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徕卡显微镜:多波长在荧光显微镜落射照明

2013-10-16  发布者:admin 

 

荧光是一个过程,其中已吸收的光(光子)后的物质emitts的辐射的波长(颜色),其中长于吸收光,这个排放停止后立即停止激发。这种现象是荧光显微镜及其应用的基本元素。

除此之外,古典在光学显微镜下的荧光激发,有可能两个或多个光子具有较长wavengths比发射的激发激光共聚焦扫描显微镜通过现代技术来获得相同的发光效果。

 

荧光作为autofluorescenc的生物和/或无机结构或所谓的次级荧光的特殊染料(荧光染料,荧光标记物)的处理后的检体发生。要执行荧光显微镜,必须满足以下要求:强大的能量源(高压汞弧灯,卤灯等),选择的激发光发出的辐射完美的足够的透射滤光器的系统(filterblocks)的,,最后但并非最不重要的是,适用于荧光,即集电极镜头,照明,分光镜,物镜,管镜头和目镜光学零件和服装。

 

 

与今天的情况相比,在第一次施加透射光场和暗场显微镜的使用荧光显微镜。这是由于其有限的护林员在那些日子里的应用。但随着组织学,细胞学,分子生物学和免疫诊断其重要性日益增加的需求,从根本上改善照明和观测技术来越来越多。这是入射光荧光显微镜诞生的时刻。

在其近40年的应用和发展的过程中,这种技术成为常规和科研工作,在生物学,医学,科学和工业的基本工具之一。入射光荧光显微镜的进步,尤其是由研究工作Ploem的他的功能引领趋势也正向莱茨RESP战略决定。韦茨拉尔徕卡光学仪器发展需要。

这个发展过程中是按时间顺序描述在目前的贡献。à提要荧光显微镜技术使显微镜,物镜,荧光染料,光源和过滤系统有关的应用领域,并指这方法的相关信息。

 

荧光

荧光是一种分子的现象,其中一种物质的光吸收(激发)和辐射光的较长的波长(发射),在很短的一段时间内。当荧光染料吸收光能量的光子的形式,导致的电子激发到较高的能态。光子吸收的过程中,非常迅速,后面紧跟着一个返回较低的能量状态,然后,伴随着辐射产生的光子,如果在视觉范围内的光发射,可以观察到。

这短短的时间(纳秒),使其区别于其他形式的如磷光发光。在激发和发射峰的波长之间的差异被称为斯托克斯位移(Stokes shift)。具有较大的斯托克斯位移的荧光染料很容易激发和荧光显微镜观察其排放。透射光照明下,小斯托克斯位移可能使其无法照亮荧光激发峰和,观察荧光色在其发射峰。

 

共焦激光扫描荧光显微镜使比所发射的光的波长越长的光子与双光子激发。然后使电子激发态所需要的能量的一半的两个光子同时到达。在大多数情况下,结束了在同样兴奋的状态,与正常的单光子激发电子之前下降到基态。同样地,发射的荧光发出了由正常的单光子激发的是类似的。

 

荧光染料

许多分子,非有机和有机,显示荧光,尤其是使用高能辐射激发。当植物或动物组织的兴奋与UV光很多时候,观察到一个蓝色的荧光发射,这被称为初级荧光,或自体荧光。天然存在的物质通常有很宽的激发光谱和发射光谱。随着分子生物学的发展,研究已集中在特殊染料与明亮的荧光,以区别于可能自发荧光。用于选择性地染色重要的生物分子的染料被称为荧光染料。当共轭的抗体或核酸,它们被称为作为荧光标记物或探针。今天,荧光染料可与峰值发射在紫,蓝,绿,橙,红和近红外光谱区。用橙色和红色的光来激发荧光染料和检测的红光和红外光的荧光用光电倍增管或CCD相机的可能性已扩展的可视范围以外的荧光显微镜。荧光的激发和发射的可能转向细胞环境的变化。某些染料,尤其是选择,因为它们的激发或发射光谱移出后,在细胞内的介质(如钙,钠,pH值)中的一些离子的浓度变化。

