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尼康显微镜:光谱成像和线性分解

2013-10-16  发布者:admin 

在过去的十年中,已经开发了广泛的高性能荧光在荧光显微镜调查采用了先进的技术,如激光点扫描共聚焦,旋转盘,多光子,总的内部反射。现在可用的先进探针基因编码的荧光蛋白,半导体量子点,膜透性的合成荧光基团组成的混合动力系统,物镜蛋白融合,和单机的人工合成,具有广泛的物理和光谱性质。这些试剂能够针对几乎任何在活的或固定细胞中的蛋白质或肽的许多也是很有用的生物动力学指标。当用作单一的标签,成像大多数荧光团很简单,可以很容易地实现与标准照明器和荧光过滤器集。然而,当使用两个或两个以上的荧光探针的组合时,调查员应该知道在检测通道中的潜在信号交叉的发生是由于荧光团之间的光谱重叠。

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高级研究显微镜能够在一次实验中使用单,双,三或四波段的双色镜以及相关的激励和的发射滤光片集,正在分析的探针的发射光谱剖面相匹配的多个荧光成像。不幸的是,许多合成的荧光基团和荧光蛋白的发射光谱的档案跨越范围从约50纳米到150纳米的波长带,从而扩散到发射信号从用于另一个检测通道的一个探针插入的潜力。情况就复杂了进一步的荧光探针的选择是有限的,或两个以上的荧光蛋白,同时在相同的试件进行调查对象。由于研究多个探针在起居室和固定细胞之间的相互作用所提供的信息的级别显着高于单独使用相同的标签的情况下,方法已发展解开发射信号的复杂的混合物,使光谱可以单独解决。在这方面领先的字段是一种技术被称为光谱成像耦合数学上线性分解所测得的光谱中,表示目前可作为市售各种各样的辅助硬件和软件组件的光学成像和分子光谱的协同联合广角和激光扫描共聚焦显微镜。

如图1所示是一个高性能的尼康A1共聚焦显微镜光谱检测装置,可以使在单次扫描多光谱高速采集的剖面图。的光谱检测器是连接到扫描单元通过的光纤,具有波长分辨率独立的共焦针孔的直径。首先通过一个专有的衍射效率增强系统(简称DEES)为两个正交的偏振光的波阵面(称为PS),使用一个偏振分束器分开进入的非偏振光的发光的荧光发射光进入探测器DEES系统的目的是为了增加光的衍射效率由光栅用于分离成不同波长的荧光发射。离开分束器后的p -波阵面旋转90度(到一个S -偏振波),使用棱镜系统和两个光束然后由三个可互换的光栅衍射。的衍射光栅,可以精确地控制,以确保高度的重现性,波长分辨率为2.5,6,和10纳米。使用10纳米的光栅,光谱在320纳米的范围内,可以在单次扫描方式获得。由光栅衍射光谱不同波长的重点由两个独立可调的圆柱形镜,聚焦点产生的每束(正常的s和旋转P波)重叠到一个32通道多阳极光电倍增完美。一个专门的屏蔽机制,可同时混合荧光激发了四个激光器。

在许多应用中,光谱成像,加上受益于基于软件的线性分解算法是那些需要破译个人光谱吸收染料和荧光基团在一个显着的光谱重叠程度发生的情况下,大量的各种型材的能力。调查涉及活细胞成像(在动物和植物),免疫,染色体核型分析,临床病理,流式细胞仪,体内成像和药物发现可以提高使用光谱成像方法。的光谱信息:使用这种技术经常可以区分测量的工件,例如自体荧光,折射率的波动,没有料到的荧光基团的相互作用,和环境的不均匀性,并获得所需的信号从探测目标的实验协议。除了 ​​从实用程序,在去除不需要的自发荧光,可以掩盖的细节在许多标本,光谱成像也是一个显着的优点,在分离的重叠发射光谱的荧光蛋白和其他的荧光基团,在动态的荧光共振能量转移(FRET)的实验中,这往往是复杂极其快速的图像采集的要求。

荧光串扰

这取决于分子结构和元素组成的微妙细节,任何特定的荧光基团的荧光发射光谱可以分布在很宽的波长范围内,30和200纳米之间的变化。为了说明这个概念,“通用的”吸收和所产生的一个假设的荧光基团的荧光发射光谱如图2所示。本图所示的光谱特征是共同所有荧光发射轮廓近似(但不完全)“镜像”的吸收轮廓。在更短的波长区域的光谱轮廓的发射光谱具有量子产率急剧增加的曲线接近最大值的(称为峰值发射波长)。光谱曲线的峰值,作为波长继续增加,斜率更为缓慢下降,直到达到一个最低值后,返回到基线。光谱轮廓的宽度测定荧光发射的带宽一般在最大的量子产率的50%,通常被称为的半峰全宽(FWHM,图2)。然而,在图2中从档案中可以观察到,在这个区域之外,在较长的波长(在某些情况下,超过100纳米)而产生的荧光发射量可以是显着的。

荧光激发和发射光谱

具有单个荧光在荧光显微镜中成像时,可以一个长通排放过滤器用于收集在一个宽的光谱范围内的最大排放量。在这种情况下,不必担心由另一荧光团所产生的排放重叠的信号的干扰(通常称为交叉渗色,或串扰)。然而,当成像的多个荧光标记,同时,发射的档案经常共享相同的光谱区域,特别是在较长的波长,需要限制排放波长的带通滤波器的中心附近的单个荧光基团的峰波长的限制,或优选消除,从其他的荧光团的发射的不必要的检测。即使在使用窄带滤光片,从一个荧光发射进入检测通道用于另一个流血。成像时,两个或两个以上的荧光蛋白质中,经常发射光谱,使用合成染料或量子点,具有窄的发射光谱公司(通常为30至60纳米)时,此问题不太严重,但变得更为严重跨越几百纳米。请注意,在整个可见光谱区域的宽度被限制为约300纳米(从约400到700纳米)。因此,同时成像的两个分离的荧光蛋白,每一个具有跨越150纳米的发射光谱公司,导致了一个显着部分在可见光光谱的检测信号。

荧光发射的电平信号,可以检测到确定的宽度的发射滤波器的通带和荧光团激发的效率的一个因素,是由耦合的荧光团的激发滤光器的通频带宽度的吸收光谱的档案。其结果是,即使是在荧光基团的情况下,在其发射的档案中有显着的重叠,它们可能不产生可检测的串扰,如果激发光滤光片的波长通带特性都经过精心挑选。此外,由于激励效率急剧下降的事实,在波长比周围的吸收峰(见图2),荧光基团具有的最长波长的吸收特性往往可以专门兴奋没有同时令人兴奋的荧光基团,在更短的波长的吸收。例如,当成像增强型青色(ECFP)和黄色荧光蛋白EYFP)(具有高度重叠的发射光谱;参见图3(b)),可以尽量减少串扰第一激励和检测EYFP,其次是成像的波长较短的ECFP使用激发和发射滤光片设计,以尽量减少激发EYFP。这种技术依赖于使用带通发射过滤器,通常可以检测只有大约50%或更少的可用由每个荧光团发射的光子的顺序成像。此外,这样的做法不会有效使用荧光基团(如ECFP和EGFP;参见图3(c)),有太多的光谱重叠或不寻常的斯托克斯转变时。

