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奥林巴斯显微镜:光学荧光笔荧光蛋白

2013-10-16  发布者:admin 

荧光蛋白的发现和后续优化中的遗传性质的这些显着的探针来生成各种各样的发射带宽配置已扩展​​生物学家在活细胞中具有高时空分辨率的可视化,跟踪和量化分子事件的能力。荧光蛋白可以融合到几乎任何感兴趣的蛋白质或酶,礁珊瑚,水母和海葵物种的各种来自以分析在活细胞中蛋白质地理,运动,血统,和生物化学。在此方面,这些生物探针提供了一个重要的新的方法来了解蛋白质的功能,这是一个合乎逻辑的步骤细胞过程的调查,现在许多生物体的基因组序列已被确定。

在光学荧光笔的光转化反应

然而,由于已被用作荧光蛋白的亚细胞目标和在活细胞中的基因产物的功能特性进行调查,许多设计的应用程序,以确定蛋白的周转率或时间的表达模式的分析几乎是不可能的,由于与传统的荧光蛋白的事实,即它们连续地被回收(合成,折叠,和随后的退化)在细胞内的。其结果是,一个大合奏的蛋白质在其一生中的不同阶段被观察在任何特定时刻与传统的荧光蛋白,表现出稳定的发射光谱的档案。

表征蛋白质表达时间或终身的一个简单的方法是利用不稳定的荧光蛋白的变种,可以很容易地通过荧光强度区分。因此,嵌合荧光蛋白是通过蛋白水解迅速上交可划分为类较年轻的,新合成的荧光分子,已经失去了他们的发色基团的降解,由于荧光的老蛋白嵌合体。不幸的是,迅速衰减的荧光结果在非常低的信号水平,呈现准确地监测蛋白质动力学,并获得合适的数字图像之间的一种折衷。

一个更有效的解决方案是采用荧光蛋白的光谱特性随时间的变化,光照波长或类似的研究者可以控制的变量。这个类中进行探测的第一和最基本的例子之一是产生的随机诱变的红色发光的珊瑚礁来自Discosoma芨(第一指定作为突变drFP583,但现在通常被称为荧光蛋白的荧光计时器蛋白DsRed的)。最初,定时器蛋白产生的绿色发光的荧光基团(峰值在500纳米,类似于绿色荧光蛋白),但超过几个小时内,慢慢地转换的荧光,在黄-红光谱区域发射一个物种(和最多在580纳米)。与定时器部分的嵌合融合蛋白的前进年龄可确定由持续下降,所观察到的比绿色到红色荧光。然后,这个比率可以被用来收集用于基因表达的时空数据调查。

代表也许是最有前途的方法,可以激活从静止状态(这个过程被称为光活化),或启动荧光蛋白生色能够被光转换荧光发射带宽从一个到另一个(光电转换),体内蛋白质的寿命,运输和周转率的调查。适当称为分子光荧光笔,一般很少或根本没有显示的光活化荧光蛋白成像波长的激发下初始荧光,但显着提高其荧光强度照射激活后,在不同的波长(通常较低)。光转化光学荧光笔,另一方面,经过时光学变化的生色团的荧光发射带宽配置的变化。这些影响导致的直接和受控的高亮显示的不同的分子在细胞内池。因为只有有限人口的光敏分子表现出明显的荧光,其寿命和行为独立的新合成的蛋白质,可以遵循。在类似的方式中,荧光蛋白,其能够是光调制的光转化通过可逆地改变发光强度和/或颜色也可能是非常有用的研究在活细胞中的动态过程。

图1中显示出一个卡通发展到今天为止(在下面更详细讨论)是最有用的光学荧光笔光转化的机制。激活或转换序列为每个荧光笔在单个列概述,较单个细胞含有一个中央核序列中的每一步都被雇用重复卡通绘图。高强度的照明大闪电,而低强度照明为代表的小螺栓。的荧光的激发波长是闪电的颜色相似,而发光颜色出现在细胞核和/或细胞质中的细胞动画片。要检查的顺序,最上面画的细胞开始,并继续向下列。例如,一个单一的单元格包含光活化的绿色荧光蛋白(PA-GFP ;下面描述)示出转换前的第一列的顶部,并且非荧光显示(灰度)。(三)光照后的405纳米的光(紫色闪电,图1(b))中的核,具有绿色荧光,慢慢地扩散到细胞质中,所示的较低的两个细胞动画片(PA-GFP蛋白的及(d)),在第一列中。其它列包含序列象征光学荧光笔在随后的章节中讨论的光转化机制。