 

落射荧光显微镜的早期发展

对于荧光显微镜的历史评论的读者被称为卡斯滕EPI照明(垂直入射激发光)已经PolicardPaillot。一些工具由徕兹(徕卡),博士伦博士伦,赖克特和蔡司,其中部分建议的基础上的Ellinger和希尔特,歌手:梅勒和匹克。一个早期的莱茨(徕卡)荧光落射照明系统由Haitinger描述。欲了解更多详细信息,落射荧光显微镜的演变,读者可以参考罗斯特和入射光荧光显微镜早期应用豪瑟

落射荧光显微镜中的一个主要贡献是事故照明引进双色镜UV光由布伦伯格和Krylova。具有一定的落射照明光的优点,因为不像透射照明,聚光镜和物镜物镜有独立的光轴必须完全一致。的物镜函数作为聚光镜作为聚光的物镜,避免了所有的对齐的问题。分离自激发光的荧光发射,使用分色beamspitter,容易得多与transmittted光荧光显微镜,这些可能性没有,但是,不会导致常规荧光显微镜落射照明工业显微镜制造商普遍接受。这种情况的主要原因可能已经透射光的暗视野紫外光的激发荧光显微镜在大多数应用中,给已经很优秀的结果。其更换紫外落射照明不会有显着的优势。使用暗场聚光镜的透射光的使用仍是行业标准,直到60年代后期。

分子生物学的兴趣迅速增长,但是,导致许多抗体(单抗)的发展的重要的大分子在细胞检测。要研究具体的几个大分子细胞器的形态位置,用不同颜色的荧光标记物被越来越多地使用。紫外光激发 传统荧光显微镜的使用 不是最适合同时检测多种荧光染料,在一个单元格。

1962 Ploem左右开始工作,与Schott合作的发展分色beamspitters的蓝色和绿色的光反射荧光显微镜落射照明。当时他的第一个通信[1965]和落射照明出版物窄带的蓝色和绿色的光,他是不知道的紫外光激发分色分光器的开发与入射光布伦伯格和Krylova。也不是徕兹公司,而他获得的的“Opak”落射照明用中性分光镜。此照明灯进行修改,以在入射光路包含四个分色分束器包含一个滑块,分别为紫外线,紫色,蓝色和绿色激发光。此装置,在阿姆斯特丹大学的发展,允许不同的分色分束器轻松地交换入射光路(图1a)。的激发光的波长,因此可以很容易地和迅速地改变。

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图 1a的:荧光多wavelenghts的落射照明器与四个二色光束分离器安装在一个滑块上,用紫外线入射照明,紫色,蓝色和绿色的激发光的。建在阿姆斯特丹大学(Ploem1965)。

 

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图 1b中:莱茨原型(没有商业化的)与4个二向色分束器安装在一个滑块(Ploem1967)的多波长的落射照明。

 

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图 1C:莱茨落射照明器与四个可交换滤光块(块)(卡夫,1972)。

 

不久与窄带蓝色和绿色的光激发它变得清晰,广泛应用于免疫荧光异硫氰酸酯(FITC)和异硫氰酸四甲(TRITC)标签检测开辟了最佳的可能性。使用的蓝色和绿色的激发也最小化的自体荧光的组织成分,与传统的透射照明用UV光遇到不期望的效果。FITC现在可以兴奋与窄带蓝色光(使用滤除带外干扰的半宽度为16nm),在490 nm处(长波长蓝色)的最大激发,清楚地观察到绿色荧光发射峰在520纳米。最小化组织成分的自体荧光(图2ab),在一个高的图像对比度。激发FITC接近其最大激发启用,即使是高压汞弧灯,有没有强烈的排放峰值在蓝色波长范围内,可以用这样一个高效的激励。此外,落射照明用的第一次启动,激发富尔根副蔷薇苯胺的强汞(图3ab)在546 nm处的发射谱线的绿色反射分色镜。

