设为首页 | 添加收藏 |sitemap |百度地图 |
货真价实 坦诚无欺
新闻资讯

尼康显微镜:荧光蛋白的成像参数

2013-10-16  发布者:admin 

迄今发现的荧光蛋白及衍生工具的广泛用途相当广泛,并已成功地应用在几乎每一个生物学科从微生物系统生理学。这些独特的探头已经证明是非常有用的记者在培养细胞和整个动物的基因表达研究。荧光蛋白在活细胞中,最常用的跟踪本地化和动态的蛋白质,细胞器,和其他细胞区室,以及细胞内蛋白质运输示踪剂。很容易地完成了多种技术,其中包括尼康显微镜,宽视场,共聚焦和多光子显微镜,荧光蛋白的定量成像曝光细胞结构和功能的复杂性,提供了一个独特的窗口。

fpimagingfigure1

复杂的荧光蛋白的光谱和物理性能影响任何定量测量的准确性和效用。许多这些性质,如摩尔消光系数,量子产率,光漂白率,光谱公司的pH值的依赖,可以很容易地用纯化的蛋白在体外测量然而,其他重要的和实验的关键特性,包括发色团的形成(成熟)和蛋白质在体内的降解率的时间过程,更难以确定。对于典型的实验中,最亮,最稳定的单体荧光蛋白衍生物应选择,以减少施加复杂背景,在要求较低的应用中光漂白校正的必要性。

在选择成像实验中,水母和珊瑚市售的增强型变种,以及它们的衍生物的荧光蛋白载体,应当认真考虑。这些是与青色(ECFP),绿色(EGFP),和黄色(EYFP)光谱区域,现在已经被引入的新的单体的红色发光荧光蛋白的荧光公司提供如图1中所示,获得的图像可以选择使用各种市售荧光蛋白融合载体几个不同的亚细胞位置。图1中所示的探针的荧光发射光谱覆盖的带宽的几乎180纳米,具有极大值,范围从440至618纳米。这些探针是最亮,最稳定的荧光蛋白的变体,并允许成像照明光漂白(下面讨论)和光毒性的问题,如在低光照水平,最大限度地减少。许多荧光蛋白变体(包括EGFP,ECFP和EYFP)可以在足够高的浓度,可以干扰膜结构的工件,或导致不正确的假设,进行定量先进的荧光共振能量转移技术,如形成二聚体(FRET) 。

另外的本征亮度的荧光蛋白的基因工程中的表达水平是产生显着明亮的细胞内信号从融合构建另一个要考虑的因素。使用具有强启动子的载体,以提高转录水平和适当的密码子,以优化翻译的应用是必不可少的,用于提高融合蛋白的表达水平,从而提高整体的信号电平。当细胞的自体荧光,使得它难以区分背景荧光的荧光融合蛋白排放时,这一点尤为重要。

多种技术可以应用到一种荧光蛋白融合产物的细胞中的表达水平和亮度增强。此外,丁酸钠(大约1至5毫摩尔),向培养基中,将增加整体在稳定的细胞系中表达的融合蛋白的基因的表达水平。此外,瞬时转染细胞的使用是有吸引力的选择,因为他们经常显示稳定地转染的细胞相比,表达水平高得多。应该行使一定程度的谨慎,然而,瞬时转染由于可能过度表达的文物,包括蛋白质聚集或饱和度蛋白靶向机械,导致不适当的本地化。最后,增加串联荧光蛋白序列的数目(双键或三)在克隆载体是一种替代方法,用于提高融合蛋白的亮度水平。

临界荧光蛋白特性

大多数的市售荧光蛋白载体具有改进的性能,由于优化的密码子使用在哺乳动物细胞中的翻译和位点定向诱变在较高的温度下,以提高效率的发色团成熟。对于要求更高的成像应用中,荧光蛋白的表达或物镜丰度低,在探针的内在属性将可能是一个限制因素。因此,有必要充分了解荧光蛋白的固有特性,并运用必要的控制,以最大限度地减少成像探针在活细胞实验过程中可能出现的文物。

光子引起的发色基团破坏,这种现象称为漂白,荧光蛋白通常是减少的速度和幅度相比,传统的合成荧光,在类似的条件下,如荧光素和若丹明。这种漂白的阻力被认为是排列紧密周围的β -蛋白质结构产生荧光蛋白生色团的保护无论如何,它仍然是重要的,严格执行漂白定量成像实验的控制措施。

fpimagingfigure2

率的光漂白荧光蛋白可确定获取隔时图像的一系列标记的对照细胞,然后通过定量测量,发射强度,它的表现通常是一个指数衰减逐渐丧失。光漂白的荧光损耗曲线(图2中所示),然后,可以采用修正的成像实验。虽然不是一般意义上显着的问题,如果光漂白成为限制因素成像时的活细胞,抗淬灭剂如抗坏血酸,Trolox的,或Oxyrase(氧和自由基清除剂)可加入到培养基中。