发现光荧光笔

早期的努力产生一个有用的光可活化荧光蛋白会见了相对温和的成功。光学荧光笔第一调查集中在野生型绿色荧光蛋白(GFP),来自水母Aequorea victoria的,主要在395至400纳米为中心的和最多的紫外光谱区的吸收。成离子酚物种吸收强烈,最高在483纳米,400纳米区域中的蛋白质与紫色光照明将中性酚醛生色。光转化反应介导的谷氨酸残基的荧光蛋白质主链中的位置222中的脱羧作用。经过激烈的紫光灯照射,可激发产生的绿色荧光,在395和488纳米的相对强度监测,跟踪光活化的野生型GFP,尽管有一些限制。首先,虽然定量的原则,的双重激励技术,不容易使用大多数激光扫描共聚焦显微镜进行。第二个缺点是光活化的野生型绿色荧光蛋白只产生荧光信号强度增加了三倍。最后,使用近紫外光激发损害最活细胞(尤其是照射时,核区),并在图像采集过程持续光敏引发了一个问题。

的绿色荧光蛋白在厌氧条件下,以一个物种,发射橙红色区域的波长(590-600纳米)的光转化是潜在有用的,在低的氧环境中的细菌和酵母的调查,但在培养的哺乳动物的研究中提供的小工具细胞。从绿色到红色的荧光发射的过渡时,会发生氧不足型绿色荧光蛋白(分离或内完好生物体)与蓝色​​的电弧放电灯或激光源的光的相对低剂量的照射。用紫外光光激活的绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白在缺氧的情况下所产生的蓝色照明的红色荧光强度相对较低。此外,效果减弱后迅速返回到正常有氧条件。

光学荧光笔的属性
荧光
蛋白
(缩写色)
励磁
最大
(NM)
排放
最大
(NM)
摩尔
消光
系数
量子
产量
在体内的
分子
结构
相对
亮度
(EGFP%)
pKa值
PA-GFP(G / NA) 400 515 20,700 0.13 单体 8 4.5
PA-GFP(G) 504 517 17,400 0.79 单体 41 -
PS-CFP(C) 402 468 34,000 0.16 单体 16 4.0
PS-CFP(G) 490 511 27,000 0.19 单体 15 6
PS-CFP2(C) 400 468 43,000 0.20 单体 26 4.3
PS-CFP2(G) 490 511 47,000 0.23 单体 32 6.1
PA-mRFP1(R) 578 605 10,000 0.08 单体 3 4.4
Kaede(G) 508 518 98,800 0.88 四聚体 259 5.6
Kaede(R) 572 580 60,400 0.33 四聚体 59 5.6
Kikume(KikGR D&G) 507 517 53,700 0.70 四聚体 112 7.8
Kikume(KikGR R) 583 593 35,100 0.65 四聚体 68 5.5
wtEosFP(G) 506 516 72,000 0.70 四聚体 150 -
wtEosFP(R) 571 581 41,000 0.55 四聚体 67 -
dEosFP(G) 506 516 84,000 0.66 二聚体 165 -
dEosFP(R) 569 581 33,000 0.60 二聚体 59 -
tdEosFP(G) 506 516 84,000 0.66 单体 165 -
tdEosFP(R) 569 581 33,000 0.60 单体 59 -
mEosFP(G) 505 516 67,200 0.64 单体 128 5.5
mEosFP(R) 569 581 37,000 0.62 单体 68 5.5
Dendra(G) 488 505 21,000 0.70 单体 44 6.6
Dendra(R) 556 575 20,000 0.72 单体 43 6.9
Dendra2(G) 490 507 45,000 0.50 单体 67 6.6
Dendra2(R) 553 573 35,000 0.55 单体 57 6.9
Kindling(R) 580 600 59,000 0.07 四聚体 12 -
Dronpa(G) 503 518 95,000 0.85 单体 240 5.0
表1