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图 2A:照亮宽波段紫外线激发与immunolabelFITC)标记的组织细胞。注意蓝色自发荧光的组织结构。

 

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图 2B:相同的组织和相同的免疫染色FITC标记落射照明使用窄带蓝色(490 nm)的光照亮。请注意,增加图像的对比度(Ploem1967)。

 

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图 3A:肝组织。细胞核染色进行DNA Feulgen反应pararosanilin的,可视化与传输绿灯。这污点被称为吸收污渍,不知道是荧光。在晶核上亮起,导致事件窄带绿光(546 nm)的红色荧光。

 

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图 3B:肝组织。核Feulgen反应副玫瑰苯胺染色的DNA。落射照明与窄带绿光(546纳米)和二色分光镜反射绿灯。大概显微镜用绿光激发(Ploem1965)的第一个例子。注意:大的图像对比度。

 

Bildschirmfoto在他的第二次出版的多波长落射照明器,描述一个的莱茨原型与四分色光束spittters(图1b),Ploem 承认布伦伯格和Krylova的贡献。俄罗斯在这一段时间的研究,没有任何主要的工业发展在俄罗斯或东德落射荧光显微镜的交通不便是莱茨没有意识到这样的发展早的原因。引进外延照明,紫外线,虽然有用的几个应用程序,没有被莱茨一个新的技术发展的动机,因为他们已经出色的传输暗场紫外光激发的可能性。增加世界广泛使用的常规荧光显微镜在医疗诊断和分子生物学研究,然而,利润落射照明使用窄带激发新的可能性,用蓝色和绿色的光。由于可以使用标准的高压汞弧灯,这似乎是一个实际的建议。

随后,徕兹分别紫外线,紫色,蓝色和绿色的光开发了一种新颖多波长荧光epiilluminator的四个旋转分色分光镜(徕兹PLOEMOPAK) 。莱茨照明(包含四个分色分光镜)屏障过滤器和旋转炮塔激发滤光片在连续几代增加了。最后一个优雅的落射照明,构建了卡夫含有多组的激发滤光器,二向色分束器和一个阻挡或发射滤波器的组合,一起安装在过滤器中的多维数据集,也称为过滤器块(图4)。由于此照明灯迅速变成光路允许过滤立方体,多波长照明同款组织成为一个实用的命题。此外,四个过滤器的照明器中的多维数据集可被交换由用户(图1c)。两套不同的四个滤光块进行组装,选择从许多滤光块,包含组合的激发,阻隔过滤和分色分束器,为不同的应用程序开发。经过建议Ploem,利时也产生了一个倒置的显微镜落射照明(图5ab)。多波长荧光显微镜的的莱茨PLOEMOPAK照明的审查,被称为读者评论普卢塔

 

左:图。4:完成莱茨(徕卡)过滤器的立方体(块)含有荧光显微镜:激发滤光片,分色分束器和发射滤波器(垒)。

 

 

 

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图 5A:徕卡倒置荧光显微镜,多波长落射照明。

 

 

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图 5B:寺崎®塑料托盘与人类淋巴细胞移植研究后荧光细胞毒性试验。倒置显微镜落射照明。

 

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图 5C:徕兹(徕卡)机动落射照明器与八个滤光块(块)。

 

徕兹(徕卡)滤波器立方体系统是如此的高效,现在,39年后,相似类型的过滤器立方体仍然使用多波长荧光显微镜最显微镜制造商。这种发展最终导致在徕卡的发展,自动化的多波长荧光落射照明器,可容纳8个滤光块不同的波长范围(图5c)。当过滤立方体,电脑显示器上的像素移位避免或保持在低于35 mm胶片由于0像素移位技术的分辨能力之间切换。此照明灯是现在使用的荧光原位杂交方法(FISH)染色体的研究。

