组件的任一偏振器,棱镜(DIC)或聚光镜的环形通道和相位环(相衬和Hoffman调制对比度)。成像时,在这些模式中,由于用于明场,DIC显微镜光学列车,相位相反的光的整体吞吐量远远高于荧光,很小的修改通常是必要的,以增加信号噪声。主要考虑的是过滤钨卤素灯照明,以消除光毒性的紫外线和红外线的波长才损坏试样。阻挡红外光,是必要的,以避免热损伤的细胞,并减少复杂红外敏感的摄像系统的信号 - 噪声与背景水平。紫外线光少的关注与透射光灯,但使用绿色或红色的干涉滤光器,可以很容易地控制试样的波长达到。无论是红外光与可见光过滤器将显着减少光的水平,并可能需要增加曝光和增益的设置,以保持信号与噪声的检测器系统。

在荧光成像,干涉滤光片和二色性反射镜相结合,以选择适当的波长频带的光用于激励从荧光团标记的样品收集排放。光水平相对较低时相比,传输模式,在荧光显微镜中,呈现为实现足够的信号的噪声电平的关键的选择的过滤器。在大多数情况下,特别是在信号的放气,通过关注的问题是,由于重叠的荧光团发射的档案,带通激发和发射(阻挡)过滤器的应用是必需的。通常情况下,这些过滤器中所固有的窄的光谱窗口进一步限制通过的光量通过显微镜观察,挑战研究者为获得满意的图像,来选择最佳的带宽。

显微镜制造商和售后的光学过滤器公司都可以从各种各样的具体的带通滤波器和二色镜组合。为了获得最佳的噪声信号,为活细胞成像的选择过滤器组合应密切配合在实验中使用的荧光光谱。例如,使用一个标准的荧光素(FITC)过滤器集的图像细胞表达黄色荧光蛋白(YFP)本身造成不必要的牺牲一些YFP的荧光,否则将改善的信号噪声(多色标签的应用设计参见图7(a))。在这种情况下,匹配的配置文件与相应的宽的带通激发YFP的吸收光谱和发射滤波器耦合到一个长通发射滤光片产生显着较高的信号。

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在两种流行的荧光蛋白的衍生物,在图7中,例如,的优化荧光的过滤器的组合,以获得尽可能高的信号电平的。顶部面板(图7(a)和图7(b))示出金星的吸收和发射光谱,位点定向诱变YFP的产品,叠加在FITC标记的过滤器设置(图图7(a)),以及一个专门的宽带组合旨在最大限度地采集到的信号,在一般情况下,从黄色荧光蛋白(图7(b))。虽然排放过滤器与问候到检测器发送的信号的电平相媲美,金星的吸收光谱和异硫氰酸荧光素的激发光滤光片带通区域是显着小于所观察到的与宽带YFP的集之间的重叠,从而导致低效的激励和减少信号。同样地,一个TRITC过滤器的组合(图图7(c))不激发mCherry荧光蛋白的效率,因为德州红组(图7(四))。此外,在得克萨斯红组合的发射过滤器的更宽的带宽传递到检测器上的多个信号。选定的过滤器组合方面,应仔细审查每一个活细胞成像实验中使用荧光激发和发射,以确保最高的效率。

除了标准的过滤器的组合设计单个荧光图像,多波段集现在随时提供给能够同时与两个或两个以上的荧光探针标记的试样的照明和探测。其他因素时,必须考虑微调显微镜的光学列车是中性密度滤光片,以减少激发照度水平(活细胞荧光成像的关键),以及紫外线和红外线过滤器,以抵消或消除试样的光毒性的战略定位。这些过滤器通常放在照明源之间的电弧放电(或激光),并在显微镜的输入光端口,并且可以很容易地互换,以优化的光通过。的强度和光通过显微镜的数值孔径也可以通过仔细调整聚光镜或落射照明孔径和视场光阑调节。

探测器的几何形状匹配光学分辨率

由检测器系统的光学图象有足够的采样,在显微镜拍摄的图像的空间分辨率通常被定义的光学系统的分辨率。因为CCD探测器构成的各个像素的几何形状可以从阵列中的光电二极管,每一个具有一个固定的大小,限制了最终图像的分辨率。为了实现充分显微镜的分辨能力,检测器的尺寸应符合每个艾里斑单元为2.5〜3像素的奈奎斯特采样准则。作为一个例子,对于250纳米的光学分辨率极限,在最终图像中的像素大小应是约80至100纳米。在活细胞成像,信号噪声比光学分辨率往往是更关键的,最有用的限制用于收集图像没有明显的降解是每2个像素艾里。的每个艾里单元的像素的数量减少,增加了图像的亮度,并允许使用更大的CCD的光电二极管,可以积累更多的光电子。