图3中所示的计算机模拟的活细胞表达两种荧光蛋白的几种组合的示范频谱交叉荧光成像。这些细胞是印度麂鹿皮肤成纤维细胞在细胞核中表达ECFP(频道1),无论EGFP,EYFP的或单体Kusabira的橙色荧光蛋白(MKO)β -肌动蛋白细胞骨架细丝融合(通道2)。光谱重叠的区域中为每个探头组合表示的滤波器窗口内的灰色区域中的频谱图。这些荧光蛋白组合展示出不同程度的发射光谱重叠。ECFP和人民圣战组织(图3(a))相结合的展示最少量的重叠和ECFP-标记的细胞核并没有显示通道2中的主要信号(通道)人民圣战组织。ECFP和EYFP的组合(图3(b)条)与此相反,具有相当多的重叠,在通道2中较为清晰和细胞核。最后,ECFP和EGFP的组合演示光谱重叠程度最高的(图图3(c)),在通道之间有显着的信号交叉。

荧光串扰或流血通过

尝试使用三个或更多的荧光蛋白,可在一次实验中,需要使用更加高度受限制的激发和发射滤波器策略。两个或两个以上的荧光基团的结果,在一些不良后果,包括速度的限制,由于连续成像的必要性,在大多数情况下,成像的灵敏度降低为较小的滤波器的通带的大小,和更复杂的标记策略是必要的,以减少光谱重叠的结果。收集图像顺序,需要更多的时间比同时成像和业绩的快速采集过程中试样的运动,可以妥协。此外,在活细胞中的荧光信号电平往往是低的,尤其是对于稀疏目标丰度表达内源性水平的标本。其结果是,使用有限的通带过滤器的检测可以是具有挑战性。的信号与噪声的的未混合数据集往往超过排放窄带带通滤波器获得,因为整个150纳米荧光探针的发射带宽可以样品,而不是只是一个狭窄的30纳米发射窗口。最后,荧光蛋白调色板仍然是相当有限的,并在宽的发射公司很难干净地分离排放或其他需要专门的过滤器集。因此,在活细胞成像高速数据采集往往是在一个实验成功的关键任务的因素,这些后果可以有严重影响的调查结果。

光谱显微镜

光谱成像显微镜和光谱学的学科合并成一个组合,使确定的强度和光谱图像中的每个像素的标本。在成像的最近的技术进步产生的高度复杂的数码相机和点源检测器(光电倍增管等),能够以高空间分辨率和动态范围的各种样品,从众多对比度增强技术,包括明场下创建信息丰富的图像,相位相反,和荧光显微镜。这些探测器的进步也扩展能力创造合适的图像依稀荧光标本,其先前失去了在本底噪声低信号电平。与此相反,光谱法是一种行之有效的字段,包括收集和分析的定量收集在规定的波长频带的光强度值,它可以包括任何部分的电磁辐射光谱。显微镜,光谱成像技术通常只限于从近紫外到近红外的波长范围。

原子和分子,可以检查与光谱仪的特性的能带结构。简单地说,光吸收的过程中,一个电子从基态激发到更高的能级,从它可以通过几个途径,包括衰变到基态与低能量的光(荧光)相关联的排放量放松。的能量水平是每个分子的内在性质,因此该分子提供一个精确的光谱的指纹。荧光,特定的分子(称为荧光染料或荧光团)连接到感兴趣的结构,用作光源成像。在荧光显微镜中要注意的一个重要概念是,往往直接荧光基团的浓度和荧光强度的量的,尤其是在低浓度之间的线性关系。这种情况使定量分析的荧光,在必要的信号的情况下,可以成功地分开,饱和度,光转换,光漂白效果,往往会干扰预期的线性。

不同于与荧光的情况下,在其他形式的光学显微镜,包括明场,增强对比度的传播模式(相衬;霍夫曼调制对比度,HMC ;微分干涉对比,DIC),反射光,散射,试样与外部宽带照明光源和检测器的测量相同的光后,与试样相互作用。为了分析光谱数据,由所述光源发射的频谱必须被考虑,所测量的信号通常是不成正比,除非它首先被转换为光密度单位的发色团或在试样的吸光物质的浓度根据比尔-朗伯定律。然而,大多数的细胞和组织染色吸收染料和成像的使用明场技术的光谱成像分析的总理候选人。

为了测量的光谱吸收染料,荧光基团,或完成试样与多个标签,传输或发射的光被分散成它的组成波长测定在各波长的强度或波长的带宽很窄。光谱分辨率为每次测量的带宽取决于作为采样通道decreses的带宽增加。各种不同的技术可以用于分散光,其中大部分已被应用的(至少在原型工具)显微镜场景。其中最重要的特征光谱测量时要考虑的是分辨率,波长范围和动态范围。光谱分辨率是由最接近的波长可以彼此区分的,高度精确的光谱成像测量的是一个关键参数。光谱范围内是指在一个特定的测量波长(实际上,带宽)的总数。最后,检测限和动态范围定义信号分别进行分辨的水平在一个特定的测量的尺寸和数量,所需的最低水平。所有这些值可以为每个荧光团或吸光物质的光谱轮廓的函数发生变化。

32通道光谱图像的Lambda堆栈收购

如图4中所示,是在连续跨越500至692纳米的波长范围内,以产生一个lambda堆栈(在下面详细讨论),其中包含32张图片6纳米的带宽获得的一组典型的光谱图像。样品是培养贴壁人宫颈癌细胞(HeLa细胞线)中,用吖啶橙染色的DNA和RNA,并用尼康A1光谱共聚焦显微镜系统的成像。图像(512×512像素),使用32个通道的多阳极光电倍增管以每秒24帧,使用488纳米的激光激发记录。如此高的采集速度,这是活细胞成像的重大利益,可以通过先进的信号处理技术,再加上快速的模拟 - 数字转换电路,随着倍增。