Ploem  ,范德Ploeg Ploem和奈恩和Ploem [ 进一步探索过滤器的组合,许多医学领域的应用也得到了发展。这样做是与肖特和Leitz合作。Rygaard和奥尔森等人开发了一种新型的短波通高传输干扰滤波器具有非常高的传输和尖锐切断对波长大于490纳米的蓝色光。

Ploem 结合SP滤波器与1毫米GG 455过滤器,阻止紫外线激发,肖特和建议的绿色光激发和激发一个过滤器Balzers公司开发的类似的过滤器(SP 560 = KP 560)紫光(LP 425 = KP 425)。后者过滤器适用于神经递质调查。在图6ab中得到的蓝色荧光可以观察到。

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图 6a的蓝色荧光肾上腺素(加利福尼亚州)的神经丛和黄色荧光肥大细胞(5-HT)所包围的小血管的大鼠肠系膜。甲醛诱导的神经递质的CA5-HT的荧光基团的荧光。

 

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图 6B:相同的组织和染色图。6AEPI-窄带紫色激发光照明(LP 3毫米GG 400SPKP425干扰过滤器),分色分束器495纳米,反映了紫光和屏障过滤器LP 460纳米。该过滤器立方体permittted的第一次观察蓝色荧光肾上腺素能神经纤维,明显不同的从黄色荧光肥大细胞(Ploem1971)。

 

从眼镜行业方面,早对这些发展中的贡献和评论写卡夫,沃尔特,特拉普和赫尔佐格

落射荧光显微镜中使用的过滤器中定义的主类(一)主要激发滤光片LP(长传)和SP(短传) -德国文学被称为KP过滤-及(b)二级过滤器作为屏障过滤器和发射滤波器等。后者也被称为荧光选择过滤器,例如用于限制FITC荧光峰值在520 nm处观察到这些。荧光显微镜的过滤器已被赋予由赖希曼最近的一项广泛的审查。

Cormane 首次证明,窄带蓝色光落射荧光标记FITC免疫人体皮肤疾病的研究中得到最佳的对比度。透射光激发紫外线灯,用来引起如此强烈的自体荧光在皮肤的弹性纤维,使可视化荧光抗体严重阻碍。

在七十年代的开创性工作莱茨落射荧光显微镜恰逢一个世界性的增加免疫和其他分子生物学方法,像鱼在医学诊断和研究中的应用。hijmans等。首次证明莱茨新的多波长激发落射照明的实用性,对于某些类别的免疫球蛋白细胞的选择性检测,使用绿色荧光FITC和红色荧光TRITC抗体共轭。他们应用的两个波长的激发方法,使用蓝色和绿色的光的选择由一个发射滤光器在520nm处(图7)的FITC荧光峰值。brandtzaeg Klein等。有类似的发现,识别免疫重要的细胞类型,使用双波长激发莱茨epiilluminator的。在染色血玫瑰花结的形成,使用UV和绿色的光的两个波长的激发方法,可以显示红细胞周围的单核细胞(图8)。

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图 7:骨髓细胞的抗-κBTRITC共轭的抗-IgG FITC共轭染色。的EPI-illmination窄带绿色和蓝色光,导致TRITC和绿色荧光的细胞含有FITC标记的细胞中含有的红色荧光。一些细胞中含有FITCTRITC

 

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图 8:人体血液细胞,花环的形成。蓝色荧光染色芪使用外延照明用紫外光红细胞染色。淋巴细胞激发后的绿色光(1965)与橙红色的染色曙红染色。

EPI照明

 