图8所示的(一)的图像投射到CCD像素阵列的表面活细胞成像中普遍使用的高数值孔径物镜的艾里磁盘。在阵列中的每个像素的大小是6微米。100x物镜的数值孔径为1.4,将图像投影到CCD表面的直径是20微米的(见表1),从而很容易实现的奈奎斯特采样大小(3.3像素每个艾里单元)。在本次抽检频率,足够的保证金,几乎满足2×2像素binning奈奎斯特准则。与此相反,60倍的物镜(1.4数值孔径)投影图像的直径是12微米,仅低于奈奎斯特限制的下边界。此外,即使具有减小的数值孔径为1.3,在40倍物镜产生一个8.4微米的图像,将需要一个放大镜照相机适配器,以符合奈奎斯特分辨率标准。光电二极管阵列具有更大或更小的像素尺寸相匹配的光学显微镜的分辨率,无需中间放大倍率或一个专门的CCD摄像头,包含合适的镜头系统,可以轻松地修改。

2×2像素binning示意图如图8(b)对于一个数组,包含16个像素。的光电子在曝光期间积累后,相机读出电路执行两个连续的每4个像素的平行移动。随后,两个串行移位寄存器的1个像素的地方收集的4个像素(2×2像素合并)到它们的电压读出放大器的输出节点的光电子。4×4像素合并(图中未示出),以类似的方式,在整个16个象素阵列的内容转移到输出节点,在读出之前,显着地增加了,同时减少了读出噪声信号。如前所述,像素binning是一个很好的方法来检索微弱信号时,检查荧光蛋白标记的活标本,在低表达必要的水平,以减少毒性文物。

imagingsystemsfigure8

在实践中,理想的具有1.4的数值孔径的一个物镜的在最终图像中的像素尺寸在100和120纳米之间。这个数字翻译成适当的物理尺寸CCD光电二极管,需要考虑物镜的放大倍率。例如,要实现充分的光学分辨率为60倍的物镜(1.4数值孔径)的检测器必须具有一个光电二极管6微米或更小的大小(所确定的放大倍率和分辨率的商品)。然而,对于一个100x物镜的数值孔径相同,最佳的光电二极管的面积增加至10微米。因此,显而易见的是,一个特定的CCD摄像机的数字分辨率只匹配显微镜的光学分辨率的相机时,适当地耦合到适当的物镜。交配的CCD摄像机具有10微米的光电二极管,以100倍的物镜,将导致在最后的像素大小为100纳米的图像。同样的相机,将产生167纳米的像素,使用时用60倍的物镜,这就限制了有些记录图像的分辨率。与此相反,用6微米的光电二极管的CCD将完全匹配,以60倍的物镜,但会产生过采样的图像的显微镜物镜转换器时,是旋转插入100x物镜。过采样以这种方式将大大降低图像亮度,而未能提高分辨率。

从前面的论述,似乎显微镜的光学系统匹配的检测器的像素分辨率的唯一理想的解决方案是为每个物镜使用不同的相机。很明显,在实践中,这种策略是不切实际的,必须找到一个折衷优化单个摄像机系统的效用。在某些情况下,通过安装的物镜时间倍率的显微镜和相机之间的耦合器的分辨率的问题,可以规避。例如,一个0.6倍耦合适配器会降低投影图像放大100倍的物镜,以匹配60倍的物镜。各种各样的耦合器是从售后市场分销商,以增加或减少CCD光电二极管阵列平面上的投影放大倍率。转乘半信半疑上述建议的数字CCD相机方面,重要的是要注意,虽然这些器件可以相对容易地从显微镜除去,优选由相机安装在显微镜上的端口,以防止灰尘及碎屑进入身体的显微镜,从附着在摄像机图像传感器窗口(静电促进的工件)。清洁传感器面板窗口是一个不寻常的艰巨的任务,特别是当物镜是每一个颗粒的灰尘,以彻底清除。

匹配光学显微镜分辨率的像素大小的要求
物镜
(数值孔径)
分辨率
极限
(千分尺)
预计
大小
(千分尺)
所需的像素
大小
(千分尺)
1X(0.04) 6.9 6.9 3.5
2×(0.06) 4.6 9.2 4.6
2X(0.10) 2.8 5.6 2.8
4倍(0.10) 2.8 11.2 5.6
4倍(0.12) 2.3 9.2 4.6
4倍(0.20) 1.4 5.6 2.8
10倍(0.25) 1.1 11.0 5.5
10倍(0.30) 0.92 9.2 4.6
10倍(0.45) 0.61 6.1 3.0
20X(0.40) 0.69 13.8 6.9
20X(0.50) 0.55 11.0 5.5
20倍(0.75) 0.37 7.4 3.7
40X(0.65) 0.42 16.8 8.4
40X(0.75) 0.37 14.8 7.4
40X(0.95) 0.29 11.6 5.8
40X(1.00) 0.28 11.2 5.6
40X(1.30) 0.21 8.4 4.2
60X(0.80) 0.34 20.4 10.2
60倍(0.85) 0.32 19.2 9.6
60X(0.95) 0.29 17.4 8.7
60X(1.40) 0.20 12.0 6
100×(0.90) 0.31 31.0 15.5
100×(1.25) 0.22 22.0 11.0
100X(1.30) 0.21 21.0 10.5
100X(1.40) 0.20 20.0 10.0
表1