漂白虽然往往是在荧光显微镜中的最终的限制因素,许多荧光蛋白衍生物的光漂白率是比较慢的(参见图2)。另一个限制因素是荧光基团的饱和度,这不会发生在宽视场显微术,但可以是一个显着的问题,用激光扫描共聚焦激发强度足够高,以达到饱和,有时工具。荧光饱和发生时,所有可用的分子都在不断增加激发光处于兴奋状态,所以不会产生相应增加荧光。在这种情况下,这是非常困难,校准由于非线性,一个问题,即只能通过降低激光输入功率校正的荧光信号。

细胞内的环境条件,特别是pH值和高的局部浓度,其它一价和二价阳离子,可以改变荧光蛋白衍生物的亮度电平。例如,野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)显示相对亮度均匀pH值为5至pH10,而增强型绿色和黄色荧光蛋白均在酸性pH值水平的骤冷,定位于细胞器(溶酶体)或降低其有效性亚细胞具有低pH值的内饰。其他衍生工具,如ECFP和DsRedFP的是不太敏感的低pH值。然而,许多荧光蛋白融合的产品将被定位在生理pH条件下,这应该不会严重影响荧光强度的区域附近的。

固有荧光蛋白,可能会显着地改变定量成像(但不能准确地在体外测定),发色团的折叠动力学,或导通时间之间的其他物理参数可以有最严重的后果。Aequorea victoria的水母(和大多数礁珊瑚)荧光蛋白的衍生物需要的氧化生色团的形成,但氧气不容易穿透致密的蛋白结构,周围的三肽荧光。因此,一个相当大的延迟(通常超过几个小时)之间可能出现的蛋白表达和荧光的外观。不幸的是,它不是经常容易区分,由于荧光蛋白表达(理想的测量),由于缓慢的发色基团形成(一个工件)之间的延迟。相反的过程,成熟的荧光蛋白在体内降解,也很难监测,但压倒性的证据表明,许多这些探头都非常稳定。

显微镜参数

宽视场,共聚焦和多光子荧光显微镜,无论是在直立或倒置配置的,是观察荧光蛋白在活细胞和组织的理想工具。所需的照明源的范围从含汞和氙弧放电灯的宽视场,在共聚焦和锁模脉冲激光多光子显微镜(见表1)的气体和半导体连续波激光器。绿色荧光蛋白及其变种很容易的汞灯或氩离子或氪氩气体激光器发出的488纳米线与明亮的蓝色光谱线成像。此外,一台主机的新的固态激光器的生产线的许多部分,包括在可见光谱的紫光和蓝光区域,将被引入。荧光蛋白变体,具有转移到蓝色,红色,和近红外波长的光谱通常以更高的效率,使用氙灯或金属卤化物灯,以及激光发射线紧密匹配的激发最大值成像的。无论光源,成像荧光蛋白的主要问题是,提供足够的激励光,以合理的信号电平。

除了物镜,下面讨论的,荧光蛋白成像的两个最重要的组成部分是发射滤波器和检测器。在宽视场显微镜中,激发滤光器,二色镜,和发射滤光器组合成一个光学块的带宽被用于激发所述光源由激发光滤光片。例如,汞灯时,需要具有高传输图像的绿色荧光蛋白在450和490纳米之间的激发带通滤波器。更短的波长带为青绿色和蓝色的变体是必要的,而更长的波长带,用于黄色,橙色和红色的衍生物。激光线的带宽只有几纳米的大小,因此,通常不需要使用干涉滤光片的波长选择。二色镜切波长应该清楚地分开前有效地反射和发射后者的激发和发射光谱。有很少的保证金的错误选择合适的双色镜。另一方面,发射波长的滤光片,可以进行微调,通过从20变到几百纳米的带宽,这取决于实验要求。这些过滤器是最灵活的,在确定传递到检测器的荧光发射强度的水平。编目表1中建议的过滤器组合的荧光蛋白的定量成像的列表。这些过滤器的建议,其中包括仅带通的排放过滤器(实际上,忽略长通滤光片的建议),应被视为仅仅作为一个起点,设计实验。

fpimagingfigure3

一些流行的绿色荧光蛋白的过滤器集的性能的影响,可以判断图像进行比较,从相同的视场捕获的单个滤波器的组合,如在图3中示出。标本是贴壁培养的胚胎大鼠胸主动脉与一个向量,包含一个红移的(增强)绿色荧光蛋白的变种,EGFP人类细胞质β ​​-肌动蛋白结合的基因融合蛋白转染的成肌细胞融合蛋白的表达,表现出其纳入日益增长的微丝,使可视化的亚细胞结构,适当的过滤器组合(见图3)用荧光显微镜。胸主动脉成肌细胞也沾上Mitotracker有:红CMXRos(线粒体红色荧光)和Hoechst 33258(细胞核中的DNA;蓝色荧光)。请注意信号的情况下,与活塞从蓝色和红色的荧光基团,赋予带通滤波器(图3(a)和图3(b)),但显着程度的橙红色的荧光所产生的线粒体探头与赋予长通滤光片(图图3(c))。带宽的30纳米(活塞),50纳米(赋予BP),和超过100纳米(赋予LP),带通和长通的GFP过滤组合,也可与多种合成荧光受光激发在可见光谱的蓝色部分。