Bildschirmfoto在落射照明,二向色分束器,用于对试样的入射光偏转。已经设计了这样一种方式,只有所需的激发波长的向下偏转,通过物镜到标本,而不需要的波长的传输由分色镜,在光收集器收集后面的分色镜的光谱特性二向色镜。消除这种不必要的激发光结果在显着减少杂散光,从而提高图像对比度。二色镜偏转所需位置(短波长)的激发光通过物镜到样品上,但较长的荧光波长是透明的。抑制滤波器(屏障过滤器)吸收(或反射)从试样和物镜的透镜表面反射的激发光,但是高度透明的荧光,从而可以达到目镜。落射照明的效率是与一个物镜的数值孔径(NA)的四次方,在落射照明第一服务作为聚光镜,然后作为一个聚光透镜观察。在营销的时候第一个多波长外延照明高功率的物镜(X70X100)提供高NA0.951.30)。继Ploem建议莱茨,是世界上第一家生产中等功率的物镜,如油浸X40物镜NA1.30(图9)。这种新型的设计物镜,尤其是落射荧光显微镜,导致常规荧光显微允许短的曝光时间在非常明亮的图像。

 

右:图。9:徕兹(徕卡)早期(1967年)的原型(“Versuchs”)油浸物镜X40NA 1.30荧光落射照明技术开发的中试实验。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

最优填充的入射光瞳(光圈)的物镜

落射荧光显微术中的一个问题一直是最佳的光源的图像中的物镜的入射光瞳填充。约8倍的光源是典型的中等倍率。这是相关的不同的各种高压汞和氙气灯的电弧大小。此外,高考学生的物镜有很大的不同,例如,3.6毫米的X100NA 0.90物镜和12毫米的10倍,NA 0.30物镜。此外,如果只有一部分的圆弧可以进入的入射光瞳,得到的荧光强度将会减弱。最近Schönenborn报道在一个完全创新的事件在Leica DM RHCS)显微镜的光路。落射照明的路径现在已经被设计为允许个人适应用于不同的应用的具体光源的照明光的路径。假设科勒照明入射光路径,就是将图像的照明光学系统的组合和集电极中的光源的入射光瞳的物镜。对于一个给定的物镜,光源的放大率的选择直接取决于其几何尺寸。卤素灯应该很清楚地调整,由于线圈灯丝灯丝失调引起的极端敏感性。然后建议相对较低的放大倍率。

在一些应用中,可以在荧光强度增加了1.8倍,并在紫外线范围内的工业应用中,即使由系数为3.5,在DM RHCS)显微镜。在紫外范围内的增加已经得到了一个新的色校正6透镜的特殊的高传输玻璃类型的集电极。在Leica DM RHCS)的显微镜系统的两个模块,现已:与HC F模块的照明光学系统的倍率为11.5,和为HC射频模块倍率为4.8。此外,在Lei​​ca DM RHCS)落射照明支架HC F模块,产生非常高的荧光强度和良好的均匀性为25毫米的视图中的一个领域,有一个额外的照明透镜的组合。用户谁需要特别良好的均匀性,甚至有可能脱离的HC F模块的照明透镜,只是稍微降低的荧光强度。物镜瞳孔中的光源的图像规模为从11.5减少到约9.5的值,从而增加了约20%的有用的视场中。为了进一步提高均匀性,光扩散磁盘可以插入模块。有趣的是,已经观察到最舒适的观看荧光图像的印象时,得到的图像强度不完全是恒定的,而是稍微下降到图像的边缘。这种效果是由于眼睛的生理(所谓的横向相位差)。相反,视频图像分析技术要求非常恒定的照度。这可以通过在HC RF模块的光扩散盘切换到视频模式,从而导致更多的同质性在中央领域约16毫米(对应于所覆盖的区域由一个1/2“摄像机与电视的适配器x0 .5)。

徕卡也进一步改善的物镜为荧光显微镜。光学眼镜具有低自发荧光性能的选择,在增强图像的对比度。

荧光显微镜中的一个问题是可以得到比较厚的标本,没有锐利的图像。前焦距和后焦点的平面的不必要的贡献,这是由于 使用具有高数值孔径的物镜 到最后的显微镜图像。这将导致在更短的良好定义的图像。徕卡光谱共焦显微镜然而获得清晰的图像在高分辨率几个焦平面内的样品在高横向和纵向分辨率。