旨在探讨使用红色荧光蛋白和一些衍生工具,多光子成像光学荧光笔在实验过程中,调查人员发现,暴露在波长小于760纳米的飞秒脉冲激光照射转移珊瑚礁从红色到绿色荧光蛋白的发光颜色。这种过渡的机制被认为是链接到内发生的蛋白质的四聚体,由于从成熟形式的蛋白质的红色发射光漂白的荧光共振能量转移(FRET的减少,从而提高绿色发射,从不成熟的物种。简称为绿化的效果,这种现象似乎很复杂依赖于成熟DsRed的效率。多光子激发的一个优点是专门DsRed的体积内选定的区域(体素)的光转化本地化的能力,但该方法需要专业和昂贵的设备(飞秒钛蓝宝石激光),许多实验室提供。此外,珊瑚礁的蛋白质(包括红色荧光蛋白)的倾向预留形成的四聚体在体内常常会影响这些探针的能力,参与生物功能的嵌合体的形成。

在漂白后荧光恢复(FRAP)和荧光漂白损失(FLIP),目标选择性地漂白熄灭从一个荧光基团的荧光作为一个参考标签,同时使其他的两个不同的荧光蛋白融合的嵌合蛋白质有关的技术称为荧光漂白后(FLAP的本地化,方法是由于它能够选择性地跟踪熔融嵌合荧光蛋白在活细胞中的光敏相媲美。使用β -肌动蛋白的融合构建具有增强的黄色和青色荧光蛋白,同时跟踪贴壁的成纤维细胞中的快速重定位动态的单体(球状)G-肌动蛋白和丝状F-肌动蛋白的慢得多的动态进行了试验性研究这种技术有望用于许多应用中,但需要几乎相同的表达水平在共转染的细胞中,各嵌合体的缺点是可能会复杂生物复杂的调查。

上面描述的方法可以成功地应用在某些情况下,蛋白质利用荧光蛋白跟踪和动态调查。然而,每种技术具有很大的局限性,妨碍了它的广泛应用监测许多​​活细胞中的处理所必需的基本研究。具体来说,这些光学荧光笔限制其恶劣的荧光强度和不稳定的光转换产品。进一步的限制,简单,高效,和具体的照明技术,光转化的蛋白质无法强制执行。

光转换和光活化技术

了理想的光学荧光笔蛋白应该是容易地photoconvertible(通过荧光激活和/或发射波长位移的过程中)产生一个高的对比度水平,以及在目标系统中的最佳表达的单体。在实验中得到的结果与光漂白技术,如光漂白恢复(FRAP)和损失(FLIP并联,这些探针将是特别有用的,因为它们有优点,测量不影响新合成的或未转化的蛋白质,它或者是不可见的,或继续排放原来的波长。另外,通过在感兴趣的区域中的反复激发,光学荧光笔可以连续光转换在一个特定的细胞内定位。这种技术是比翻盖更高效,因为,活化蛋白易位可以直接成像。此外,光活化所需要的时间(几秒钟)常常是远小于所需要的时间完全光漂白的类似区域。从改善时间分辨率,调查涉及极其迅速的蜂窝进程将明显受益。

一系列的卡通图(示出典型的细胞的细胞核和细胞质),最常见的光漂白和光活化技术进行比较,如图2中所示。漂白剂和活化的区域用红色边界概述和,闪电代表光学漂白或光敏事件。标记为红色的区域也被用于进行定量分析的动力学参数绘制在图中的右手侧上的图形。在一个典型的FRAP实验(图图2(a)),具有高强度的脉冲串的蓝色光的光漂白的荧光分子的选定区域的矩形框的内部被照亮。漂白后的事件,新的蛋白质缓慢扩散到该区域,恢复细胞的荧光强度返回到稳定状态(绘制在图形)。FLIP,在图2(b)所示,是类似的FRAP除外,整个单元格的内容被重复的一个小的感兴趣区域(在此示例中,核)与异常光漂白。作为漂白周期进展,荧光蛋白在细胞核中扩散到细胞质中,在那里,其后漂白。光敏(图2(C)),所选区域与高强度的紫外光照射诱导荧光光学萤光蛋白质。作为光活化光的荧光笔扩散通过细胞质和细胞核的荧光强度降低选择边界内。一个相关的技术,称为荧光漂白后恢复(iFRAP,图中未示出)产生的结果类似的光活化,但需要漂白所选区域之外的整个蜂窝内容。