光谱成像注意事项

第一次出现在遥感领域的精密光谱成像技术由于要求分析卫星图像数据所产生的反映,折射和散射的太阳光,以及阴影,在同一场景中。频谱分析方法的目的是使从图像数据集的多个频率特性,为了区分各种景观和地形的观察对象。类似的技术用于其他应用,从研究材料的化学成分阐发恒星和星系的形成机制。因此,通过检查作为谱频率(波长)的函数的单个像素相关联的,相匹配的光谱信息的强度波动,新的细节可以露天模糊简单地分析单个图像时,利用混合频率的光捕获。

在一般情况下,卫星和天体的数据集是具有一个或二个探针标记的生物标本的图像所得到的复杂得多,因为光谱的类的数量通常是更大的。无论如何,卫星图像的光谱特征是相似的检查重叠的荧光蛋白在活细胞或固定的组织标本,标记的一些吸收染料(如曙红,苏木)的混合物时,所获得的复杂性。在过去的几年中,应用卫星成像的独特方法已成功迁移到广角和激光扫描共聚焦显微镜的一些应用,包括消除自发荧光文物生物标本的分析,检测弱和卷积福斯特共振能量转移(FRET)信号,在人类染色体核型分析,并为解开共定位的一个像素的像素的基础上的荧光基团。将所得的光谱信息可以用于精确定位的位置特定的荧光基团和染料具有高空间精度,也可能能够产生两个或多个探针之间的相互作用信息。

在常规情况下,实验协议许可,传统的共焦和广角成像技术可以成功应用于通过精心挑选的荧光探针和相关的过滤器集,以及通过实施适当的控制,以产生合理的分离,荧光扫描multitracking战略信号。不幸的是,增加使用多个荧光蛋白的颜色与他们的关联程度高的频谱重叠监测细胞内的相互作用,往往限制了实验参数的选择。此外,在使用单个荧光活细胞成像,自然的自体荧光可以显着干扰检测通道,其中最流行的绿色发光的荧光探针(如增强型绿色荧光蛋白)是可视化。该背景噪声问题也可能变得非常严重,通过使用固定剂或DNA转染试剂引入多余的荧光。在荧光探针光谱明显重叠或自发荧光过高的情况下,再加上收购后使用线性分解算法可以用来解开混合荧光信号,并明确解决的空间贡献每个荧光图像分析光谱成像。

光谱图像拉姆达堆栈

类似的概念获得厚的试样,使用高数值孔径物镜的激光扫描共聚焦或反卷积显微镜光学部分(或z栈的),拉姆达堆栈是一个三维的图像集合中包括的数据集使用相同的试样字段在不同的波长带,每一个横跨在有限的频谱范围从2到20纳米的区域获得。相比之下,典型的一切形式的光学显微镜的成像方案涉及收购(或时间推移实验组连续图像)的整个波长的探测器响应带一个单一的形象。因此,尽管传统的成像产生的图像中的每个像素的强度值 I 的x,y)),用分光光度计测量只提供了一个频谱 I (λ))。在lambda堆栈合并这些所提供的频谱在每个像素的值(I 的x,y,λ)),以创建作为收集在一个不同的波长(或窄频带的波长,其中每个图像获取的图像可以被认为),或作为不同的波长值在每个像素位置的集合。

光谱成像拉姆达堆栈解剖

为了更好地理解的lambda堆栈的概念(通常也被称为在文献中作为图像的多维数据集光谱立方体),单个像素的位置在横向的图像尺寸(具有坐标 x  Ý 我的),可以检验沿波长(Žλ)轴。在图5(a)的强度和/或颜色的像素作为荧光发射的信号强度和波长的函数的变化,分 ​​别如图时,从一端的lambda堆栈的其他监视。通过绘制的像素强度与波长的直线图形(参见图5(b)条),空间位于像素的特定荧光团的发射光谱的档案可以很容易地确定。应当指出的是,使用这种技术获得的发射光谱的准确度和分辨率是聚集在不同的波长带的,在每个波长带内的纳米(较短的带宽产生更高的分辨率)的频谱宽度的lambda堆栈的图像的数量的函数,根据调查样本的身体素质和光子探测器的灵敏度(量子效率)。

图6给出了一个真实世界的例子,激光扫描共聚焦显微镜用三个重叠光谱的荧光蛋白在活细胞上获得一个lambda栈。本实验中使用的荧光蛋白标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP从水母,最大发射波长在507纳米),增强型黄色荧光蛋白(EYFP从水母,最大发射波长在527纳米),和单体的版本:橙Kusabira(人民圣战组织最大发射波长在561纳米),一个高性能的探针,从天然存在的珊瑚蛋白开发。在这种情况下,个别的lambda堆栈的图像进行扫描,在10纳米波段的范围从480至640纳米(图图6(a)),生成一个共16光谱部分的荧光蛋白的混合物。

所述第一图像的lambda堆栈揭示了检体中的发射范围为480至490纳米的光谱特征,而所述第二图像包含从490至500纳米(参见图6(b))的排放数据。需要注意的是几乎所有的来自两个lambda在第一部分荧光发射的短波长尾巴的EGFP单独只有一个很小的EYFP在波长较长的部分(490至500纳米)的贡献。(500到510纳米和510纳米至520纳米),在接下来的两个lambda部分EYFP的贡献稳步提高,EGFP的排放物达到一个高原。在520和550纳米之间的三个拉姆达部分的开始,该EGFP信号的贡献减小,从EYFP发射大约530纳米处达到最大值。同样,人民圣战组织的排放贡献变得更加显着,在540和550纳米之间的频带。因此,在550至560纳米的频带,从荧光蛋白质的相对贡献是约10,25,和65%分别为EGFP,EYFP,人民圣战组织。

荧光蛋白的Lambda堆栈

EGFP和EYFP成为人民圣战者组织主导的排放物最终的波段(560〜640纳米)减少排放贡献。我们回顾一下,在极端的lambda堆栈(480至500纳米之间,在590至640纳米之间)波段的功能,最短和最长波长的发光蛋白,EGFP和人民圣战者组织,分别主要由排放贡献。这些波长带的中心的lambda堆栈(500到590纳米),代表了一定的贡献从所有三个荧光蛋白含有荧光。如下面将要讨论的,在整个波长频带的lambda堆栈的混合发射信号的分布可以线性未混合使用参考从每个探针的发射光谱公司明确分开的贡献的个体的荧光蛋白。

光谱成像技术

光谱成像光学显微镜的主要器乐代价包括能够准确地分离荧光发射或光源光试样吸收到它的组成波长色散元件或类似的技术。已经实施了许多不同的方法在广角和共聚焦显微镜使用几个探测器设计产生的lambda栈。已被证明是最有用的工具依赖于棱镜或衍射光栅的光谱检测器配备有分散,然后将其引导到一个或多个光电倍增管的荧光发射的激光扫描共聚焦显微镜。先进的激光共聚焦仪器包含棱镜或衍射光栅发射光束分散到其成分谱,然后传递到任何一个多阳极光电倍增管可以同时检测多达32个独立通道的光谱信息,或通过选择波长狭缝一个检测器,并反映了额外的狭缝较短和较长的波长。宽视场仪器利用干涉滤光器,声光可调谐滤波器(AOTFs),液晶可调谐滤波器(LCTFs),干涉,棱镜耦合到反射镜,棱镜或光栅,用于图像分析产生的lambda栈。