虽然绿色荧光蛋白一般可以与标准的荧光过滤器组合成像,如果强度足够高,使用专门的过滤器(见图3),将使微调信号采集,包括或排除其他组件。一个专门的过滤器组合的GFP定量成像应该使用排放窄带通滤波器,以最大限度地提高荧光蛋白对背景信号(通常是自发荧光)。一个狭窄的带通发射光滤光片,尖锐的蓝绿色荧光蛋白的信号(图3(a))与优先传递到该检测器上(图3(b)),或绿色橙色绿黄色(图3(c) )细胞自体荧光和其他荧光发射波长更长的背景。自体荧光通常具有非常广泛,而绿色荧光蛋白的发射光谱相对较窄。原则上,最窄的带通滤波器的选择应比其他的背景信号增加荧光蛋白发射的歧视。然而,最佳的滤波器的通带,将被限制了所需的信号与噪声的比和检测器的特征,如下面所讨论。每个成像的情况,应确定最佳的带通。此外,虽然图3中所示,所选择的特定的过滤器的组合增强型绿色荧光蛋白不仅依赖于信号强度,同时也对的荧光发射光谱轮廓的蛋白质变体(见表1)成像。

蓝色荧光蛋白变种可以在宽视场荧光显微镜使用标准DAPI过滤器组合激发过滤器公司,在330至380纳米范围内成像,截止波长385至400纳米,无论是带通或长波发射滤光片色镜(420纳米以上)。这些过滤器的组合是非常有用的青色荧光蛋白,然而,与激发的蓝紫光(400到440纳米)的图像的荧光基团的过滤器,以产生最佳的图片。青色荧光蛋白的二色性反射镜切割之间的波长455和460纳米,以及传输460和500纳米之间的光的发射滤光片。许多蓝紫色的标准长通和带通滤波器的组合可以的成功形象青色荧光蛋白衍生物(包括天蓝和AmCyan1),,但显微镜和售后市场滤清器的厂家也提供了专门为这些探头的自定义设置。

虽然黄色荧光蛋白衍生物(包括增强,金星和水晶)通常使用过滤器组合设计FITC和绿色荧光蛋白产生可接受的图像,得到更好的结果时,吸收和发射波长稍长的配置文件显示这些滤波器参数优化探头。为黄色荧光蛋白的理想的组合是与跨越490至510纳米的带通区域的激发滤光片,二色性反射镜与截止波长为515纳米的,和发射滤波器通过在520和550纳米之间的波长。à长波发射滤波器与截止波长为515纳米或略高也将产生黄色荧光蛋白的良好形象。

橙色和红色荧光蛋白的光谱剖面跨越一个大的波长区域,不幸的是,没有一个单一的过滤器组合,是理想的成像的整个集合这些荧光。红色荧光蛋白的荧光蛋白变体往往是与TRITC标准过滤器的组合,以及许多长通和带通设置吸收可见光谱的绿色区域中的其他探测器设计的可视化的橙色荧光蛋白成像(魔橙和橙色CoralHue)应在500至540纳米的区域与激发滤光片,加上双色镜的截止波长约550纳米,带通滤波器,它具有发射波长560至600纳米之间。几个标准的绿色激发滤光片组合松散符合要求,但必须设计为专门的滤波器参数优化此类别中的特定荧光成像。更长的波长红色荧光的蛋白质(mCherry,HcRed1,mRaspberry mPlum),通常可以与黄色激发滤光片组合成像。例如,尼康Y-2E / C的设置,具有一个带通中的540至580纳米,二色性反射镜与截止波长为595纳米的,和一个带通发射600纳米和660纳米之间的过滤器捕获光子激发滤光片,可以可用于许多这些红色的探针。显微镜和过滤器制造商所提供的自定义过滤器组合。

在激光共聚焦显微镜,激发波长的选择限制在一个狭窄的范围内为每个仪器可用的激光线。典型的显微镜都配有两个或多个激光器,跨越紫罗兰(405和440纳米),蓝色(457,477和488纳米),绿色(514和543纳米),黄橙色(568和594纳米),并红(633和647纳米)光谱区域。可以有效地使用这些激发波长激发表1中列出的荧光蛋白,这取决于可用的适当的二色性反射镜和发射滤光片。多光子显微镜,也可利用图像最流行的荧光蛋白的衍生物,在受限制的空间体积,这些工具的特征。

