设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

徕卡显微镜:选择你的激发波长

2013-10-16  发布者:admin 

荧光寿命成像显微术(FLIM)被广泛应用于蛋白质相互作用量化测量FRET(福斯特共振能量转移)发生的两个荧光基团之间的间隔由几纳米。FLIM也被用来在大阵列的应用范围从组织成像荧光探测环境。虽然时间相关的单光子计数(TCSPC)荧光寿命定量方法的选择,它要求包括:i)一个脉冲激光源,2)光子计数卡,及iii)一个快速检测的专用仪器。这种技术要求呈现TCSPC收购很难执行和/或缩小选择可用荧光。

徕卡TCS SP5 X克服了这些限制,因为它结合了脉冲白光激光(WLL)的超快光电倍增管(PMT),允许可调光谱检测。该系统是高度灵活的和用户友好的FLIM的实验。在本文中,我们说明了它的潜力,两个生物应用:交互研究和自发荧光多光谱成像。

 

 

 

技术说明

20世纪90年代中后期以来的首份报告的光子晶体光纤产生超备受关注。它允许相干白光生产抽高非线性光子晶体光纤的超短激光脉冲(或皮秒)。由于其广泛的光谱,这个源常用的光谱和它最近还​​实施商业显微镜系统:徕卡TCS SP5 X.

配备了一个声光光束分束器(AOBS),这个系统提供了一个很容易调谐范围为470至670nm的脉冲激光光源,允许在其最大吸收激发的荧光基团的大面板。为了确定,WLL是否是一个合适的来源FLIM的实验,我们运行校准基于双光子FLIM的测量验证协议值得注意的是,我们测量系统的仪器响应函数,得到的半峰全宽为约300 ps的,完美兼容细胞和组织中的荧光寿命测量的。然后,我们测试的能力FLIM的应用两大领域:我)相互作用的研究FRET及ii)组织的自体荧光成像。要解决这两种情况下,我们采用了以下的实验条件:

  • 使用徕卡TCS SP5 X焦和内部PMT进行终身收购。光子计数使用的贝克尔和Hickl的SPC830卡和SPCImage的生命周期分析是用于执行。
  • 两个激励源用于FRET测量:卡默莱昂ULTRA2钛宝石激光在920纳米(8分子量:客观回到瞳),在488 nm和WLL。检测通之间设置500和540 nm和300秒的采集时间。
  • 对于convalaria截面成像,我们还使用了两种不同的激发源:405脉冲激光二极管和WLL。激发和检测通报告中的第三个数字。采集时间设置为60秒每幅图像。
 
非线性光子晶体光纤横截面
 1A:非线性光子晶体光纤横截面
白光光谱Leica TCS SP5.gif
 1B:白光光谱Leica TCS SP5中的X(AU)上测得470和670纳米之间。
 

多功能性FLIM-FRET实验

Leica TCS SP5中的十列出一个脉冲的WLL和超快探测器光谱选择。我们开发的系统,还配备了一个光子计数卡(SPC830,贝克尔和Hickl等)和钛:萨激光(变色龙ULTRA II),一个国家的最先进的源TCSPC实验。FLIM的特别适用于可视化和测量FRET发生在纳米尺度的组织或细胞之间的相互作用的蛋白质。因此,为了验证作为源FLIM的WLL,我们进行的TCSPC实验正面和负面的FRET引用交替使用Ti:Sa和WLL作为激励激光源在同一细胞。正如图2中所示,两个激励源提供一致的结果,并允许定量的荧光共振能量转移测量。WLL可以被用来作为一个多功能的源FLIM的FRET实验。此外,在TCSPC模式的寿命精度直接依赖于获取的光子的数量。在使用本系统时,我们可以优化收集光子的数目由i)优化激发波长的荧光基团的最大吸收和ii)选择了理想的检测范围内没有,受体荧光bleedthrough的最大供体发射。

Spriet_Figure_2
 2:既负(MB-EGFP)和阳性(MB-EGFP-mCherry)FRET参考使用WLL或钛:萨激光荧光寿命成像。使用40倍,1.25 NA油浸目标进行收购。比例尺:40微米。
 

多光谱寿命成像显微镜(MSLIM)

结合的AOBS和光谱使用内部的PMT的选择,该系统允许同时就激发和发射波长选择的通用性高。如前所示,相关的光谱和寿命测量(纤细)是一种很有前途的技术和强大的歧视多标记的样品和检测分子间的相互作用内部异质性和自体荧光媒体,如组织一个WLL的使用进一步扩展的可能性的研究复杂的荧光信号。事实上,人们现在可以执行多光谱的寿命成像的显微镜(MSLIM)通过调整两个激发波长(WLL,通过AOBS)和观察范围(移动的狭缝前面的内部PMT)。在这里,我们提出了一个例子自发荧光MSLIM使用固定convalaria幻灯片。

连续荧光寿命成像
 3:连续荧光寿命成像的convalaria横截面采用各种激励(灰色条)和观察(虚线框)波长窗口。励磁实现使用的WLL,除了在405 nm的激发,这是通过使用脉冲激光二极管。使用了10倍,NA 0.3干目标进行收购。比例尺:500微米。