在众多的技术,已被用于生成lambda栈的,所谓的波长扫描方法代表可能是最简单的方法。在实践中,一系列的窄带通干涉滤光器(通常为5至20纳米的宽)用来收集每个过滤器的视场的图像的堆栈。或者,可以组合shortpass和长通滤波器,具有特别尖锐截止波长的带通滤波器来代替。在一些早期的光谱成像的共聚焦显微镜实现这种类型的配置,但已经被更先进的技术所取代。使用过滤器时,带通的大小确定 ​​的λ扫描包括在每个波长的数目,因此,光谱分辨率。后车轮转动到位(请参阅图7(a))的新的过滤器的发射过滤器被放置在一个过滤器轮之间的试样和检测器,以获得连续的图像相同的试样字段。一般情况下,基于过滤器的光谱成像技术是实用,仅有限数量的波段的情况下,必需的,因为试样,必须反复扫描的每一个过滤器,而这往往导致过度的光漂白。此外,收集的lambda栈过滤器是一个比较缓慢的过程(至少需要几分钟),不适合用于活细胞成像所需的时间尺度。

光谱成像光调节技术

用于获得波长扫描的λ栈的更方便的方法是使用可变滤波器(参见图7(b)),可被精细地调谐,提供更多数量的波长带,通常是更紧凑的过滤器的车轮。最广​​泛使用的可变滤波器的配置是基于可变频谱干扰滤波器和电可调谐的光滤波器。圆形可变滤波器包含的干涉滤光器,在空间上改变取决于入射光穿过过滤器的波长通带。在实践中,过滤器被放置在相同的位置作为一个过滤器轮,旋转来改变通带。无商业工具提供使用变量过滤器,可能是由于拉姆达的堆栈图像包含一分钟的叠加谱梯度表现滤波器设计的事实。但是,有几个光谱检测器提供的(参见图7(c)和图7(四))AOTF和LCTF设计的基于位置之间的可调谐滤光器的照明光源和试样(当使用宽带光源,例如电弧放电灯)或试样和检测器之间。不幸的是,样品和探测器之间放置一个AOTF或LCTF可以导致贫困,由于极化和散射文物的传输效率。

AOTF和LCTF滤波器的的主要优点是,它们是电光学元件,没有移动部件,滤光轮和狭缝的系统相比,能够快速的切换时间。液晶可调谐滤波器的操作由安装两个线性偏振器之间,在一极化液晶施加电压时,发射的窄带波长。在大多数实现中,几个阶段要实现高分辨率的光谱分离的条件,也减少了在滤波器的通带之内的总透光量。发送非偏振光(荧光发射)时,一个标准的LCTF具有约40%的光通过。如果第一次通过的非偏振光通过偏振分束器,用于反射和透射的光的正交偏振的LCTF,效率可以提高一倍。过滤后的光,然后可以使用两个单独的检测器检测到或重新组合成一个单一的检测器与另一偏振分束器,与图像放置侧的两侧或重叠(后者需要精确的注册)。利用两个偏振图像的偏振荧光各向异性的图像,可以是特别有用的,当进行FRET的荧光蛋白的测量使计算。

声光可调谐滤波器采用一个专门的结晶化合物,如二氧化碲的晶格变形响应声波。在每个声频,晶体变形,产生的衍射光栅,具有一个特定的期间,发送一个不同的波长(或窄频带的波长)。这两个滤波器的设计产生一个lambda堆栈通过捕获在不同的波长带的连续的图像的优点,并具有非常高的光谱分辨率。此外,操作员可以为每个单独的波长带中选择一个最佳的曝光时间。在下行路上,AOTF过滤器可以是有问题的,如上所述,使用时发射光学列车(样品和探测器之间)由于光线不好的吞吐量,以及图像模糊和移位文物。一些制造商已经产生的图像质量AOTF设备。也可以用来作为一种声光可调谐滤波器可以在共聚焦显微镜的声光分束器(AOBS),以取代通常的过滤器相结合的激光。AOBS使快得多波长切换比过滤器可以是特别有用的,当结合一个超连续白色光激光。

光谱成像时间扫描方法是基于获取的数据集,它表示的光谱和空间信息的叠加,但还需要一个收集到的数据导出的光谱图像的数学变换。在实践中,该技术不要求的过滤器或棱镜耦合的干涉计单元(图7(五))在荧光显微镜进行傅里叶变换成像光谱通常被实现在宽视场显微镜干涉的方法分割成两个独立的路径的光的入射光束和两个得到的光束之间的时间延迟引入的光程差。两束光在到达探测器(CCD或光电倍增管),能够干扰。通过测量强度的光程差为一个函数,创建干涉是特定的试样的光谱特性。而计算出来的原来的频谱施加傅里叶变换算法的干涉。成像光谱法的最显着的优点是,收集整个实验过程中,在各波长的强度的分辨率可调制只需通过调整采集参数。唯一的缺点是,即使在情况下,只有少数几个数据点都需要,必须收集检体的整个频谱。一般成像光谱仪上进行定制工具,由于缺乏商业仪器。

共聚焦显微镜光谱成像探测器配置

流式细胞仪技术迅速推进,也可以从光谱成像技术中获益。成像时,由于空间的限制流式细胞仪,光谱成像是通过选择一个更小的感兴趣区域(通常具有一个单一的单元的尺寸)和限制,以所收集的波长频带的数目进行的。因此,被分散的荧光发射的衍射光栅或定制的光学元件的表面上投影的时间延迟集成(TDI)CCD传感器的像素时钟同步的流量。类似的方法,利用电脑断层扫描,全息分散元素投射到面阵CCD光谱和空间信息。在一般情况下,CCD照相机的速度与一个单一的lambda栈需要几分钟或更长时间的收集光谱成像是一个主要的限制。然而,出现了更快的系统可以帮助克服这些缺陷。数码相机也需要重复扫描捕获一个lambda栈,这可能会导致增加漂白和光毒性。更为重要的是在活细胞成像标记的结构可以改变空间位置在一个lambda堆栈消耗几分钟收购速度的情况。