标本中分离的多个荧光染料的颜色得到了进一步的提高频谱分析。计算机辅助光谱共焦扫描显微镜也因此成为荧光显微镜在生物医学和材料研究的终极工具。

 

为各种应用在分子生物学筛选立方体

在过去十年中的分子生物学应用的爆炸已经导致许多过滤器的各种应用组合的发展。现在,这些套过滤器安装在一个大的变化滤光块(块)。荧光外延照明使2-8滤光块手工操作或机动交换交换,例如荧光杂交研究所需。本文的目的不是众多的应用程序启用各种过滤立方体给予了全面而详细的讨论。而不是只具有过滤器的多维数据集和关键字给出的示意性概述,表示可能的应用(表1)。

 

1:实施例的荧光显微镜的应用

当他们在这里列出被引用的论文中提到的光学部件和荧光染料。在此表中的用语和术语限制在文中所引用的论文中使用的术语。过滤器名称术语在德国上市斜体。作者可能被称为带外干扰滤波器(BP)的半值宽度为要么如00/00纳米,表示的中心波长和半功率带宽(例如,BP 525/20)或短期和长期的波半功率点(如BP 450-490)。确定短期和长期通滤波器由字母SPLP和边缘纳米波长(如SPLP 520 490> 520纳米)。如果该参考文献的作者的光学部件制造商,读者可以参考所引用的文献。

显微镜, 物镜, 高分子
参考文献

氟-

光源

激发滤光片

二色分光镜激发块

发射滤波器

激光扫描显微镜 (LSC) x20
表面标志

DNA 染色法

Körnemann et al.: Cytometry 41: 172–177 (2000)

FITC
PI

Argon laser
blue 488 nm*

 

530 + 30 nm&
BP green
625 + 28 nm&
BP red

Inverted fluorescence microscope x40
Fluorescence lifetime imaging
Murata et al.: Cytometry 41: 178–185 (2000)

Ho
7-AAD

DCM laser
UV 335 nm*

FT 395%
(DM, DBS)

450 + 33 nm&
BP violet

Digital fluorescence microscopy x100/0.60–1.32, SP (KP) 630 in front of CCD camera to block far red and infrared light
PNA FISH
de Pauw et al.: Cytometry 32: 163–167 (1998)

CY3
DAPI

green 515–560&
UV 340–380& nm BP

 

LP 580 red#
LP 430 blue#

Confocal fluorescence microscopy x60/1.4
Photobleaching studies
van Oostveldt et al.: Cytometry 32: 137–146 (1998)

FITC

Ar+-ion line
blue 488 nm*
BHS&

 

LP OG 530#
yellow

Digital fluorescence microscopy x63/1.4
Excitation filter wheel
Chromosome studies
Poon et al.: Cytometry 36: 267–278 (1999)

DAPI
Cy3

Hybrid/xenon mercury lamp
405* nm violet
546* nm green
DAPI/Cy3 filter set

 

 

Fluorescence microscopy
Intratumor heterogeneity of chromosomes
da Vinci et al.: Cytometry 37: 369–375 (1999)

TRITC
FITC
DAPI

Triple-bandpass filter* (MBP)

FM%

(Emission)

Fluorescence microscope x100/1.35
Daunorubicin sequestration
Bour-Dill et al.: Cytometry 39: 16–25 (2000)

LB
Daunorubicin
NBD
DiOC

Mercury 100 W
BP 330–385&
BP 460–449&
BP 460–490&


DM 410%
DM 570%
DM 510%

(Emission)
BP 430–460$
LP 590#
BP 510–550$

Fluorescence microscope
Automated comet assay
Böcker et al.: Cytometry 35: 134–144 (1999)



