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奥林巴斯显微镜:荧光显微镜摄影的错误

2013-10-16  发布者:admin 

显微摄影在荧光照明条件下,提出了一套独特冒充显微镜的特殊问题的情况。曝光时间往往是非常长的(在某些情况下运行多少秒到几分钟),试样的荧光可能会在曝光过程中褪色,全黑的背景往往在不经意间光信号米建议过度曝光。

fluorescenceheader

此外,荧光的标本发出他们自己的光,和颗粒位于所需的焦点平面的上方和下方往往辐射光造成图像细节模糊。尽管荧光图像可能会显得明亮时,通过显微镜目镜(由于人眼对光线的敏感度的精致),它们通常需要较长的曝光时间,以注册令人满意的图像,在胶片上。很长的风险,复杂的显微摄影与荧光染料染色的标本增加振动和电影互惠故障影响,造成不良的颜色变化,在图像的可能性。

虽然荧光显微照相术的基本问题,通常是到达胶片的光很少,也有一些可以采取的步骤,以提高图像质量。用于荧光显微镜的物镜应该具有尽可能高的数值孔径,实验中采用的波长的光具有高透射率。由于光强度(反射光的荧光)的数值孔径的四次方变化,这些目标可以显着减少曝光时间在反射光中的荧光显微镜。光照强度也放大倍率的平方成反比,导致总放大倍数在胶片上保持到最低限度时,明亮的图像。减少在膜平面上的倍率通常的低倍率照相目镜的(或投影透镜)的协助下使用。此外,当使用一个三目头时,通常是可取的相机转移所有的光,而不是有观看目镜和相机之间的光分裂(通过一个分束器)。由于图像强度胶片平面的距离的平方成反比,显微镜有更好的表现,那么这个距离尽量短。出于这个原因,由于广泛可用的,大多数荧光显微镜被记录在35毫米的薄膜(而不是更大的格式),当使用传统的显微摄影来捕捉图像。现代低噪声温度控制CCD的数码相机正越来越多地用于取代胶片作为介质的首选荧光显微摄影。

低光照水平和荧光样品的褪色是两个的主要困难需要克服的荧光显微照相。通常情况下,动态荧光制剂性质使得良好的显微摄影必不可少的捕捉与样品发生的事件的记录,往往可以揭示细节不明显检查时通过目镜观察标本。长时间曝光,所以常用于荧光,必然导致标本的荧光强度在长时间照射互惠失败和衰落。事实上,衰落特异性荧光特性往往是速度比背景,从而导致图像的对比度的损失。

reciprocity

遭受称为倒易律失效的效果当超过或长或短的时间内暴露在光线下时,所有的感光乳剂(包括黑白,彩色负片,彩色透明胶片)。倒易律涉及图像的曝光时间和光强度的密度,使得存在在显微镜的照明强度之间的相互关系和膜所需的曝光时间。实际上,法律规定的曝光时间,以维持一个恒定的膜密度光强度成反比。光的强度较低,所需的曝光时间越长须交出了一份令人满意的图像。这种反向关系成立,对于大多数膜,如果适当的曝光时间是1/500之间的第二个和1/2秒。

在荧光显微镜,常规要求低光水平超过1/2秒(通常从几秒到几分钟不等)的风险。互易关系不再持有在这些条件下,膜将需要额外的曝光时间,以得到合适的图像密度。这种现象被称为互易律失效,一个术语,它仅表示曝光时间和光强度之间的线性关系不再成立,并不表明薄膜乳液在性能方面的故障。

倒易律失效的一个副作用是,本已疲弱的样品荧光进一步减少通过漂白的标本,和不正确的色彩再现,经常出现由于为增加曝光时间。图2中的图像是该系列的荧光显微照片,示出抗体荧光标记与当前流行的试剂,荧光素-5 - 异硫氰酸酯(FITC)时,成像的使用奥林巴斯WIB长通荧光立方体。的中心(图2(b))中的单元格被拍到使用校正后的曝光时间调整为倒易律失效和柯达雷登颜色补偿滤波器,以除去不希望的色移。在左侧(图图2(a)),在同一视场显示光漂白或褪色,由于长期暴露在照明源的荧光活性的影响。图2(c)中的颜色变化和缩小图像的强度,从而从倒易律失效是显而易见的。

互易律失效,通常可以简单地通过黑白胶片的曝光时间或加工条件中增加补偿,但是这并不总是与彩色负性和透明度薄膜的情况下。大多数彩色胶片有三种颜色敏感的染料层,其中每一个有一个稍微不同的特性曲线的位置和斜率在不同的反应中得到的互易效应可能造成不希望的颜色的变化或管型。通常情况下,暴露时间和色彩平衡过滤器使用彩色胶片时,必须进行调整,以补偿很长或短的风险。