在激光扫描和多光子共聚焦显微镜成像光谱

检体的整个频谱的应用空间扫描的光谱成像技术,可以同时获取通过在一个单一使用点扫描或行扫描仪器。这种方法是特别有用的活细胞成像和探测厚的组织,那里的标本必须经常反复进行扫描,并因此接触到大量的潜在的破坏性激发照明。空间扫描的光谱成像方法需要使用(图8(a)和图8(c))的衍射光栅或棱镜(图8(b))的分散体的荧光发射,并已被广泛的使用在商用激光扫描显微镜和多光子。这些仪器通过棱镜或光栅的色散,然后通过收集使用可变宽度的狭缝或多通道光电倍增器的选定部分的频谱分离成它的组成波长的荧光发射。为了控制在共聚焦仪器配备有狭缝的波长选择带宽,光圈的大小是可调的。对于含有多通道光电倍增管的工具,衍射光栅的大小可以被改变(通过旋转一个新的光栅具有不同的行间距到光学列车)控制进入检测器中的每个信道的波长的数目。普通的到两个仪器设计的存在下,以确保在所捕获的频谱缺乏的物理间隙的多个检测通道。不管带宽的大小,只限于由光电倍增管或通道的数量的数量的图像,可以聚集在一个单一的lambda堆栈。

最通用的光谱成像的共聚焦显微镜的配置可以大大提高采集速度收集的lambda栈,利用多通道光电倍增管收集有限容量的波段荧光发射后,它已被分散使用衍射光栅(见图8( c)条)。此次收购战略已经成功实施尼康的C1si的A1共聚焦仪器,其中每一个都能够高速只有一个单一的扫描光谱采集。多通道光电倍增管(通常称为多阳极光电倍增管),这些工具包含一个线性阵列的单个10纳米检测通道建立成一个单一的单元,从而使多个发射带并行成像,从而严重限制了标本漂白和光毒性。尼康光谱检测单元具有与采样增量2.5,5(或6),10纳米,可以单独的光路进行调整的频谱带宽的lambda部分旋转到一些衍射光栅。分散的排放量,然后通过32个通道的多阳极光电倍增管的精确定义的通道每个通道生成一个单独的图像。荧光发射的总带宽是由衍射光栅采样增量决定:2.5纳米抽样产生一个80纳米的带宽,5纳米光栅产生160纳米的带宽,而6纳米光栅产生192纳米的带宽和10纳米光栅产生320纳米波段。在Nikon仪器,光谱成像检测器的使用激光屏蔽机制,消除了来自激励源的激光反射光的,和衍射光栅可以倾斜,以选择任何的子采样的带宽。

尼康A1迪斯和光电倍增管灵敏度校正

其中高性能成像光谱共焦显微镜的先进功能尼康独特的专有衍射效率增强系统(DEES),这是设计,消除两极分化文物,光栅波长减少损失,并捕捉荧光发射的最大金额。DEES系统操作通过非偏振的荧光发射通过产生两个分量的波阵面取向平行和垂直于入射平面的,分别称为PS偏振光的双分束器的光学元件最精通观察到s -偏振光的光衍射效率,所以偏振旋转器被定位在该途径的s -偏振光的光的p偏振光的光而产生,显着提高了工作效率的光栅系统。正如图9(a)中所示,偏振光的衍射效率是450至675纳米的波长范围内的90%以上。与此相反,S -偏振的光的效率是80%,在450纳米和几乎呈线性下降到约45%,在675纳米。因此,尼康DEES系统可以显着提高光的通过,因此,灵敏度,在光谱检测单元。频谱宽度的情况下,必须进行调整,可以进行额外的试样扫描相邻探测器通道可以组合(称为分级),双,三,或四重检测频带的宽度。

虽然基于狭缝的光谱成像的共焦工具能够在高分辨率成像的发射光谱,它们的速度相对较慢时相比,装有与多阳极光电倍增管的显微镜。即使是那些工具的功能镜像狭缝部分的带宽,以反映第二或第三倍增仍然遭受缺乏成像速度为活细胞成像所需的时间尺度。在许多情况下,超过200纳米的狭缝系统测量频谱可能需要几分钟或更长时间,从而阻碍了光谱成像的标本,在整个拍摄期间,经过时间的运动。光谱成像显微镜的性能,先进的功能,提高灵敏度校正在基于多阳极显微镜(参见图9(b))。这些工具使用的基础上可溯源的光源的发射线和亮度调整每个通道的波长精度校正。此外,光纤元件的端部和检测器的表面都涂有一种特有的防反射剂,以减少信号的损失,并实现高的光传输。最后,先进的双积分信号处理(DISP)技术已被添加到图像处理电路,以提高电效率,防止信号损失,同时数字化器处理的像素数据和复位。其结果,该信号被监测整个像素的驻留时间,从而显着改善的信号-噪声比。事实上,这些技术相结合使32通道光谱成像(512×512像素)每秒24帧的速度足够快,为各种各样的活细胞成像应用。

除了使用荧光发射光谱成像产生的lambda栈,这项技术也可以被扩展到利用下的荧光激发光谱特性调查。基于激励的lambda栈,可以通过改变使用单一探测器收集荧光激发波长陪同收购。由于这样的事实,排放聚集在一个单一的通道,通常是高的信号 - 噪声比,并提出了一种用于数据处理的优势。激励的lambda栈分析使用相同的线性分解算法设计用于发射的光谱数据(见下文)。在一般情况下,一个宽带激光光源能产生广泛的线与快速切换的需要,收集高分辨率的激发的lambda栈,但更简单的形式从不同的激光器可以实现使用多个单独的线。激发光谱成像的主要缺点是相对缓慢的成像速度,来自顺序波长扫描的要求。因此,该技术是成像时,更实用,而不是固定的细胞和组织为活细胞成像。在未来,超连续白光激光共聚焦显微镜,光谱成像使用激励栈应该成为更多的主流。

光谱成像是一种新兴的一个功能强大的分析工具,在多光子显微镜,激励源通常是一个连续可调的近红外激光脉冲。的潜在能力,有效地分离的荧光基团与多光子技术是借助于一个事实,即许多具有高度重叠的发射光谱公司的荧光基团具有不同的多光子激发的显着少的重叠光谱。在这种情况下,线性分解应该有分开的能力,荧光探针,否则将有太多的发射重叠待解决。荧光探针检查时,如具有非常相似的排放概况的Alexa Fluor 488,荧光,和SYTOX绿色,远远低于光谱重叠其​​激发型材比在他们的排放概况,这样的前景显得尤为重要。多光子技术也可能有用的分离选定的荧光团的发射从蓝色和绿色光谱区域的自体荧光。