荧光蛋白过滤组合参数
 
蛋白质
(缩写)
激光激发(nm) 激发滤光片
CWL / BW (nm)
双色镜
Cut-On (nm)
二次滤光
CWL / BW (nm)
相对亮度
(% of EGFP)
GFP (wt) Argon (488) 450/50 480LP 510/50 48
绿色荧光蛋白
EGFP Argon (488) 470/40 495LP 515/30 100
Emerald Argon (488) 470/40 495LP 515/30 116
Azami Green Argon (488) 470/40 495LP 520/30 121
CopGFP Argon (488) 470/40 490LP 510/30 125
AcGFP Argon (488) 470/40 490LP 510/30 82
ZsGreen Argon (488) 470/30 495LP 520/40 117
蓝色荧光蛋白
EBFP Diode (405) 375/50 405LP 445/50 27
Sapphire Diode (405) 400/50 460LP 515/50 55
T-Sapphire Diode (405) 400/50 460LP 515/50 79
青色荧光蛋白
AmCyan1 Argon (457) 440/40 470LP 500/40 31
ECFP Diode (440) 435/40 460LP 495/50 39
Cerulean Diode (440) 435/40 460LP 500/50 79
CoralHue Cyan Argon (488) 450/50 480LP 505/35 73
黄色荧光蛋白
EYFP Argon (514) 490/40 515LP 540/30 151
PhiYFP Argon (514) 500/45 525LP 555/40 155
Citrine Argon (514) 500/25 515LP 545/40 174
Venus Argon (514) 495/35 515LP 545/40 156
ZsYellow1 He-Ne (543) 500/45 525LP 555/40 25
橙色和红色荧光蛋白
CoralHue Orange He-Ne (543) 525/40 550LP 580/40 92
mOrange He-Ne (543) 525/40 550LP 585/50 146
DsRed He-Ne (543) 540/45 570LP 600/50 176
DsRed2 He-Ne (543) 540/50 570LP 600/40 72
DsRed-Express He-Ne (543) 540/45 570LP 600/50 58
mTangerine Kr-Ar (568) 545/40 570LP 600/40 34
mStrawberry Kr-Ar (568) 550/50 580LP 615/50 78
AsRed2 Kr-Ar (568) 540/40 575LP 620/60 8
mRFP1 He-Ne (594) 560/55 590LP 630/60 37
mCherry He-Ne (594) 560/55 590LP 630/60 47
HcRed1 He-Ne (594) 560/60 595LP 630/50 1
mRaspberry He-Ne (594) 570/60 605LP 645/60 38
HcRed-Tandem He-Ne (594) 570/70 610LP 650/60 19
mPlum He-Ne (594) 570/60 605LP 650/60 12
光学荧光笔荧光蛋白; (N) = 本土 (P) = 照片转换
PA-GFP (N) Diode (405) 400/60 465LP 530/50 8
PA-GFP (P) Argon (488) 480/40 505LP 535/40 41
PS-CFP (N) Diode (405) 395/50 430LP 470/60 16
PS-CFP (P) Argon (488) 470/50 500LP 530/40 15
PS-CFP2 (N) Diode (405) 395/50 430LP 470/60 26
PS-CFP2 (P) Argon (488) 470/50 500LP 530/40 32
Kaede (N) Argon (488) 485/40 510LP 535/30 259
Kaede (P) Kr-Ar (568) 540/50 570LP 590/30 59
mEosFP (N) Argon (488) 490/30 510LP 535/30 128
mEosFP (P) Kr-Ar (568) 540/50 570LP 600/40 68
Kindling (N/P) Kr-Ar (568) 560/50 590LP 625/50 12
Dronpa (P) Argon (488) 485/30 505LP 530/30 240
     
表1

表1给出的是一个汇编显示一些最流行的,潜在有用的荧光蛋白变种物业。随着每个荧光蛋白的最佳激光波长线,以及建议的出发点的激发和发射滤波器带宽(中心波长)的通用名称和/或首字母缩写列出。也包括在表中的相对亮度和推荐的二色镜参数。是来自于该产品的摩尔消光系数和量子产率,EGFP的值除以计算出的亮度值。创建此房产已被科学和商业的文献资源,目的不是要全面,而是代表荧光蛋白的衍生物,在文献中得到相当的重视,可能证明是有价值的研究工作。