利用一个物镜的,具有一个非常小的数值孔径(例如,40倍的物镜NA = 0.65,相对于相同的放大倍率的物镜具有一个数值孔径(NA)为0.85,0.95,或1.0)产生一个图像显示的亮度不足,因而延长的曝光时间。数值孔径是一个客观的集光能力的措施,这意味着高数值孔径物镜可以捕捉更大数额的生色团所产生的微弱的荧光发射。做荧光显微摄影时,务必使用可用的最高物镜的数值孔径。使用过度的目标和照相目镜倍率也将导致亮度降低。为了弥补这一点,总是采用尽可能最低的倍率照相目镜的和最高的数值孔径物镜,在一个给定的倍率。例如,一个60倍俯视复消色差透镜物镜具有的数值孔径为0.95(亮度指数= 22.6),优选的数值孔径等于0.85(亮度指数= 14.5),即使工作距离的萤石物镜是一个60X平场萤石物镜的两倍,复消色差透镜。此外,由于高数值孔径的物镜的景深较浅的,它们的使用可能避免对比从上方或下方的焦点平面减少聚焦排放的影响。同样的,一个的2.5倍照相将提供更多的照度大于3.3倍或5倍的目镜。激光扫描共聚焦显微镜是专为从根本上消除了聚焦光,并给予更清晰的荧光图像分辨率稍好。

物镜亮度值
物镜放大倍数 数值孔径
(NA)
物镜亮度指数
10 0.25 3.9
10 0.30 8.1
10 0.45 41.0
10 0.50 62.5
20 0.40 6.4
20 0.50 15.6
20 0.75 79.1
40 0.65 11.1
40 0.75 19.8
40 0.95 50.9
40 1.00 62.5
40 1.30 178.5
60 0.85 14.5
60 0.95 22.6
60 1.40 106.7
100 1.25 24.4
100 1.40 38.4
表1

如细胞生物学和医学诊断领域中的典型的荧光应用不仅关注的试样的亮度,而且具体试样的荧光的特性的背景荧光的比值。单分子荧光事件和其他低光实验自发荧光和/或内部反映内部物镜的能力产生巨大的差异,图像小的结构与荧光量子产率较低,这一点尤为重要。为了最大限度地提高在设计用于荧光显微镜的物镜的信号 - 噪声比(试样的荧光强度高于背景),制造商使用石英等特种玻璃的配方中具有高的透射率从红外到紫外的整个频谱。这些物镜是非常低的自发荧光,利用特殊的光学水泥和防反射涂层,旨在通过荧光激发波长的扩展范围。更高的数值孔径耦合到先进的玻璃配方,提供现代化的荧光物镜的能力的波长处激发标本下降到340纳米的光具有更高的传输值,以获得更明亮的荧光图像。

共同的放大倍率及数值孔径的的名义物镜亮度值的比较示于表1。这些数值是根据下列公式计算

亮度指数=(NA)4 /(放大率)2 ×传动比

其中,NA是物镜的数值孔径和传动比被推定为100000。从这个等式中,很明显,对于相同的放大倍率,图像亮度的照明场和次级荧光随物镜的数值孔径,而且随着放大倍数的增加而减小。尽可能从标称值的5-10%的实际数值孔径为一个特定的物镜和放大倍率值可能会有所不同。如上所讨论的,是由物镜发送的面板亮度,也依赖的内部结构参数,如玻璃透镜元件,内部反射和眩光,和镜片涂料的数量。通常,它是要牺牲比较高的复消色差透镜物镜增强后的图像显示的亮度更高的数值孔径的萤石物镜订单中的校正色差的光学矫正。

使用高数值孔径聚光镜尽可能透射光荧光,以避免光损失和随附长的曝光时间。此外,当使用旧显微镜台下镜,购买有一面镜子,镀铝表面,而不是一个镀银镜(银会反射紫外线光很差)。通常情况下,暗视野聚光油浸可以被取代的标准明场冷凝器发送荧光应用。当使用浸油,适用于非荧光的油状物之间的顶部的聚光镜和底部的显微镜载片上透镜和物镜前透镜和盖玻片之间。这种类型的油都是现成的从商业厂商数量。