多色共聚焦成像的多阳极光电倍增分级

实施可变带通检测和激光扫描共聚焦显微镜提供了更大的灵活性远远超过传统干涉滤光片微调的排放检测带宽一般成像光谱歧视的最新进展。在许多情况下,成功地分离的荧光发射阻碍了一个事实,即所选择的荧光基团的最佳滤波器的仪器没有配备。上面所讨论的每一个光谱成像配置提供了能够自由地配置,这使研究者设计定制的带通设置几乎任何荧光的检测波长范围。例如,使用的尼康C1si的或A1共聚焦仪,V型过滤软件选项能够分箱四个所选通道从一个或多个所需的发射波长范围(参见图10),以生成图像。这是可以做到,无论数据是否被最终目的地进行线性分解分析。因此,现代的共聚焦显微镜成像光谱提供了一个显着的优势,为消除荧光光谱重叠在常规成像场景,还提供能力,可以轻松地创建自定义发射带通配置他们开发新的荧光探针。

光谱图像处理

典型的lambda栈从广角或激光扫描共聚焦显微镜收购通常包含几十万甚至上百万个人光谱(取决于图像尺寸),集合中的每个像素之一。由此产生的数据集是非常大的,因此太复杂,直观地解释。一套全面的软件工具是必需的光谱图像数据的处理和显示,这方面的需求已经解决了一些算法已发表 ​​的文献。此外,所有市售共聚焦显微镜成像光谱伴随着先进的专有软件包专门使用仪器采集的数据进行数据分析和演示。光谱图像的分析,可以执行基于光谱特征或存在于数据集的图像特征(有时两个),但大多数数学方法涉及被统称为线性分解线性分解算法的lambda栈软件分析可以应用于荧光探针的任意组合,但图像堆栈组成的吸收染料或反射光的光谱特征,必须被转换成光密度值,然后再应用线性分解算法。

原来的光谱图像分析算法设计开发的主要目的是为了分配单独签名卫星图像中捕获的对象。最有用的图像分析这一类的数学方法被称为主成分分析(PCA),监督分类分析(SCA),多元曲线分辨(MCR),线性分解(LU)。这些算法是基于这样的假设,所测量的信号从每一个波长(或颜色)的线性正比于该波长的试样的百分比或浓度。这种假设通常是正确的,当吸收染料或荧光探针的浓度低,但结果明显偏离线性的浓度达到饱和水平。在这种情况下,修正项必须被应用。要明确注意的另一个重要的一点是,每个荧光团或吸收染料具有独特的光谱特征,可独立确定用于在分配适当的贡献从该探针或染料在lambda堆栈中的个别像素作为参考。收集准确的参考光谱是任务关键的一步,应仔细进行光谱图像分析开始之前。

在一个典型的基于荧光的光谱成像实验,通常有几种荧光团存在于试样中,每一个标签不同的结构。整个在此试样中的图像,发现单独或作为混合物根据其空间的分布范围内的物镜的细胞器或大分子的荧光团。线性分解分析的目的是从每个荧光基团的每一个像素的图像,以确定的相对贡献。在大多数情况下,该算法的正确使用,需要个别单独制备的对照样品,可用于所有的实验中所用的荧光团的发射光谱中的记录。对照样品的试验片(如安装介质和细胞类型)使用相同的技术制备的,并必须被记录,可使用相同的仪器设置(增益,滤波器,物镜,激光功率等),所分析的试样。保持严格控制编制样本和记录参考光谱的重要性不能被夸大。

线性分解的lambda栈的另一个重要标准是,所有的荧光基团分离的光谱必须是互相区分,它们也必须是线性无关的,使得没有其他的线性组合,可以生产从光谱。这个假设是不平凡的,由于线性标准有可能会受到未知的或无意的相互作用,如荧光团之间的合作,本地化,淬火,和环境波动的能量转移(FRET)的事实。考虑在这种情况下,一个工件,荧光共振能量转移的供体荧光团的荧光发射强度的降低伴随着它的频谱稍有变化,随着发光强度增加和潜在的受体荧光光谱蚀变可导致。然而,在任何情况下,荧光共振能量转移的影响通常是非常小的,但应考虑成像时,有可能接受FRET的荧光探针相互作用。作为一个一般的经验法则,线性分解软件执行时最好使用标本表现出了很高的正在审议的所有荧光信号信噪比。

相关线性分解计算的基本概念是相对简单的。光谱图像中的每个像素被归类为代表的混合物中的荧光基团信号(强度)的测量光谱(I(λ) 时,可以去卷积成的比例,重量或浓度(C)的每个单独的荧光基团的参考光谱(ŗ (λ) ),当值的总和。因此,每一个纯粹的荧光基团的参考光谱描述作为Ri(λ)其中i = 1,2,3 ..... n表示的荧光基团(Ci的索引对于一个特定的荧光基团的数目(n)的,这种关系可以表示为: 

 


I(λ) = C1•R1(λ) + C2•R2(λ) + C3•R3(λ) + ........ + Cn•Rn(λ)

或者更简单的:

I(λ) = ∑i Ci•Ri(λ)

在实践中,被确定为(I)的光谱图像中的每个像素的信号强度,并记录,可在采集过程中的已知的荧光基团的lambda栈和参考光谱的独立测量中只有一个单一的使用相同的样品的荧光基团标记的单独的控制标本制备技术和仪器设置。从试样中的各种荧光团的总光谱贡献可以被确定为一个简单的线性代数矩阵行使的每个点,在上述公式中所描述的测量光谱,通过计算各自的贡献。对于许多市售的线性分解的软件产品的,将溶液通过以下方式获得输入参考光谱和通过使用逆最小二乘法拟合的方法,最大限度地减少测量之间的平方差和计算的光谱。

添加剂性能的发射光谱

为了确保最好的机会获得成功的结果,应用线性分解算法时,几个实验条件必须得到​​满足。其中一个最重要的考虑是,以确保光谱检测信道的数目是至少等于标本中存在的荧光团的数目。如果以满足本说明书中,可能会导致多个解决方案来计算光谱分离的和独特的结果可能无法。线性分解的另一个关键要求是,所有标本中存在的荧光团必须在计算中考虑或结果可能会偏向占主导地位(最浓)荧光不太集中的物种的费用。具有讽刺意味的​​是,不会影响包括在计算不匹配任何在lambda栈荧光光谱线性分解结果(零贡献,将被分配到缺少的荧光)。最后,自体荧光和/或高背景水平也应该被定义光谱(如果可能的话),并用作为一个额外的荧光基团,以达到最佳的结果。可选地,也可以计算的误差项和输出作为一个错误的残差图像。