通常优选的定量显微镜的检测器是光电倍增管和冷却的电荷耦合器件(CCD)摄像系统。由于光电倍增管成像仪,光栅扫描(用于在激光共聚焦显微镜)必须执行整个标本逐点建立形象。或者,CCD图像传感器中的光电二极管阵列,产生二维图像的大小的限制,仅由单个二极管元件的数量。除了 ​​从信号对噪声的考虑,检测器系统的最重要的方面是它的线性度和偏移。CCD阵列是两个光电倍增管和高线性度和较高的高端相机系统,使调整的偏移量(通常被称为黑电平),尽一切倍增配置。在实践中,应调整偏移量读取为零时,从检体没有荧光发射。如果有一个非零偏移系统中,它不会未能取得定量的图像之间的差异。

在激光扫描共聚焦显微镜,光电倍增管通常具有较低的动态范围(8位或256级灰度)和检测效率(15%〜30%)相比,到一个冷却的CCD摄像系统。虽然这将是可取的,以增加检测效率,8位的动态范围通常不是一个问题,因为每个像素一般少于255个光子收集每个扫描(即使是很好的染色标本)。尽管如此,倍增的响应,同时加上适当的激光器的可用性与背景抑制性能卓越的线性度,使共聚焦显微镜的荧光蛋白定量成像的最佳选择。多光子显微镜,从而消除相差的光损伤的焦平面上,以避免色差,提供了高分辨率的三维测量,荧光蛋白成像也是一种非常有用的工具。

最重要的参数是定义定量成像的效用的信号-噪声比(简称S / N)。这个值是在现代商业荧光显微镜一般的散粒噪声是来自于由检测器收集的光子数的平方根被定义为。几个系统误差可能被引入在检测系统中,但它们通常是比较小的散粒噪声的CCD和光电倍增管。例如,如果一个检测器收集每像素100个光子,噪声将被预期为10(100)的平方根,或10%的信号。同样地,对于噪声(100)的10,000的每个像素的光子的信号,是信号只有1%。这些例子反映了典型的信号电平,在荧光显微镜中,在检测电路中引入的误差通常低于1%。一次出现时,它似乎是显而易见的,最高的信号-噪声电平是最可取的,但在现实中,因素,例如:光漂白,荧光团的饱和度,样品中的荧光基团的数目和空间分辨率极限所得到的信号噪比。

在大多数情况下,以等于比例之间存在的荧光蛋白标签,以及稠合的细胞靶蛋白。因此,在单元格中的荧光分子的浓度,可以计算出从作为参考标准使用已知浓度的重组荧光蛋白的细胞总荧光。增强型绿色荧光蛋白通常采用用于此目的,因为它的光稳定性和亮度。计算细胞内EGFP的浓度,已知量的标记可以被嵌入在聚丙烯酰胺平板细胞表达融合构建一起拍摄。参考的标准也已开发用于计算密度的膜结合蛋白,通过将准确数量的组氨酸标签的绿色荧光蛋白包被的磁珠。蛋白表达的定量分析,随着越来越多的荧光蛋白用敲的方法在整个生物标记分子利用,将成为越来越有用的技术。

选择物镜荧光蛋白成像

用于成像实验设计协议时,虽然它可能是最重要的考虑,物镜的选择往往是最少量的思想。在确定可用的空间分辨率的图像传感器收集的光的量是最重要的物镜的参数。在一般情况下,物镜是由三个主要的标准:数值孔径,放大倍数和光学矫正的程度定义。最不重要的参数放大倍率,尽管普遍的看法相反。放大倍数确定一个对象将出现在目镜或探测器只大,但不发挥作用,分辨率(最小的细节,可以清楚地观察)或亮度(将要收集的荧光信号的量)的图像。

fpimagingfigure4

分辨率和亮度的数值孔径,这是最重要的标准选择一个物镜的函数。的数值孔径定义,将进入物镜前透镜的光的量,所以应选择尽可能高的数值孔径成像的荧光蛋白进行定量。图像采集(任何形式的)背后的一般原则很简单:作为信号噪声比的增加,所以图像质量。这个概念是特别关键的激光扫描共聚焦显微镜系统,其中收集的光子数量往往是相当小的(通常只有几每像素)的图像集合。因此,谨慎选择适当的物镜是优化光子收集策略时特别有用。请注意,图像的整体亮度的平方除以放大倍率的物镜的数值孔径的四次方成正比。

图4中所示的数值孔径的原理的分辨率和图像的亮度方面的重要性的一个例子。样品是培养贴壁的人骨肉瘤上皮细胞(U2OS线)转染的质粒载体编码增强型绿色荧光蛋白融合到线粒体靶向的核苷酸序列从人类细胞色素C氧化酶亚基VIII。的质粒转染的哺乳动物宿主的转录和翻译后的线粒体定位信号是负责细胞线粒体网络的荧光蛋白嵌合体在整个运输和分配。管状线粒体随后可以可视化使用荧光显微镜。