PI

Mercury 100 W
SP 580^



E2@

(Emission)
LP 590#

Motorized epi-illuminator x100/1.3
Chromosome studies with multicolor
FISH
Kuzobek et al.: Cytometry 36: 279–293 (1999)


DAPI
FITC
Texas-red

Mercury 100 W
UV
blue
green

Four filter cubes@(FC)

(Emission)
BP 425@ blue
BP 525@ green
BP 615@ red

Inverted fluorescence microscope, CCD
Three-color imaging of chromosomes
Coco-Martin et al.: Cytometry 32: 327–336 (1998)

DAPI

FITC
TRITC

UV
BP 365/12&
BP 450–490&
BP 546/12&

 

Emission
>379# nm
>520# nm
>593# nm

Digital fluorescence microscope and (CCD) x40/0.75
Image analysis of granulocytes
Szecs et al.: Cytometry 33: 19–31 (1998)



R 123
EB

Multi-band pass filter (MBP)
490~ nm blue
570~ nm green

Triple-band (polychroic) beamsplitter (PBS)%~

Triple-band emission filter
520~ nm
580~ nm

Fluorescence microscope with motorized epi-illuminator, delayed luminescence imaging and CCD, x63/1.32
FISH Karyotyping
Tanke et al.: Cytometry 33: 453–459 (1998)

cascade bl
F
LR
Cy5
Cy7
Platinum coproporphyrin

Mercury 100 W





BP& 500–560 nm

A@
HQ-FITC@
HQ-TRITC@
HQ-Cy5@
HQ-Cy7@
DBS 580@ nm







BP$ 600–700 nm

Fluorescence microscope with motorized filter changer and CCD camera
Two colour ratio method in FISH
Morrison and Legator: Cytometry 27: 314–326 (1997)

DNA probes:
1 green
2 orange
(1) WCP
(2) CEP

 
  
 

BP& 510/20 nm
BP& 572/18 nm

Triple-band (polychroic) beamsplitter (PBS)%~

Triple band-pass emission filter:
MBP~ 535 nm
MBP~ 606 nm

Fluorescence microscope with CCD camera
Comparative genomic hybridization
Bornfleth et al.: Cytometry 24: 1–13 (1996)


DAPI
FITC
Texas red

Mercury 50 W
Triple band-pass excitation filter

 

Triple band-pass emission filter

Fluorescence microscope and CCD camera, x20/0.75
Segmentation of nuclear images
Price et al.: Cytometry 25: 303–316 (1996)


DAPI

Mercury 100 W
BP& 365/10


DM% 400 nm


none

Microscope with CCD camera x30/0.5
Multiparameter fluorescence imaging of lymphocytes using labelled monoclonal antibodies
Galbraith et al: New Technologies in Cytometry, in: Proc. of the SPIE 1063 (1989)


FITC
PE
Cy5
Cy3

Manual, six position slider for fluorescence filters

 

 

Special optical system for epi-illumination microscopy with wavelength switching using a polychroic beam-splitter
Heiden and Tribukait: Cytometry 20: 95–101 (1995)


DAPI
TRITC

Mercury 100 W
BP& 365/33 nm
BP& 546/23 nm

Polychroic PBS%
365 reflection
546 reflection


BP$ 435–500 nm
BP$ 500–750 nm

*排放或激光线。
^短传SPKP)激发滤光片窄带通(BP)激发滤光片。多带通滤波器(MBP)。 %分色分束器(DBS)或分色镜(DM)%〜 PolychroicspitterPBS)中。#屏障过滤器(LP)。发射带通(BP)的干涉滤光器,和发射多个带通滤波器(MBP)。@筛选立方体,块(FC)。