漂白,或染料的光解,迅速 ​​降低荧光探针用于染色标本和编制暴露最低照度水平是可能的,应尽量减少。这种效应是由于主要是由光动力之间的荧光染料和氧的相互作用,其中涉及促进从单线基态,称为系间窜越的处理相对长寿命三重激发态的染料分子一旦已经被提升到激发态的发色团,它变得更加化学反应,并可能参与不可逆的化学反应,包括分解,聚合,氧化(主要由单重态氧)或与另一个分子反应。与氧气的反应通常会导致漂白发色团,这取决于细胞内的单线态氧的浓度和其他内部的细胞成分,如蛋白质,脂质,或小分子的生色团接近。计算表明,可以产生单线态氧以上的距离超过500埃生色团的光解。

combinedphase

光漂白的影响减到最小,荧光显微镜,可结合其他技术,都是非破坏性的荧光染料,如微分干涉相差(DIC)的,霍夫曼调制对比度(HMC),传送暗场照明,相位相反的。我们的想法是找到感兴趣的特定区域的样品中的非破坏性的对比度增强技术,然后,不不确定试样的情况下,切换显微镜荧光模式。这种类型的一个典型的实验的结果示于图3和4中。图3(a)示出了使用相位对比光学成像的3T3成纤维细胞的单层组织培养。细胞行成立由美国国立卫生行瑞士小鼠胚胎细胞,这是高度接触抑制和有用的研究,涉及形成肉瘤病毒和白血病病毒传播。的显微照片,图3(b)显示了相同的视场,但是这一次成像,使用荧光照明(汞蒸气灯和一个奥林巴斯吴过滤器立方体)的细胞染色的荧光染料4',6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚(DAPI ),具有最大发射波长在461纳米,这是用来选择性地染色细胞核和染色质的核酸特异性染料。图3(c)示出这两种技术的组合使用,以产生荧光染3T3细胞核的成纤维细胞的细胞膜和细胞器内部的相位对比度的图像叠加在一个美丽的显微照片。此图片是记录一个专门的萤石物镜相环的设计允许同时观察荧光和相衬的物镜是一致的。

dicfluorescence

又如各种技术的综合,使用微分干涉相差(DIC)的这段时间,如图4所示。(a)是图4中所示的薄边的隐球菌感染的猫的脑组织,想像使用DIC的光学和一个全波的相位差板。注意伪三维外观的显微照片。图4(b)示出相同的视场,但成像荧光照明和一个奥林巴斯WIB过滤器立方体。图4(b)中的细胞进行染色与荧光素-5 - 异硫氰酸酯(FITC)和刚果红(发射波长分别为520和614纳米,最大值)的组合。这两种技术的结合使用,以产生图4(c),它示出了感染的猫的脑组织中的荧光和DIC照明。

光漂白的速度取决于几个因素,包括发色团的化学反应性,细胞内的化学环境,和激发光的强度和波长。一些荧光染料易于漂白,而有些则是相对不敏感,稳定更长的时间。在许多情况下,试样可以恢复的漂白效果,尤其是当它是保持凉爽,在黑暗的环境。漂白应区别于另一个荧光工件称为淬火,发生了竞争过程,如高温,高氧气浓度的盐或卤素化合物的存在下,分子聚集的荧光强度的降低(或在某些情况下,增强)。有时身体的能量转移到其他受体分子居住的淬火结果激发荧光染料,这种现象被称为共振能量转移。这种特殊的现象已成为一个较新的技术,测量距离远低于在光学显微镜的横向分辨率的基础。生色团中的杂质也可能降低荧光强度由漂白或淬火。

fading

漂白可以最小化通过减少曝光时间(如上文所讨论),或通过降低能量的激发(灯的亮度),但这些补救措施都伴随着的不良影响减少了发色基团的荧光发射能量。中性密度过滤器可以被放置在光路中,光到达之前激发光滤光片,从而减少激发光的强度,并减少试样的观察过程中的衰落的影响。许多荧光显微镜都配有一个快门系统耦合到中性密度滤光片,使激发光强度降低观察和标本操纵期间,但使显微镜可以轻松地切换到全功率照明显微摄影。这也有利于在可能的情况下,去氧标本(但不是活细胞或组织),如Ñ酸丙酯和其他市售的抑制剂,其为使用特定的抗淬灭试剂能淬灭单线态氧的化学品也可以减少漂白的效果。的例子是2 -巯基乙胺,1,4 -二氮杂双环-2,2,2 -辛烷(DABCO),diphenylisobenzofuran,p -苯二胺的,和氨基酸的组氨酸。衰落的影响也可以被降低,在某些情况下,通过改变安装介质的pH浓度。