在图4中,使用具有相同的光学校正(方案萤石)和数值孔径(1.3)的物镜成像的相同的视场,但与从40倍到100倍的放大倍率。虽然在图4中收集的图像的像素和使用的检测器的条件的数是相同的,线粒体是明亮的成像时,通过40倍物镜(图4(a))。相比之下,更高的放大倍率60X和100X的物镜(图4(b)和图4(c),分别),100倍的图像几乎不产生逐渐变暗的图像。此物镜,仍然可以使用的图像试样,但检测器的增益,必须显着增加,导致恶化的信号 - 噪声比,并通常次于图像。请注意,物镜的分辨能力(图图4(d)通过第4(f))是可比较的,因为在相同的数值孔径值。

从图4中的数据,将收集到的基本概念之一是避免过度的放大倍率,选择物镜时的荧光蛋白成像(和其他的荧光团,为此事)。简单地增加数字放大(变焦),图像采集过程中使用40倍的物镜结果共聚焦显微镜中的图像大小相当于100倍的镜头(图4(d)及(f)条)。这两个物镜的分辨率是一样的,因为他们有相同的数值孔径值。不应被视为相对次要的放大倍率参数表明,使用60倍或100倍的物镜是不是有利。事实上,选择高倍率的物镜通常是必要的,当使用宽视场显微镜的成像非常小的物体,如过氧化物酶体或分泌颗粒,。由于图像的大小相对于检测器尺寸起着重要的作用,在确定空间的采样频率,确定的最佳放大倍率的数字照相机系统(CCD像素的大小和中间倍率)的参数。因此,物镜的最佳选择通常取决于仪器的光学结构的,除了一个特定的实验的具体要求。

高度校正的物镜(复消色差透镜)的使用应慎重考虑,并尽量避免。色差和平整度的字段中包含的物镜的典型的光学校正透镜元件需要额外的矫正的程度的增加(例如,从萤石复消色差透镜)。每增加一个透镜,总的传输的光通过物镜减小,这进一步限制了能够到达探测器的信号的量。虽然高度校正透镜的所需的专门的应用程序,如,高signal-to-noise比(并因此是一种特别的质量图像)将更难获得,多色成像,尤其是成像时的调光器的荧光蛋白质,如HcRed或ECFP。综上所述,40x的萤石物镜的(数值孔径为1.3),优选为包含单一的荧光蛋白的成像标本,但多色实验(两个或更多的荧光蛋白),复消色差透镜进行色彩校正的目的是必要的。

多色荧光蛋白成像

全彩色调色板的荧光蛋白的发展背后的主要推理是同时跟踪两个或两个以上的细胞活动。鉴于日益增长的荧光蛋白的变种数量目前可用的(见表1),最佳配对可能不是很明显。广泛的激发和发射光谱的荧光蛋白和它们的颜色位移的遗传变异体所表现出的公司通常需要专门的设计考虑因素时,这些独特的探针同时使用两个或更多的活细胞成像实验。首要关注的是潜在的出血通过工件(实际上,从一个探针荧光外溢进入通道配置为第二个探头)从重大通常表现出的荧光蛋白组合的光谱重叠程度。

渗色(通常称为交叉串扰)可以发生在两个不同的荧光蛋白质的激发波长和发射。荧光探针检查时,发生流血通过向蓝端的频谱(波长较短)的神器,而最明显的是在较长的波长(红端)排放。绿色荧光蛋白可以作为一个例子,通常可以检测到通过红色发射滤波器,但一般不使用绿色滤波器成像红色荧光蛋白。出于这个原因,多色成像的荧光蛋白进行的最长波长的发射探头想像第一,使用的激发波长不交叉的波长更短的探针。EYFP信号例如图像EYFP和EGFP在同一单元中,使用氩离子激光,将首先收集在514纳米的谱线,超出吸收的档案EGFP,和排放聚集有530 - 550纳米带通滤波器。不是特别关键的,因为只有EYFP被激发的发射滤波器的带宽。绿色荧光蛋白成像从477纳米氩离子激光线,连同一个很窄的490至500纳米带通发射滤波器使用第二次扫描。该过滤器应正确定位,,到排除EYFP荧光,并允许特定EGFP(有点乏味的任务)的信号捕获。虽然的488纳米氩离子激光的峰值更接近的EGFP的激发最大值,它太接近到发射滤波器的带通区域,从而与图像采集的激光反射光的干扰的可能性。

fpimagingfigure5

成像两个或两个以上的荧光蛋白质时要考虑的一个重要点是带过滤器的多色成像,需要认真注意,以控制出血通过荧光发射到意想不到的渠道。然而,应该指出的是,显着限制滤波器的带宽发生在信号噪声(因为该集合带宽受到严重限制)和由于需要单独收集策略的时间分辨率为代价的。其次,专门的光学设计,往往特别是实验,通常是必需的,以达到最佳的成像条件。例如,绿色荧光蛋白变异体的黄色衍生物的存在下收集所需的专门的过滤器的组合标准的共聚焦显微镜中并不普遍。由于荧光蛋白的数量和光谱剖面变化的持续增长,需要特定的过滤器组合将相应增加。