加入荧光基团光谱的线性在图11中示出了两种不同的混合物,但高度假设的荧光基团,具有发射最大值居住在橙黄色(荧光基团1)和橙红色(荧光团2)光谱区域重叠。在图11中的黑色曲线(a)至图11(c)表示的求和的两个荧光基团在不同浓度的光谱:图11(a)一个为1;图11(b)0.5〜1,以及图11(三)为1〜0.5。虽然在图11中的光谱给出代表只有3个荧光基团的组合的例子,可以很容易地进行预测的总和的频谱为每一种可能的组合,这两个荧光基团仅仅通过增加强度作为浓度的函数。需要注意的是峰的总和的光谱的变化的比例的成分的荧光基团,例如,最大为594毫微米,在图11(a)中在图11(b)中的598纳米,589纳米(三)在图11中。应该强调的是线性分解利用整个光谱曲线(次),不只是峰值位置。强大的算法,如那些用于光谱核型分析和共聚焦显微镜,还可以处理复杂的曲线分析和纠正分钟的光谱移动。

两个荧光基团,类似于在图11中的标记的检体分析的频谱内容时,最简单的方法是从任何特定的像素之和与所有可能的组合,居住在光谱的参考图书馆的总和的频谱相匹配。作为一个例子,如果测得的求和频谱的黑色曲线,在图11(a)是一个非常接近的比赛,它表示的像素包含从各荧光团50%的贡献,它们均匀混合,在检体(至少在该象素)。同样,如果在图11(b)的总和的频谱相匹配的黑色曲线,可以假定,该像素包含66%的荧光基团和33%的荧光基团1。因此,它可以被归纳,通过比较代表的总和的测量光谱与参考图像中的预测的光谱库软件应用的最佳拟合参数的矩阵的线性分解操作。一旦已经确定时,每个荧光的光谱贡献的lambda栈可以被分隔成单个图像的每个荧光基团,如在图12中示出。

图12(a)和12(b)是一对的光谱混合和未混合的图像,分别贴壁培养的数生长期印度麂鹿皮肤成纤维细胞,它们被固定在聚甲醛和标有:绿色SYTOX(细胞核)的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽(丝状肌动蛋白)的Alexa Fluor 514标记的山羊二次抗体针对兔小学PMP-70抗体,过氧化物酶体膜蛋白(过氧化物酶)。一个尼康C1si的共聚焦显微镜使用了2.5毫米衍射光栅耦合激发使用488纳米氩离子激光器(图12(a))470至550纳米的波长范围内使用收集排放。拉姆达堆叠的线性未混合和pseudocolored的,(细胞核,红色),(肌动蛋白,蓝色),过氧化物酶体(绿色),以产生最终的图像,如图12(b)中所示。在图12(c)和图12(d)所示的明场图像获取使用一个固定的人肝组织标本与曙红和苏木精染色。一个尼康80I显微镜配备一个量子色动力学(古奇和HOUSEGO的)恒指高光谱成像探测器和安道尔IXON EMCCD用来捕捉一个明场图像的混合试样(图12(c)条)。线性分解后,更清楚地辨别两种染料标记的检体的特定区域(图图12(d)),通过将假色。

荧光和明光谱成像的

虽然光谱成像和线性分解成为一个重要的工具,用于分析复杂的混合物频谱重叠的激光扫描共聚焦显微镜的荧光探针,这种技术也越来越多地被应用到病理组织和细胞吸收染料染色标本上进行的测量和成像使用传统明视场显微镜。为了吸收染料进行线性分解分析,可以使用类似的算法已被过滤后的数据以补偿因素,适用于吸收而不是发射光谱。在荧光测量相比,明场分析技术要求的吸收收集的数据对每一个像素的光谱的光源光透过样品的档案必须分开。透射光照明效果,必须测量作为一个额外的参考。合成染料的吸收光谱是线性依赖于浓度(比尔 - 朗伯定律所决定的)。在数学上,吸收染料的线性的不混溶的计算是使用荧光探针的那些相似,并可以由下​​面的公式表示: 


A(λ) = ∑i εi(λ) • Ci • Li

比尔-朗伯方程所决定的,染料物种的吸光度(  C 是浓度,以及L是试样的光程长,这通常是在微米染色的组织内的测量。执行计算之前,必须测定的光密度,为每个传输的测量值的吸收的植物种。应当指出的光密度转换的发送数据中的引入显着的噪声电平可能会导致信号电平低时,为特定的吸光物质,因而复杂的解混结果。在这种情况下,最好是进行频谱分析通过仅包括峰值附近的吸收区域。类似的线性分解荧光探针的情况下,为每个污垢在试样中的浓度可以在图像中的每个像素进行计算,如果合适的参考吸收光谱已被被独立地确定。

荧光模式进行比较明场吸 ​​收染料光谱成像,吸收染料标本通常不随时间而褪色,而检查荧光标本非常行为可导致漂白。吸收染料染色的标本通常具有小于2.0的光密度(OD)为单位的动态范围为0.05 ,0.05 OD是很难区分背景,对应于约1%的透光性,这是相对较暗的2.0光密度单位。吸收图像也聚光镜数值孔径光阑由于眩光分配错误,如果没有正确调整。此外,吸收染料成像还需要整个成像系统的透彻理解。例如,如果由一个标准的钨卤灯发出的近红外光(热)没有被阻塞(实际上,波长大于720纳米),可以检测由CCD摄像系统,并添加到作为噪声的强度计数。在理想的情况下,一个宽的带通滤波器以除去不需要的波长的光路应包括在紫外线和近红外线的阻断。进一步吸收染料成像范围内的一个事实,即最大曝光时间必须小于饱和所需的检测器。与此相反,荧光曝光时间通常是有限由检测器的热噪声。

光谱成像应用

光谱成像提供了必要的基础和工具,以调查在各种各样的应用,包括活细胞成像,核型分析,常规荧光成像,药物研发,检测分子间的相互作用,组织病理现象。分子正在调查收集部分或完​​整的光谱信息的能力使混合荧光​​和吸收染料的检测和鉴别,即使在探头的情况下,表现出类似的颜色和高度重叠的光谱剖面。这种强大的技术允许调查标记多种细胞和组织的物镜,保证通过出血和明显的合作定位不会干扰在图像分析。此外,加上线性分解光谱成像所提供的信息可用于区分合法信号和工件产生的固色剂,转染试剂,安装中折射率波动。光谱成像也成为消除自发荧光和监测动态分子间的相互作用所产生的共振能量转移的一种重要方法。