图5(a)示出了几种市售的抗淬灭试剂的荧光衰落抑制率。蓝色曲线显示未处理样品荧光强度迅速下降,而红色和绿色的曲线表明抗淬灭试剂略有不同效率的衰减率减少。标本是有袋类肾组织培养细胞(PTK2)与任一荧光素-5 -异硫氰酸酯(FITC)或罗丹明鬼笔环肽(两种染料具有类似的衰落特性)染色。抗淬灭试剂分别为p -苯二胺(绿色曲线)或n -丙基没食子儿茶素没食子酸酯(红色曲线)。试样二次荧光衰减率通常取决于使用荧光染料的不同而不同,即使在相同的条件下观察。为特定的应用提供具有最低的衰落速度选择荧光染料,可以通过以下方式获得了最好的结果。这个概念示于图5(b)三种荧光染料若丹明(黄色曲线)的花青染料Cy3(红色曲线),FITC(绿色曲线),其中比较有袋类肾细胞衰落速度的差异若丹明,一个无处不在的染料有许多应用程序,显示一个非常缓慢的的褪色速率(图5(b),黄色曲线)在这些条件下是最好的荧光染料在使用本系统的显微摄影。

为进一步减少衰落,最好是在一个领域内的试样进行初步观察,然后快速移动到“新鲜”字段以曝光之前。这种做法可能会有助于规避漂白和/或褪色效果。这也有利于做到既在部分黑暗的房间环境的观察和显微摄影。虽然化学方法和细致的显微镜可以减少漂白,最有效的补救措施是提高检测灵敏度(加上激发能量减少)使用微光CCD数码相机专为荧光显微镜。

漂白的发生,导致被称为FRAP,这是一个缩写,漂白后荧光恢复的技术这种技术是基于激光短脉冲串和随后的恢复引起的荧光染料扩散到漂白区域的荧光观察漂白时。

filter errors

阻挡过滤器的设计,吸收特定波长的激发辐射的反射或传输,试样,​​并且只发送选择的可见光荧光。屏障过滤器的截止波长范围内是至关重要的,因为在许多情况下,它必须能够发送不远处值用来照亮试样的激发光的可见光的波长。因为膜是非常敏感的紫外和可见光波长在380-450纳米的区域,它是特别重要的屏障过滤器阻止在此范围内的所有不想要的波长。更短的波长,以保证除去额外的紫外线阻断过滤器,如柯达雷登过滤器数字2A,2B或2E,应加入的光学路径。所有这些滤波器完全吸收紫外线,但其较低的波长可见的蓝色光的吸收有少许差别。补充紫外线过滤器的主要屏障过滤器之前,应放置在光路中,以阻止辐射可能诱发自体荧光的主要屏障过滤器,特别是如果这种过滤器是黄色,橙色或红色。如果阻挡过滤器切断的频谱在太长的波长,试样的荧光颜色将受到影响,并可能会受到影响,尤其是当只有通过过滤器的长波长部分的透射荧光图像的光线强度。

荧光显微摄影的色彩平衡中的错误,可能有许多的起源。图6中的显微照片示出了一些问题时,从自体荧光和不正确的过滤过程中出现的颜色退化的荧光照明下的成像标本。样品是单层成纤维细胞在组织培养中生长和彩色与7 - 氨基-4 - 甲基香豆素-3 - 乙酸(AMCA),明亮的紫外线兴奋的染料共轭体的发光波长为445纳米的最大(在短期波长蓝色区域)。AMCA的最佳激发波长为345纳米的,这需要通过一个显着量的紫外光的激发滤光片。在适当条件下的照明和过滤,出现染色标本染色细胞核和细胞质部分丰富的和深蓝色的颜色(用Olympus吴滤波器的多维数据集的成像),图6(b)所示。当太多的紫外线光通过的屏障过滤器被使用时,一个蓝色的演员和背景颜色经常是存在的试样(图图6(a)所示),次级荧光颜色的显微照片中的退化。配售辅助紫外线和/或短的蓝色波长屏障过滤器,在显微镜的光学路径的某处,是缓解这一问题的首选方法。

用荧光染料染色的标本往往会产生不希望的量,特别是短波长的蓝色自体荧光染色组织切片。正如上文所述,该自体荧光必须被吸收的屏障过滤器,以避免二次荧光发射的荧光染料标记的试样所产生的降解。柯达雷登滤波器2A和2E,吸收短波长的蓝色辐射,是适于在本申请中使用。显微镜制造商和售后市场供应商也提供微调截止屏障过滤器的过滤器非常有用。