图5中所示的一系列的同时与两个或两个以上的荧光蛋白融合到亚细胞定位的物镜转染的细胞系中拍摄的图像。图5(a)在HeLa细胞标记EYFP(核),的ECFP(高尔基),DsRed2FP(线粒体),三个探头清楚地分隔广角荧光滤波器组合用于捕捉图像(尼康CFP YFP HYQ和Cy3 HYQ)。负鼠肾上皮细胞(OK)转染绿色荧光蛋白(微管),ECFP(核),DsRed2FP(线粒体)和成像标准过滤器组合的特色在图5(b)。同样地,在图5(c)图中的兔肾细胞(RK-13 ​​行),转染EYFP(内质网),ECFP(过氧化物酶)和成像尼康CFP和YFP HYQ过滤器集。非洲水的猫鼬细胞(APM)在图5(d)所示的细胞转染绿色荧光蛋白(微管蛋白)和DsRed2FP(核),人骨肉瘤细胞(U2OS线;图5条(e)),标有相同的核探头沿与ECFP(线粒体)。最后,在图5(f)转染的幼仓鼠肾细胞(BHK细胞系)(过氧化物酶)和DsRed2FP(线粒体)与EGFP。所有精选如图5的图像被抓获使用广角荧光显微镜和尼康滤波器的优化组合适当的荧光蛋白。

虽然最亮的荧光蛋白类的绿色和黄色的(见表1),它们的光谱的极大值相隔仅由平均为20至25纳米。多色实验中使用成对的绿色和黄色荧光蛋白是可能的,但放气通过过滤器的组合之间,成为一个显着的问题。其结果是,不经常使用的绿色和黄色的组合在一起。其中最流行的双探头组合是青色和黄色荧光蛋白(ECFP和EYFP,参见图5)。尽管ECFP比EBFP更亮,其使用呈现两个优点在该ECFP被有效地激发的氩离子激光器的457纳米线,探针不容易地(如在图2中示出)的光漂白剂。

结合绿色或黄色荧光蛋白,红色荧光蛋白衍生物可以产生一个有用的,可以容易地分离与发射光谱探针配对。然而,应谨慎选择红色荧光蛋白的变种,由于成熟率差异。此外,因为DsRed的及其衍生物形成四聚体在体内预留,他们可能会产生意想不到的效果的生物学系统被调查的蛋白质(如比预期的其他细胞器聚集或本地化)。目前尚无有效的经验法则可以预测是否将红色荧光蛋白衍生物作为融合标签,一些蛋白质可能齐聚,而别人不会容忍。对于仅使用荧光蛋白(图5(a)和图5(b))相结合,青色,黄色(或绿色),DsRed的三重标记提供了一个很好的解决方案。

有几个时,必须考虑使用两个或更多的上下文中的活细胞成像的荧光蛋白的妥协。例如,与另外的要求不同的采集图像的条件下,由于每种颜色的数据采集速率减慢。寻址荧光流血通过变得越来越复杂,特别是因为发射光谱的荧光蛋白往往是相当广泛的(往往重叠)。此外,因为流行的荧光蛋白不同的相对亮度(表1),每种颜色可能需要不同的信号的积分时间。青色和蓝色荧光蛋白是相当暗淡,可能需要较长的收集期间,明亮的绿色和黄色荧光蛋白饱和。因此,重要的是平衡的实验参数(实际上,快速收集与最佳分离)与荧光蛋白的选择。例如,快速,高效的图像捕捉相结合EYFP和DsRedFP是一个不错的选择,因为这些荧光蛋白可以共享一个单一的激励设置,而ECFP和EYFP可以提供更高的光谱分离度。

成像光学荧光笔荧光蛋白

荧光笔荧光蛋白利用光学设计实验时,应考虑的几个重要方面,关于活细胞成像,显微镜配置,载体构建,和蛋白质的选择,以优化图像采集参数。这些独特的探头主要用于监测活细胞中的动态过程,这往往需要保持细胞培养显微镜舞台上长时间处于亚健康状态。各种专门的加热成像室制作舞台插入市售的长期细胞在显微镜维修,但研究者也必须考虑一些必要的辅助要求,如二氧化碳源,轻紧显微镜外壳,和振动隔离。总之,成功形象长时期的活细胞必要的实验条件下,应仔细着手与光学荧光笔蛋白实验前成立。