示于表1荧光蛋白在体内的探针,针对细胞结构和功能的应用程序中显示显着的潜在的重要数据的汇编包括的激励(或吸收)和最大荧光发射波长为激活的和未激活的物种,以及的摩尔消光系数,量子产率,分子结构(单体,二聚体,四聚体等),和相对亮度增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水平相比还列出了所报告的pKa值,它揭示了用于光学荧光笔蛋白在酸性环境中的发射光谱的比较稳定的。此表应作为一个方便的指南比较光学荧光笔的属性。

光活化的绿色荧光蛋白(PA-GFP)

第一个有用的光学荧光笔专为光敏研究水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白,称为PA-GFP(使用缩写,以创建一个从照片激活的缩写的一个变种这种光可激活的版本开发的GFP中性为主的形式从一个物种,是阴离子性质的天然野生型蛋白生色团的光转换效率提高。位点定向突变的主要目标是一个单一的氨基酸残基,位于第203位的苏氨酸,在野生型的发色团,它可以被修改任一项几个氨基酸的取代,以减少在475纳米的初始吸光度同时仍然允许光敏。特别是,这组氨酸残基(PA-GFP的变体)的结果在一个戏剧性的消光系数增加的吸收光谱轮廓中的蓝青色区域(在504纳米为中心)蛋白被激活时,通过用紫外线照射被突变或紫色光,在360和420纳米之间的范围内。

在无扰状态中,野生型绿色荧光蛋白发色团的中性酚和阴离子酚盐(如上面所述),共同产生的到双峰的主要和次要的最大吸收值在395和475纳米,分别包含一个混合的人口。这些峰的大小比为六比一。但是,当蛋白质与高强度的紫外或紫色光照射时,发色基团人口进行光电转换和移位为主的阴离子形式,扭转的主要和次要吸收峰的相对消光系数比为。其结果是在488纳米激发时的发色基团的荧光信号强度增加约3倍。PA-GFP的是专门设计的意图的同时增强与野生型的根据紫照度(约400纳米)的光转换效率的降低轻微的吸收峰在475纳米。203位的组氨酸残基替换450和550纳米之间的区域中,具有可忽略的吸收所产生的一个变种来满足这一要求,因此大大地提高了非激活和激活物种之间的对比度。

与紫光光活化后,在PA-GFP的最大吸收波长为504纳米的增加约100倍。此事件唤起PA-GFP的转换和尚未转换池的非常高的对比度差异,用于分子内的细胞的亚群(参见图1中的序列)的动态跟踪。请注意,光活化后,于PA-GFP和野生型GFP的荧光时,用488纳米的激光照射表现出可比的水平。不利的一面,PA-GFP表达细胞内的目标是不容易辨别出来的光转化之前没有使用低强度紫照明源(如405纳米的蓝色激光二极管),使得难以识别出正确的区域有选择地针对光敏实验用显微镜具有蓝色和绿色激光器。此外,光学标记和未标记的蛋白质之间的相互作用,不能很容易地在这些共焦显微镜观察。