许多目前的高性能数码相机系统设计荧光显微镜有光电二极管的尺寸范围从5到16微米和功能芯片分级。正如上面所讨论的,离散化的功能,使电荷从几个相邻的光电二极管组合成一个更大的单元,其有效地增加了的像素的大小。在6至8微米的光电二极管的尺寸范围的摄像机,显微镜光学分辨率通常可以使用60倍的物镜没有分箱匹配,而与100x物镜,可以提高图像的亮度,可以利用像素合并成一个2×2阵列的光电二极管。除了趁着匹配的光学系统使用更高的传输60X物镜的CCD分辨率,这种方法允许更明亮的图像,当使用100倍的物镜结合分级(2×2分级增加灵敏度四倍)。因此,记录的图像与100x物镜斌2约两倍明亮的(同等或更好的分辨率),60X没有分级的物镜记录的图像。额外的灵敏度的情况下,需要或必要时,可以60倍的物镜分级2×2四个因素来提高亮度,分辨率,通常是可以接受的大多数活细胞成像调查并发亏损。

在一些应用中,如那些需要一个大的细胞群同时监测,捕获视场的较大部分是更重要的空间分辨率。的矩形的CCD图像传感器在数码相机中,且没有中间倍率不捕获整个视场的可视化通过显微镜目镜,而是它被限制为30%和80%之间的范围内,这取决于芯片尺寸的。是必需的,如果一个较大的视场的时间倍率耦合适配器(如上所述),都可以使用。在许多情况下,一个0.6倍的中继透镜将投影图像的大小,其值接近在目镜看到的视图,但在一些成本的分辨率。或者,为了维持分辨率,多个图像的相邻的字段可以聚集在高放大倍率,使用x - Ý机动扫描阶段,随后缝合在一起成一个较大的图像,使用采集后处理软件。

在光学显微镜的最大的分辨能力,实现与近紫外光,有效的成像波长最短。近紫外光其次是蓝色,绿色,最后变为红色光的能力来解决标本细节。在大多数情况下,显微镜使用广谱白钨卤灯泡产生的光照亮标本,但在活细胞成像的照明往往是有限的频谱通过窄带干涉滤光片的应用。在可见光光谱的中心在约550纳米,绿色光的主波长(人眼最敏感的绿色光)。它是这样的波长,被用来计算分辨率值示于表1,所以这些值将不同的或高或低的波长的光时利用。的数值孔径值更高的数值孔径也很重要,也将产生更高的分辨率,可以观察到物镜表中类似的倍率。

结论

也许最关键的活细胞成像方面达到最佳平衡的放大倍率,同时在实验过程中的信号强度(低倍率的青睐),分辨率(放大倍率越高,所青睐),和细胞活力。研究者必须特别注意​​最终的光学放大倍率的像素大小的探测器,利用尽可能少的镜片尽可能匹配。市售光学耦合器具有多种中间放大系数,以匹配特定的物镜要求(放大倍率和数值孔径)为轻型限制和高分辨率应用。奈奎斯特分辨率标准时,应严格考虑选择的物镜放大倍率。应该对应于每个像素的不超过一半所要求的分辨率的限制,由于显微镜的衍射极限,这个距离​​不应小于50纳米对于大多数应用程序。

一个标准的干部普遍采用活细胞成像显微镜物镜为10倍和40倍(干),以及40X,60X和100X的油或水浸泡的版本。经济型干式低倍率镜头主要用于标本的初步扫描,以找到感兴趣的领域,并不需要高光学校正因素。然而,浸泡镜片应具有很高的数值孔径(1.3至1.45的石油和水1.2)和高透光效率。由于图像的视场的中心附近,高度改正,以生成平坦的字段通常提供没有可检测到的好处是明显更昂贵的和更少的光效率比订单中的校正物镜的物镜通常是聚集。针对荧光成像技术的所有物镜应该使用荧光珠的点扩散函数的质量检查。

冷却黑白CCD摄像机是涉及文化的活细胞成像应用的最佳选择,无论是否落射荧光或透射光对比度增强(DIC和相衬)是主要的收购模式。在选择相机时,考虑的重要参数包括量子效率,噪声水平(暗电流和读出),像素大小(以及相关的全阱容量),扫描频率。为了尽量减少水平的激发光,照射在试样上时,相机应尽可能敏感,这通常意味着量子效率高,噪音低,大的像素大小,扫描速度慢。灵敏度因此,必须对所要求的分辨率(青睐大量的更小的像素)和物镜成像率(较高的扫描频率的青睐)平衡。

慢扫描CCD相机一般都限于在他们的帧速率,此外,样本,除非有非常明亮的荧光,信号噪声比差时,曝光时间短。这限制了使用这些相机系统用于高速成像应用(高达每秒30帧)和挫败试图聚焦样本。应努力避免漂白和光毒性,文物,可以破坏细胞活力和亮度,找到一个合适的标本,相机对焦时。在这方面,应选择相机快门的功能,帧转移或隔行扫描CCD传感器,这是能够提供一个连续的流,除了慢扫描数字信号的图像在视频速率的。极端的低光照条件下,荧光探针显示有限的丰度或量子产率较低,再加上捕捉高速运动的要求,可以加剧或电子倍增CCD相机系统需要使用。