几个光学荧光笔荧光蛋白可以成功地使用传统的宽视场荧光显微镜技术成像,但严重的定量调查,涉及的漂白方法和光敏往往必须配备专门的激光系统的多光子共聚焦显微镜进行。具体而言,PA-GFP,PS-CFP,枫,EosFP,Dronpa所有需要近紫外或紫色的照明光活化或光转化,但成像的蛋白质所需的较长波长的光源(蓝色和绿色激发)。因此应配备的紫外或紫色激光,以及可见光激光器,发射蓝色和绿色光谱线,共聚焦显微镜。

当下最流行的激光光学荧光笔配置,虽然紫外线高能量的氩气,二极管泵浦固态二极管405纳米,488纳米氩离子,和一个543纳米的氦氖,氦镉激光可作为光敏(牢记潜在的细胞损伤工件可以用紫外线照射)。其他有用的成像激光器包括一些新的二极管和氦 - 氖模型和多光谱氪 - 氩系统。最好的多仪器配置与宽带钛蓝宝石激光器的波长范围在750纳米到1100纳米之间的可调输出。

fpimagingfigure6

在图6中示出的是光转化的PS-CFP2 使用405纳米二极管激光器的成像和转换,以及氩离子488纳米的谱线成像的和跟踪的人的β -肌动蛋白的荧光蛋白融合产物与光转换蛋白。融合构建质粒载体转染表达打成丝状肌动蛋白在活细胞成像室负鼠肾上皮细胞OK)。图6(a)示出了单电池的光转化之前,用二极管激光器成像。感兴趣的区域周围画一大截的肌动蛋白细胞骨架网络(图6(b)条;红色框),然后用40%的激光功率在405纳米照明。当二极管和氩离子激光器(图6(b)条),成像的光转换PS-CFP2融合蛋白,清晰可见的绿色荧光,对照未转化的探针(蓝色)。10分钟后(图图6(c)),光转换的肌动蛋白已经开始,并入感兴趣的区域之外的长丝,并在30分钟时(图6(2))的细胞骨架网络与光学荧光笔标记。

最有效的控制下进行的声光可调谐滤波器(AOTF),它可以很方便地用来定义圆形,椭圆形,矩形或手绘选择照射照明光转换和光活化过程中的具体区域的划分标本。AOTF还可以进行微调激光功率水平调节强度试样,并能够使用的技术被称为高速通道切换或multitracking的顺序扫描标本这种方法使排放的顺序激发和收集一些荧光探针,以避免出血,通过文物,更准确地单独的发射光谱。

定义地区的广角镜的兴趣,提出了更大的挑战。研究级显微镜通常配备照亮选定区域中的试样,可以进行调整的可变光圈,虽然用少得多的精度比共聚焦显微镜的声光可调谐滤波器的系统。广角仪器也必须配置专门的荧光滤光片组合以图像的几个光学荧光笔蛋白。相比之下,共聚焦和多仪器更适合定量分析细胞动力学,利用光电转换和光活化技术比宽视场显微镜,因此应为这些应用的首选。

产生足够高的荧光信号电平为最佳的图像采集也是使用光学荧光笔时要考虑的一个重要因素。在这方面,可以采用的吸收摩尔消光系数和荧光量子产率的值的本机和光转换蛋白物种,以此来衡量,以确定相对的亮度水平。例如,枫和mEosFP都具有相似的光谱带宽配置的可见光光谱中的绿色(母语)和红色(光转换)地区。然而,枫的固有绿色形式大约有绿色mEosFP由于到一个更高的消光系数和量子产率的荧光发射强度或亮度电平的两倍。因此,在光电转换之前,成像信号 - 噪声比枫远高于mEosFP。光电转换后,这两种蛋白具有类似的亮度水平(见表1),并产生媲美的图像。

在当前可用的光荧光笔蛋白,Dronpa,枫,mEosFP的是最亮的,其次是PA-GFP,在亮度电平的光转换枫物种类似,但显着低于天然蛋白。市售的PS-CFP2变种是大约一个半光亮如枫,而火种和PS-CFP蛋白质,无论是在本土和光转换形式,是迄今最暗的光荧光笔,收益率只有约25%的亮度电平表现出的光转换的枫(表1)。后者荧光笔生物物镜具有低丰度的水平,或需要高成像速度的调查计划时,应考虑的一个因素,在成像过程中,表现出显着较低的信号信噪比。

结论

荧光蛋白成像工具,目前的电池使的细胞生物学家随时监控在活细胞中蛋白质动力学,蛋白质,细胞器和细胞的行为提供了许多新的见解。这样做,这些显着的探头已经迎来稳态和动力学显微技术可以用来破译途径和机制的生物过程在细胞生物学的新时代。再加上突飞猛进的发展中的活细胞成像显微镜系统,包括微光电子倍增CCD相机,旋转盘共聚焦仪器,狭缝扫描显微镜,舞台设置在整个可见光的荧光蛋白成像和光学荧光笔和近红外光谱区的与近实时精度。