反射显微镜(RCM

徕卡落射照明显微镜的发展已经导致了进一步的发展:反射显微镜。反射显微镜标本染色与常规的吸收免疫学指标如过氧化物酶-DAB,免疫金银和免疫磷酸酶(图10和图11)提供了强有力的信号。由于强烈的信号
,可以得到-图像对比度高的图像并没有恶化前和交的焦点图像-薄切片,RCM满足所有的理论光的最佳光显微镜的分辨率标准。可以被定义为高清晰度的图像的光的结果。

Bildschirmfoto

图 10:反射显微镜(RCM)。小鼠腹腔巨噬细胞秉承盖玻片和表面抗原的单克隆抗体染色。免疫组化染色。丝状伪足的薄膜的扩展,这是不明视野显微镜visisble,是可见的强relfectionDABox产品bccause的。

 

Bildschirmfoto

图 11:超薄切片(约35 nm)的肾组织过氧化物酶DAB染色。反射显微镜观察到肾小球的线性染色模式呈现往往比用荧光显微镜更清晰的图像。

 

 

Bildschirmfoto

图 12:过滤器的立方体(块),用于反射显微镜,含有偏振片(50%),中性束器和分析仪。该过滤器的多维数据集(块)可以被插入到一个荧光显微镜落射照明的Leica的位置。

 

大多数免疫组化染色的强反射,提供了这样一个高对比度,这种染色可以结合很多经典的(吸收)为重要的大分子,显示出适度的强反射的组织化学染色。后者的污渍常常可以直接使用,提供良好的形态取向和在许多情况下,比单独使用荧光标记物来实现更精确的位置的immunomarker。此外,这样的光显微镜观察,可以确认通过电子显微镜通过检查下一个超薄切片(具有相同的免疫染色)与EM

在共聚焦激光扫描显微镜中,RCM可以进行,没有特殊的或其他的杂散光减少光措施,由于消除杂散光被照明透过针孔。最吸引人的免疫染色得到一个非常强大的激光的反射和显示非常有限褪色。他们往往允许一个小针孔的大小(例如10微米),这是小于约五到十倍可用于大多数荧光染料共聚焦荧光激光扫描技术显微镜的使用。因此,反射免疫学指标的使用可以导致在光学分辨率的一个非常显着的增加。标本双染既具有荧光和徕卡光谱共焦激光扫描显微镜提供了新的可能性多个标记可以很容易地检查反射immunomarker

RCM使用荧光显微镜支架,落射照明器和高压灯。一个额外的偏振器滤块,包含偏振器,反射板,和分析器的荧光落射照明,必须插入(图12)。另外一个反射对比度(RC)膜片模块(包含中央停止系统)必须使入射光路。中央车站和/或光圈隔膜,这RC隔膜模块适应滑动套。此外,反射显微镜开发的一个特殊的物镜,配备徕卡RC M-PLAN油浸x100/1.25 RCM物镜的λ/ 4波片在镜头前,应加一套物镜(荧光显微镜)上炮塔物镜的左轮手枪。

 

在反射光显微镜,对比是基于不同的反射强度(反射率)。在这种类型的显微镜,它应该提醒的是,在每一个光学边界发生光的反射,即当的折射率和/或吸收指数的变化。对于生物标本示出反射率小于1%,并主要是小于0.2%,这几乎是不可能取得的反射光图像,用常规的显微镜,由于显微镜管内的不必要的反射。在反射显微镜,使用两种方法的组合,以减少眩光,由于散射光。入射光被制作成一个由一个中心站(与中央站提供,创建环形光阑的孔径光阑)的入射光路径与后焦距(光圈)的平面共轭的平面插入的光锥ringshaped的物镜。作为第二方法,不想要的散射反射光减少所使用的抗折的的方法。通过使用正交偏光显微镜内部的反射的光被抑制,其结果,从检体被传递到眼睛反射的光。该物镜设置有一个物镜的四分之一波片,在前面的物镜镜头。通过的光通过λ/ 4板(向下的试样从试样反射后向上)改变光的偏振方向,用2×45°= 90°