光谱核型分析,荧光原位杂交技术的基础上,光谱成像最流行 ​​的应用之一,已经看到了广泛的接受。在一个典型的实验中,使用多达五种不同的荧光团来标记每个的24人染色体,该技术也可以适用于来自其他物种的染色体。每个染色体被标记为不同的荧光基团的组合,如Cy5标记,FITC,若丹明,的Alexa Fluor染料,或者任何的ATTO染料的。组合标记结果在2 N - 1种可能的组合。因此,使用库存总量只有5个荧光团产生31个可能的染料组合,可以很容易地辨别与分析软件(参见图13(a))。在分析过程中,图像扫描波长,分割的空间分布,则每个像素的分类的基础上的五个荧光光谱和每个染色体的公知的荧光基团的组合的表的参考图书馆。分类分析的结果,一般在将显示在单独的颜色,每个颜色表示不同的染色体上(如图图13(b)中示出)。所获取的光谱数据的高特异性,使一个成功的分类在大多数染色体制剂,即使在使用复杂的组织切片。通过增加第六染料偶联物探针针对特定地区,或所有染色体短臂探针,获得额外的信息可以自动核型分析。在实践中,往往是结合光谱核型分析用DAPI绑扎。

中遇到的复杂的信号FRET显微镜由过量的所要求的荧光基团,以便进行共振能量转移光谱重叠所混淆。因此,在除了分开多色固定和活细胞中的荧光光谱的光谱成像的能力,该技术是唯一适合解开供体和受体荧光团的发射的贡献FRET成像。FRET分析由于其高图像捕获率,这往往是必要的,当调查毫秒级的时间尺度上进行操作的荧光蛋白的生物传感器,特别适合用于现代高性能共聚焦显微镜,配备多阳极探测器。32通道多阳极探测器,光谱成像的共聚焦显微镜,可以获取整个光谱响应来自FRET荧光团在单次扫描。不过,即使光谱成像是能够同时检测两个荧光团的发射信号的FRET,该技术是不能区分通过能量转移产生的受体发射信号来源于直接激发。因此,适当控制使用供体和受体蛋白分别表示有必要进行定量分析。在光谱成像是用来评估FRET荧光蛋白表达的生物传感器作为一个单一的多肽的情况下,控制是不那么重要。

染色体核型和自体荧光光谱成像去除

其中最关键的工件,导致在活细胞成像信号 - 噪声的减少是自体荧光,来自若干来源,包括自然荧光的生物分子(如NADH,核黄素,和弹性),DNA转染试剂,文化传媒,和外源性药物(药物和生化)的成像介质。成像时,细胞和组织已准备与多聚甲醛固色剂诱导的自体荧光也特别问题,神器可以干扰全身显像在特定的组织(大脑和皮肤)。此外,植物组织在整个可见光谱区域,趋于表现出高度的内在的自体荧光。光谱成像的最强大的应用程序之一是消除自发荧光标记标本弱发射荧光团或那些稀疏定位的。在大多数情况下,自发荧光可以作为一个单独的荧光基团具有不同的光谱轮廓(在对照样品中最容易地确定),可以从感兴趣的信号,未混合的处理,因此可以减少或完全消除从最终的图像(参见图13 (c)和13条(d))。重要的是要注意减少自发荧光的水平在更长的波长在活细胞成像,所以慎重选择发射的橙色和红色区域的荧光团可以帮助减少这种神器。

多吸收染料染色的标本进行病理检查,在光照下成像光谱成像和广角镜线性分解优秀的候选人。许多常见的合成吸收污渍和染料用于染色细胞涂片和组织切片具有复杂的光谱重叠,具有显着的水平。然而,在明场成像的信号通常是强,漂白是最小的或不存在的。光谱成像可以使用标有几种染料产生单独的图像,目前标本只有一个单一的染料染色时会出现与明标本。然后,可以进行后处理,以确定于特定结构的染料的共定位。光谱成像的明标本中遇到的最严重的文物发生,当成像染料,含有沉淀物,而不是吸收散射光或时细胞和组织overstained的。

光谱成像的实践意义

光谱成像技术和线性分解实验协议的情况下,优化利用仪器的功能和软件参数,确保不会无意中介绍危及文物的潜力,取得优异的成绩。总之,大多数光谱成像实验的成败往往取决于研究者的控制下的变量。最重要的方面是(关键任务),以获得准确的参考光谱控制荧光样品,忠实地代表真正的光谱。此外,必须采取非常谨慎,以确保控制和测试试样相同的条件下制备荧光浓度方面,文化传媒,固色剂,洗缓冲区,安装媒体,光学质量的玻璃载玻片和盖玻片。仪器参数也应该是相同的控制,并根据调​​查的样本。这些措施包括使用相同的物镜,浸油,激光电源,光电倍增管的设置,针孔的直径,二色镜,波长扫描范围,像素停留时间。在理想条件下,其中的荧光基团的空间分布的许可证,可以获取参考图像中的试验片的非重叠区域。

即使先进的线性分解算法能够解决光谱的荧光基团,具有一个显着的重叠程度,在大多数软件产品的能力区分具有几乎叠加的光谱的荧光基团的限制。这种现象是一种罕见的发生,通常仅见于密切相关的荧光蛋白质和合成色素衍生物。例如,氧杂蒽衍生物的Alexa Fluor 488和荧光素都具有类似取代基的主要区别在于,前者是磺化的,以增加溶解度。这两个荧光基团的谱峰是仅由一个单一的纳米分离的排放曲线几乎是完全重叠。因此,它是无法区分的Alexa Fluor 488和荧光光谱成像和线性分解。但是,请记住,这是一个不寻常的情况下,用于标记细胞和组织的最常见的荧光基团,可以很容易地使用这个强大的技术解决。

尽可能接近匹配的荧光浓度和/或控制和测试标本的荧光蛋白的表达水平,将有助于确保令人满意的结果光谱成像。在一般情况下,研究者应努力尽可能达到最高的信号噪声水平。由于光谱成像仪器的各个通道上的范围从约2到10纳米的带宽,仪器的灵敏度总是有限的能寄存器,每个波长带中的检测器的光子的数量。因此,可接受的光谱分辨率为5纳米或以下的荧光团分离时,才有可能使用明亮的荧光标记标本。不幸的是,在非常高的分辨率(5纳米以下),典型的生物标本往往表现出标有荧光基团,是非常暗淡或有稀疏定位时的噪声信号和图像质量不佳。因此,最佳的线性分解的结果,得到时,检测信道的宽度尽可能大。

在其他光谱成像实验关注的背景水平高,过多的探测器和光学系统的噪声,以及自发荧光。高背景发生不正确的有针对性的荧光团,overstaining,激光线的噪音,安装媒体的不均匀性,浸油不匹配,杂散光,以及自发荧光。在大多数情况下,背景水平相减技术,可减少使用后的频谱数据收集。检测器和光噪声成为问题的成像时,弱荧光探针,但通常可以通过检测信道的数量减少和更大带宽的扫描有效地消除。自体荧光是最好的处理,包括它作为一个单独的荧光通道线性分解过程中有一个独特的光谱剖面。总之,仔细注意仪器配置的详细信息,样品制备技术,以及选择最佳荧光光谱成像实验的成功结果的关键。