PA-GFP的光谱和光活化

在实际应用中,光活化和成像的要求是主要的问题时,使用PA-GFP的突出分子事件。蛋白被激活后,PA-GFP的激发和发射最大值被转移至较长的波长相比,EGFP由几纳米,但类似的过滤器集应该是有用的两个探头(参见图3(a))。可以忽略不计的PA-GFP的荧光发射的光活化之前是可以克服的含有分子,使用在360至420纳米范围内的低水平的照明,由成像目标。这些带宽可以实现在宽视场显微镜使用紫色激发滤光片,以及近紫外和紫色激光共聚焦工具。将所得的本机PA-GFP绿色荧光非常暗,但通常是足够的定位阳性细胞和结构(图3(b))。请注意,必须注意尽量减少曝光时间,以避免过早的光活化的初步观察期间(从而减少成像实验中的对比度)。或者,具有稳定的青色量或红色荧光蛋白载体的共转染可用于定位窝藏PA-GFP探针的细胞。

示于图3(a)中为PA-GFP的吸收光谱和发射光​​谱,在光活化之前和之后。此外,图中所描述的激光波长(箭头)和宽视场的电弧放电灯的激发窗口(黄色盒子),利用光敏化蛋白质。在图3(a)中的排放量中观察照明活化蛋白后,用488纳米的激光系统。可以实现在低功率(图3(b))与405纳米二极管激光器激发的蛋白质定位目标区域。光活化后(图图3(c)),在可见光谱的绿色区域的荧光发射强度显着增加。

PA-GFP的光活化的可迅速标记分子(或整个细胞),然后可以在宽视场和共聚焦显微镜的图像序列与时间推移的动力学特性监测选定的人口。因为光毒性,由于在近紫外线和紫色波长照射可阻碍了一些调查,在780至840纳米的多光子激发的应该是一个有益的选择,如果必要的设备。在理想的条件下,只有光敏PA-GFP分子表现出明显的荧光,消除任何关注新合成的蛋白质将成为荧光灯和传统的漂白方法研究蛋白质动力学妥协的实验时,首要关注的神器。此外,PA-GFP的光活化能产生突出显示蛋白质的人口更迅速,有选择性地增强型绿色荧光蛋白分子类似的人口外光漂白具有更大的光学增强。快速而可观的光学增强,因此,通过使用PA-GFP的光活化呈现这种技术特别适合用于活细胞内蛋白质动力学分析。

先进的基因工程的策略已被应用于开发新的光活化的变体的使用单体红移礁珊瑚的荧光蛋白的位点定向诱变获得。的单体衍生物的红色荧光蛋白的荧光蛋白,mRFP1特别是,已被转换为绿色或紫外光的照射下,光活化的探针。这些被统称PA-mRFP1s的,其中最明亮的380和400纳米之间的波长激活后具有荧光强度增加70倍。光可活化蛋白生产与珊瑚礁变种出现的关键分子决定性残留氨基酸持仓量146,161,197(红色荧光蛋白编码方案)。这些残留物,闪中的发色基团的接近,无论是顺式反式(荧光)(非荧光)的配置,以形成荧光蛋白(顺式)或色蛋白(反,可以发挥稳定的66位的酪氨酸残基)吸收光线,但不会发出荧光。

三个氨基酸定点突变成变种能够通过光致顺反开关调节异构状态是建立在这个类中的光可活化荧光蛋白的基本机制。单体红色荧光蛋白光荧光笔已被证实,在哺乳动物系统中,细胞内的动态调查作为融合标签在某些情况下是有用的。然而,相对低的水平的的PA-mRFP1s中的光活化的形式(3%的EGFP),以及与天然寡聚蛋白(例如,肌动蛋白和微管蛋白)融合时,易于形成非特异性聚集的荧光,使这些探头比PA-GFP活细胞调查用处不大。改进单体的黄色,橙色和红色荧光蛋白(如mCherry,mStrawberry mPlum的的)持有的电位以产生高效率的光活化的光荧光笔与发射波长在可见光光谱的红色部分,进深延伸。

其他僧帽水母光学荧光笔

几个可能有用的光学荧光笔探头已被来自aceGFP,最高效的绿色荧光变种无色水母,天蓝蛋白被称为acGFPL的随机诱变野生型acGFPL的已产生了一些绿色荧光蛋白衍生物,其中突变,进化不变的谷氨酸残基的多肽主链中的位置222代替甘氨酸。已表现出最高水平的绿色荧光发射的衍生物名为aceGFP的区分其来源,从蛋白质中的A。维多利亚家庭。除了 ​​潜在效用aceGFP类似EGFP作为一个有用的生物工具,222位的谷氨酸的重新引入这转换成无色的蛋白(aceGFP-G222E)的衍生物,与潜在作为光活化荧光笔的。