安装媒体的内在的自体荧光,也可引起不同的问题与图6(a)中所示的显微照片。许多流行的永久安装的培养基配方表现出不希望的副作用的自体荧光,并且不应该被用于荧光定量工作。相反,临时装片用纯甘油,甘油 - 水混合物,或无荧光浸泡的油被用来制作标本。显微镜制造商提供专业的光学矫正的目标,这些目标的标本观察甘油。自体荧光产生的安装媒体通常为淡蓝色或绿色,并会导致退化的二次荧光标本。如果屏障过滤器不会删除多余的安装媒体所产生的自发荧光,有时柯达雷登色彩补偿滤镜可以添加的途径来缓解这一问题。(黄色)CC20Y通过使用一个过滤器,例如,可以除去大多数媒体所产生的淡蓝色和淡绿色荧光可以与CC20M(品红)滤波器中。使用更高密度的过滤器(CC30及以上),往往会导致二次荧光吸收。

自体荧光的细胞和组织文化展出往往能限制的能力来检测荧光探针在染色和固定制剂。固定的组织所显示的自体荧光的程度往往会有所不同,这取决于样品制备和使用的实验条件下检测荧光。黄素辅酶(FAD和FMN)和减少吡啶核苷酸(NADH)在哺乳动物细胞中的自体荧光的主要来源。二次荧光荧光染色植物细胞往往掩盖了自发荧光木质素(绿色自发荧光),如叶绿素(红色自发荧光)和卟啉。有时可以克服这个问题可以与固定的细胞和组织的0.1%的溶液与硼氢化钠的磷酸盐缓冲生理盐水30分钟染色前彻底清洗。

当用于染色标本的发色团的波长的吸收和发射光谱的激发和/或发射波长的滤光片不匹配,则次级荧光通常会受到影响,如在图6(c)所示。在此示例中,一个不正确的发射具有过短的波长截止滤波器被用来传递由样品发​​出的荧光二次。因为大多数的这种荧光的光谱在蓝色区域(455纳米)为中心,只有泥泞的红长波长的色调通过过滤器。要更正此问题,一个新的障碍,应选择过滤器。彩色胶片曝光过度,可以沿着互惠的错误,也会造成最终图像中的二次荧光显着的颜色变化。

contrast errors

对比度错误经常出现配置错误或错误的过滤器组合使用时,在荧光显微镜,光学显微镜火车。这些错误的几个在图7中,这说明所造成的的激发滤光片不当选择和荧光浸油二次荧光图像的对比度差。标本是一个横截面的日本枫树叶柄使用奥林巴斯全身振动过滤立方体一个的萤石10倍目标进行自体荧光成像。在理想的条件下,在图7(b)中呈现的图像,将通过以下方式获得。然而,当激发光滤光片有太大的带宽(允许不需要的波长通过),图像失去的对比结果在图7中所示的显微照片(一)。选择正确的过滤器的组合,需要了解的发色团(次)用于染色试样的激发和发射光谱的值。在这种情况下,激发光滤光片通过波长550纳米,由试样发出的荧光,并严重地影响图像的对比度与绿色二级干扰。

控制在荧光显微镜标本的对比需要,所有光学元件的自体荧光的显微镜,他们不应该显着程度的​​散射光。这包括内部的玻璃镜片,镜,过滤器,和分光镜。目标应提供高的图像质量,同时高效率地传输光下降到近紫外范围内。过滤器必须发送所需的波长,同时阻止其他可能会干扰观察二次荧光。因为激发光比样品荧光强度大得多,完全消除这种光的荧光图像的任务是不是很容易,需要仔细选择激发波长范围窄(通常为10至75纳米的过滤器组合提供带宽)。当使用高数值孔径的浸没目标时,至关重要的是,浸油污染物,可能会表现出荧光。图7(c)举例说明了自体荧光浸油产生的对比度差。尽管浸油的使用有助于提高图像的亮度,部分地通过消除不确定的光的损失所造成的反射表面(特别是,盖玻片和玻璃透镜元件),荧光诱导自体荧光的混合不需要的波长的污染物,与从二次荧光标本。这有增亮的同时,降低了图像的对比度,这两者都是不希望的背景的不幸结果。

文物在样品制备,也将产生对比的问题,在荧光显微镜。早期的先驱荧光常常利用非特异性的荧光染料,由于这样的事实,染料分子被随机地分布在整个试样的非常明亮的图像。新的改进和高度特异性的荧光染料的荧光技术已导致染色的目标地区,具有明显弱于荧光染料结合少得多,因为标本展出。这些新的方法,需要更仔细的样品制备,以避免不必要的荧光文物。染色前部的非荧光染料中的检体竞争结合位点的选择性荧光染料,以帮助它往往是有帮助的。标本应彻底清洗,除去未结合的荧光,放置在酸前清洗玻璃非荧光显微镜载玻片。通过加入化学添加剂,以减少光漂白的荧光染料的环境中优化有助于减少或消除试样衰落。此外,重要的是仔细选择安装介质的化学成分和pH值,以获得最佳的图片,次级荧光。也应该是无荧光的盖玻片和浸油,如上所述。