的吸收光谱的档案aceGFP-G222E设有具有高的消光系数在280纳米和第二峰值在390纳米,小的和最多。在250和300纳米的外观,结果在一个新的具有最大的吸收曲线在480纳米之间的范围内的蛋白质用紫外光照射。由于这种转变不伴有蓝色吸收减少390纳米峰值消光系数,研究者们推测,转换源于不成熟,光谱检测不到的物种。在488纳米激发的光活化aceGFP的G222E产生绿色荧光,最大发射波长在505纳米和高的量子产率(0.45),产生一个近似的1000倍的荧光强度增加。

不幸的是,相当的光学和生物光敏aceGFP-G222E(波长300纳米以下的紫外线)的要求排除这种探头的广泛使用,由于活细胞成像实验,部分潜在的破坏性的辐射效应。此外,大多数显微镜不低于360纳米的波长区域中,可以有效地透射光的光学列车。扣除明显的电流限制,光转化成蛋白质吸收光线中的蓝色光谱区域不成熟的物种从无色的aceGFP-G222E是一种新的现象,那肯定值得进一步调查。额外的修改和相关蛋白从多管水母可提供类似的属性,以PA-GFP的光荧光笔一类新的。

另一种新颖的光转化光荧光笔,被称为光开关的青色荧光蛋白(PS-CFP),来自水母coerulescens绿色荧光蛋白变体,aceGFP,已观察到在405纳米(如第5列中所示的照明时,转换从青色到绿色荧光图1)。对PS-CFP荧光笔所产生的位点定向诱变aceGFP。作为单体的表达在生物体内时,该探头应是有用的,在光漂白,光转化,和光活化的调查,因为它可能被融合到各种各样的蛋白质,而不改变他们的行为。PS-CFP的另一个优势是显着的水平,是目前光电转换前,允许调查人员追踪和选择性照亮细胞内特定的区域或整个细胞研究的一个因素,青色荧光。然而,从PS-CFP的荧光发射强度比PA-GFP的约2.5倍的调光器,并且,该探头是不如其他方面的光电转换效率(荧光笔荧光发射的光转化的40纳米的波长偏移小于观察类似光学荧光笔)。

PS-CFP光电转换光谱和图片

呈现在图4的左手侧的光电转换之前和之后的PS-CFP的吸收和荧光发射光谱。由虚线表示本机和光转换PS-CFP蛋白吸收光谱(极大值,分别在402和490纳米)的发光光谱(各自的最大值在468和511纳米),而用实线指出。捕获的图像的数字蜂窝(负鼠肾脏)跟踪图4(a)至图4(d)中所示的序列,使用高对比度,亮的变体,称为PS-CFP PS-CFP2,这是市售的克隆载体。PS-CFP2来自PS-CFP的位点定向诱变的多肽主链的三个残基的替换,从而导致更快的成熟和更明亮的荧光(见表1)。PS-CFP和PS-CFP2忍受低pH水平的能力,能够针对这些探针等酸性细胞内涵体和溶酶体。图图4(a)中的中央细胞被选择,并具有405纳米的诱导光转化(图4(b))在高功率二极管激光器照射,然后成像超过几个小时内(图4(c)和4(D))。续生物合成原生在细胞质中的PS-CFP2最终青色的颜色的光活化细胞转移作为非转换成转换后的蛋白质增加的比例。

无论小缺点,PS-CFP为高对比度的蛋白质标记是非常有用的,并已成功地应用在双基色的比例成像实验,包括货物交换两个内体之间的直接可视化(第一次)。此外,本机和光活化的物种之间的对比度高的水平比,无论是PA-GFP或点燃荧光蛋白(KFP-1 更加明显,但Kaede(后两个荧光笔讨论相同的比例下文)。PS-CFP激烈的405纳米光曝光之后,进行了5倍的减少,在青色荧光绿色荧光并发300倍的增加,导致约1500倍的光学对比度比(增加至2000倍PS-CFP2)。光敏引发这种程度相对较高的对比度,一起聚集在体内缺乏,应使蛋白质贩运细微特征的分辨率诱导自缔探头没有任何瑕疵。PS-CFP的另一个有用的特性是能够可视化和记录数字图像的探针,使用流行的增强型青色荧光蛋白(ECFP)和标准的荧光素(FITC)荧光滤光片组合。PS-CFP还可以,低到中等的激发强度,,作为pH稳定的青色标签与其他荧光蛋白受体的细胞动力学和荧光共振能量转移实验例程调查。

PS-CFP 402纳米的最大激发光子吸收过程中的发色基团是中性的。然而,传统的质子绿色荧光蛋白的衍生物,这种现象称为激发态质子转移ESPT)绿色光子发射前发生的情况不同,PS-CFP发出青色部分的可见光光谱中的光子(最大约468纳米)。激发态质子的传输速率可能会减少这种探头由于质子转移网络进行修改,由生色环境。然而,有趣的是,要注意的是强烈的照射紫外或紫色光产生一个不可逆的变换,从野生型GFP相同的机制为质子化的去质子化的物种。这些结果表明,ESPT的调控,影响到几乎所有的荧光蛋白,应该设计新的荧光蛋白质的光转化为候选人时,首要关注的。

与PS-C​​FP之间的潜在的问题是,不像许多光活化和随后的成像转换后的物种,需要一个不同的波长的光荧光笔,PS-CFP使用相同的波长,在这两个过程的不同强度。其结果是,PS-CFP光转换和未激活的结果往往续激活由紫色激光(即使是在相对较低的光成像所需的水平)的混合物中的青色和绿色信号的同步跟踪。此工件可避免的,在许多情况下,由成像只有绿色的荧光的光转换物种。另外,PS-CFP是稍微更敏感的光漂白比增强型绿色荧光蛋白,这可能会出现问题,在某些实验中。PS-CFP比例成像实验,应谨慎对待,因为光源激发波长为青色组件的光电转换波长重叠,需要小心平衡。最后,分离青色和绿色发射光谱PS-CFP比分离绿色从其他光学荧光笔的红色发射是比较困难的。其他突变及相关荧光蛋白家族的努力有一个显着的潜力,产生了许多新的有用的青色波长区域的变种。

水母光敏荧光蛋白

已开发出多种有趣的和潜在有用的光学荧光笔礁珊瑚和海葵物种克隆的荧光蛋白。的第一和最重要的例子之一,从石公开的脑的珊瑚,Trachyphyllia geoffroyi一个四聚体的分离的荧光蛋白,已发现到photoconvert在紫外光的存在下从绿色到红色的荧光发射。有趣的是,要注意发现这个荧光笔发生时,研究人员意外地留下了一个试管中的蛋白质在实验室长凳附近一个窗口,然后敏锐地观察到从绿色到红色的转变。不寻常的色彩过渡,促使研究者的蛋白质命名为Kaede,日本槭树,由绿色变成红色在秋季的几个月后叶。Kaede蛋白分离通过创建一个互补DNA文库和筛选荧光细菌转化。与PS-CFP资格的情况下,在Kaede的荧光的光转化发生的光的吸收光谱不同于成像所需的照明带(参见图1中的第2栏)。Kaede光荧光笔380和400纳米的结果分别在主极大的转变,从快速的光谱在508纳米(吸收)和518纳米(排放;见图5),以较长的波长峰值在572和582纳米之间的光照射。