自体荧光和/或试件的固有特性的结果,或通过染色中的错误可能会发生非特异性荧光。典型的这种类型的错误在图8(a)中示出,其示出了大鼠结肠组织染色的薄截面的混合物的荧光素-5 - 异硫氰酸酯(FITC)和4',6 - 二脒-2 - 苯基吲哚(DAPI) 。在显微照片的整体偏蓝是由于自体荧光和非特异性荧光的组合,由于与DAPI荧光染料overstaining。适当的两种染料染色,然后彻底洗涤后的试样的结果列于图8(b)的显微照片。类似于图8(a)中所示的错误所造成的使用太广泛的激发带宽,可以得到纠正,有较窄的带宽的使用的过滤器的一个可逆的错误。另外,激发滤光片的组合可以有选择地产生一组特定的波长,或屏障过滤器可以进行调整,以通过只有较长的波长。图8(c)显示大鼠结肠薄切片染色时正常,但现在缺乏一个红色在光学通路抑制滤波器引起的淡红色背景。这个错误可以被放置在光路中的适当的抑制滤波器校正。

auto fluorescence

荧光显微摄影还患有其他形式的光学显微术和显微摄影遇到的常见问题。这些措施包括光学和胶片平面,显微镜立场振动,灰尘和碎片的污染,曝光不足,曝光过度,色彩平衡错误,镜面反射(常见的长时间曝光和架空室内照明)之间的焦距调整不当引起的聚焦误差,渐晕,和光学显微镜误配准。这些错误的例子在我们的一节题为“ 荧光显微摄影与彩色投影胶片的错误,显微摄影节的奥林巴斯显微镜资源中心显微镜底漆

荧光显微摄影的相机和胶卷 -薄膜技术的改进提高胶片的速度和分辨率的改善,但也有没有彩色胶片目前唯一适用于荧光显微摄影。单独的彩色胶片的特定属性,包括单独的乳剂层的特性曲线属性耦合的染料,和用于荧光激发和发射的光的光谱响应往往相差很大,从膜膜,有时很难控制和再现。这些问题导致难以维持准确的色彩渲染和曝光使用胶片的彩色显微摄影。

是复杂的荧光的标本的亮度范围内的事实,通常远远大于可准确地记录在胶片曝光测量的荧光显微照相。过分的亮点,将导致失去精致的细节和色彩饱和度,曝光不足而产生很暗的图像不显示功能,隐藏在阴影区域。要么过度或曝光不足的背景下,这通常是非常暗色或黑色的,不作为关键。三种主要方法被利用​​,以确定曝光时,使用荧光性:亮度测量的CCD,光电二极管或光电倍增管,在曝光过程中连续测量(光电倍增管),和最不理想的方法,试验和错误。设计用于荧光的的现代显微摄影系统的设施的能力来衡量的照明强度,并计算基于该读取的曝光时间。对于常规荧光显微摄影,有些相机有决定曝光时间硅蓝色探测器的细胞,而另一些光电倍增管计量探测器测量极其微弱的标本。

涂膜性能
ISO号码
灵敏度
决议 晶粒
尺寸
曝光
宽容
25-50
100-200
400 +
表2

重要的是要考虑几个因素,在选择的检测器系统用于荧光显微摄影。这些包括检测器的噪声电平的信号与噪声之比的图像,空间和时间分辨率,几何失真,线性度,和光谱灵敏度。在确定正确的曝光荧光标本,最好是使用相机的CCD或光电倍增测光系统,能够精确的低光测量。点测光的能力是有价值的实际测量面积的荧光,没有不想要的测光通常黑暗的背景包围的荧光的材料。另一种技术涉及到使用的曝光调节控制,以减少曝光时间,否则将被过分延长测量的视场的黑暗背景。在这方面,奥林巴斯和尼康相机有内置的算法,减少暴露,如果将相机设置为荧光模式。当光线不足的(通常大部分的时间用荧光),设置发送所有的光三目棱镜膜面减少曝光时间。

在理想的情况下,点测光应包括显微摄影系统,以帮助确定曝光时只有几个明亮的物体是可见的,否则黑暗的背景上。在整个视场对于集成光测量的,没有点测光,曝光时间应削减一半或计量读数的四分之一(在一个黑暗的背景上分散的荧光物体),暗视野显微镜的情况很像。如果点测光的光传感器是在一个固定的位置的视在中间,试样必须首先被移动到视野中心,以获得合适的曝光测量的区域,然后移往组成的显微照片。高端相机系统允许翻译点测光传感器,使显微镜曝光测量前确定显微照片组成。定位后的试样进行显微摄影,点测光传感器可以被移动到最亮的区域曝光测量的视场中,不影响试样。当使用点测光,使​​荧光物体一定是大到足以填补当场记录准确的曝光读数。

一些显微摄影的摄像系统提供一个永久的上演的光的一部分的分束器组件,光度计,它允许在实际曝光过程中的光测量,以补偿衰落。这是一个方便的方法来调整曝光时间,以避免光漂白工件的飞,但它的缺点下减少向膜的光强度,因此需要更长的曝光时间。更先进的计算机辅助摄像系统能够方便地存储在计费系统的存储器中的预编程的查找表,以补偿通过互易律失效和衰落。倒易律失效的相机系统电脑自动修正工作将根据以下公式来计算曝光

Tc = (Tm)p

Tc是校正后的曝光时间,T m是计量时间(未校正), p是从安置在系统的查找表的单个膜的互易值确定的常数。此系统是有限的数量和类型,计费系统的初始编程过程中被添加到查找表膜的互惠数据。

没有的整体测光系统,确定曝光时间必须由试错。此方法涉及在不同的曝光时间,通过加强递增一个半到一个完整的f制光圈(包围)的一系列的试验曝光。处理后的电影,曝光,产生最好的结果仔细说明,并提供进一步的显微摄影使用相同的显微镜配置的基础。标本的照明或显微镜设置的更改将需要另一系列的曝光括号来确定新的最佳曝光时间。如果只的物镜放大倍率改变时,新的曝光时间,可以计算出与先前记录的括号数据。许多显微摄影做荧光显微镜支架的风险,无论是过去,由三个或更多的时间间隔下,做出一定的,他们将争取在一个正确的曝光设置。保持良好的书面记录曝光及相关设备的数据可以减少或消除需要未来的包围。决定曝光时使用的试验和错误的方法,它是明智的连续监测显微镜灯泡输出偏差照明灯老化发生。使用这种方法确定曝光的显微镜往往依赖于单反相机拍摄以荧光照明。有了这些相机在曝光过程中快门和取景镜,运动可能会引起振动,导致不清晰的图像。此问题通常可以通过使用遥控快门开关和/或提高反射镜前曝光规避。在某些相机,自拍定时器操作的发行的反射镜,它允许振动停止曝光之前的时间。

显微镜配备专门为荧光照明往往有在系统或照明系统的分划板调焦望远镜,使显微镜可视化显微照相光栅叠加在隐约可见标本靠住一个非常黑暗的背景。奥林巴斯和尼康都在他们的高端显微镜,提供了选择的十字线和电影帧颜色查看标本提供光罩。显微镜可以选择红色或黄色的照明分划板。红色的光环维持观察者的眼睛的暗适应具有的优点,在蓝色和绿色的二次荧光观察时,提供了极好的对比度。对于红色荧光并同时相衬或DIC时,应选择黄色标线片,以最大限度地提高对比度。一些制造商提供了一个与照明取景光罩,调焦望远镜自动相机外壳的重视,并允许在黑暗背景场的拍框尺寸观看。

当选择膜荧光显微摄影,电影速度(ASA或ISO等级)是一个变量,应慎重考虑。ISO等级越高,在其他条件相同的情况下,要登记在胶片上获得满意的图像的光量越少。荧光显微镜中使用的照明光源需要日光平衡的胶片乳剂准确地呈现标本二次荧光颜色。大多数主要的电影制造商提供了广泛的日光片在不同的ISO评级透明度和彩色负片格式。柯达日光EKTACHROME柯达克罗姆ISO 200或400或200,都在35毫米大小,正面的透明薄膜,显示足够的速度,良好的色彩还原和接受的解决办法。提供FUJICHROME PROVIA在400和1600的ISO等级,是一个极好的透明胶片的色彩饱和度和分辨率方面。其他厂家做比较透明胶片,但我们建议避免使用彩色负片,如果在所有可能的。

对于黑白胶片,柯达提供了T-MAX 400,中粒膜,这是一个最好的荧光应用的一个很好的罚款。一些黑白胶片标准彩色负片化学品(C41)可以处理。其中包括T-MAX 400CN,柯达KODAK ADVANTIX和Ilford XP-2超级,提供所有这一切都是在ISO 400的评级。请记住,更快的膜允许更短的曝光时间的增加晶粒尺寸在牺牲。表2列出了基本的膜的性能,以供参考。

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相比之下,在荧光显微摄影的最关心的问题之一,不仅依赖于显微镜的配置,而且还取决于所选择的膜的物理特性,由荧光染料的发展过程中,曝光的详细信息,以及检体本身相对于染色的效率漂白或褪色。颜色透明薄膜可以由一个或几个光圈值(奖金考虑互惠褪色时)曝光不足,然后处理在第一显影剂增加对比度和色彩饱和度的处理时间延长。许多黑白胶片可以产生相反的变化,依赖于开发混合条件和处理时间。膜荧光显微摄影决议确定主要由光学显微镜(主要是物镜的数值孔径),以及它是如何配置的参数,但也有点依赖电影的特点和发展方式。然而在实践中,电影的分辨率只有成为一个因素显微镜时没有表现最佳的ISO感光度是如此之高,粮食成为一个因素。

数字成像技术的最新进展,已经彻底改变了捕获使用电荷耦合器件(CCD)的显微照片。当成像乘荧光染色标本,数码相机提供了一个很好的解决方案,并正在迅速成为许多photomicrographers的首选媒体。三芯片集成彩色CCD摄像机的价格已经下降到一个合理的范围,并耦合到的帧接收器或数字视频卡和计算机时,提供了一个极好的方法,收集,进行数字化处理,编辑,存储荧光图像。

很多标本必须显示弱荧光高性能CCD探测器规格。目前,最好的选择是背照式的框架或隔行传输设备,它配备了散热片和/或外部冷却水库。这些相机有很多的量子效率接近或超过90%,并允许多个图像读出之前的连续收购。从一到五秒钟运行的图像采集周期,根据读出速率,视频采集参数,CCD分辨率。符合这些规范的一个典型的CCD相机是的光电子 MagnaFire数字成像摄像系统专为科学应用程序。该相机具有3英寸SONY ICX085AL隔行传输CCD数组的大小为1300×1030像素尺寸为6.7微米(平方米)。60分贝动态范围的信号-噪声比,文件的位深度为24,32或48位颜色,每个像素/秒的有16000电子阱的深度的4个电子的暗电流,并增强了相机的性能密封气体珀尔帖CCD冷却。彩色图像的形成是通过多个光学玻璃分色彩色滤光片。达等厂商也提供了广泛的适用于几乎每一个需要荧光和常规光学显微镜的数码相机(如图9所示),一个典型的CCD相机。

以下几点总结荧光显微摄影的重要方面。

  • 使用高数值孔径物镜配备近紫外光是透明的玻璃或石英透镜。另外,用最低的放大投影镜头成为可能,以限制总的放大倍率。
  • 透射光的荧光反射光荧光首选。如果这是不可能配置的反射光显微镜,使用透射光的暗视野冷凝器。
  • 优化通过仔细选择膜参数,配置适当的显微镜标本的对比,并通过精心选配生色激发适当的激励和阻隔过滤器和二次荧光性能。
  • 从光路取出三目分束器的棱镜,在曝光过程中,使100%的光到达胶片平面。还可以使用35毫米胶片,避免更大的电影格式。
  • 选择日光平衡透明度薄膜试样颜色,​​分辨率和对比度的最佳演绎。推过程的透明度薄膜增强对比度和色彩饱和度。
  • 光源必须提供高强度辐射的频谱很窄的范围内,一般在10和50纳米。最好的选择是氙气和汞蒸气灯或调谐到特定波长的激光。
  • 显微镜的光学列车,包括透镜,反射镜,过滤器,分光镜,浸泡媒体,显微镜载玻片和盖玻片,应该是免费autofluorescing组件。
  • 如果不观看或摄影荧光标本,阻止激发光漂白,使用过滤器的滑块或快门照明避免试件破坏。
  • 总是提供一个热过滤器之间的照明器和荧光过滤器,这可能是多余的热量损坏。
  • 监控灯闪烁的迹象,并更换时,光照强度变得不均匀。保持适当的科勒照明灯和垂直调整照明。
  • 仔细准备标本染色后彻底清洗并去除多余的发色团。

总之,荧光显微镜领域正在迅速扩大,在许多医学和生物学研究实验室。荧光显微镜的主流已经经历了一个几乎完全转变,从利用透射光入射光,伴随着许多新的和不同的荧光染料通过引入。这已经促使许多新的和多样化的荧光显微镜应用的动力。



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