光电转换后,Kaede呈现红色绿色荧光比率(约2000倍,同时考虑减少在绿色和红色排放的增加)的显着增加。转换是稳定的和不可逆的,在有氧条件下,既不暴露到黑暗长时间也不是能够恢复绿色荧光生色570纳米的强光照射。Kaede生色红色荧光状态是绿色的亮度和稳定性方面相媲美,而且由于未转化的蛋白质发出荧光很少超过550纳米的红色信号强,外观提供了出色的对比度。已发现大星珊瑚(mcavRFP ;衍生阴茎海绵体Montastraea),软珊瑚(来自DendFP ;成员-木),和蘑菇珊瑚(rfloRFP衍生的相关蛋白质能够紫色和紫外光照射的光转换Ricordea佛罗里达州)。所有这些荧光笔(包括Eos的,在下面讨论)含有发色基团是来自于三肽- 酪氨酸 - 甘氨酸,初步形成一个红色的状态,直到驱动的绿色荧光的光,而不是化学氧化的情况一样,有许多红色荧光蛋白来自珊瑚。在这个类中的光学荧光笔呈现独特的色彩过渡性质的探头光学标记的亚细胞器,甚至整个细胞的优秀的候选人。此外,使用光谱成像检测器系统在共聚焦显微镜观察时,在特定的细胞中,可以采用定义为个别的监测和筛选目的的单独的图像频道中的绿色到红色的荧光发射率转移。

光转换的光谱分布和Kaede荧光蛋白

如图5所示的吸收和荧光发射光谱的自然光转换Kaede,随着一系列的图像的非融合的Kaede荧光蛋白(缺乏亚细胞定位的合作伙伴)扩散在整个细胞质中的一个孤立的负鼠肾上皮细胞。非变频Kaede吸收和发射光谱图中的绿点和破折号概述,而红点和破折号表示的光转换Kaede型材。注意光谱的两对相对较小的斯托克斯位移(Stokes shift)(约10纳米),但大的间隔距离(60纳米)之间的绿色和红色的发射最大值。的数字图像序列(图5(a)至图5(d))示出绿色荧光发射前从Kaede光转化(图图5(a)),和后不久,用405纳米二极管激光器的选定区域的照明(图5(b))中的红色区域。光转换Kaede慢慢地扩散在整个细胞的细胞质中(图5(c)和图5(d)),但不进入细胞核两张。当成像在较长的时间内,继续Kaede蛋白质的生物合成的转移细胞质中的整体颜色从橙红色至黄绿色作为原产转换Kaede缓慢增加的比率。

基于PA-GFP的类比与激活的事实,微酸性的环境中促进后,调查人员推测Kaede蛋白发色团的最有可能发生光转化的质子照射时(而不是中性)种用紫外线或紫光。当被使用时,在365至400纳米范围内的照明光转化动力学是快速的(表现出半衰期为约30秒)。然而,由于增加朝蓝紫色区域照射波长(440纳米)的转化率显着下降,并最终完全停止在470纳米以上的(虽然仍然观察到绿色的发光强度逐渐减少,)。

周围的组氨酸,酪氨酸,甘氨酸三肽在Kaede生色中心的建议的机制驱动光电转换定位在62-64残基肽骨干。这些氨基酸形成的咪唑啉酮的发色基团(类似的多管水母蛋白)转化在更短的可见光和较长的紫外线的波长从绿色变为红色荧光照明下。照射诱导裂解之间的酰胺氮和高度共轭的双咪唑环系统,这个过程需要由完整蛋白质的催化产生戏剧性的转变中的红色波长的荧光发射(与随后形成的组氨酸残基的α-碳原子的;图6)。标新立异化学此生色过渡参与应为荧光蛋白的工程师提供了一个很好的基础,开发更先进的光学荧光笔。

其他珊瑚礁物种,如上面所讨论的已分离出具有性质类似于Kaede的荧光蛋白。例如,石珊瑚法维亚的瘌痢,取得了一个有前途的四聚体衍生物,具有高效的光电转换后,从绿色到红色荧光发射波长与近紫外或紫光灯的照射。基因工程的努力的基础上的这种蛋白质的结构分析产生的变体,称为KikGR(命名后Kikume以示,日本术语法维亚)数倍的亮度比在绿色和红色的状态,当在哺乳动物细胞中表达时,Kaede市场上可买到的名称Kikume绿红的光荧光笔已被证明是成功使用多光子激发的光转换为760纳米,它可用于具有高空间辨别在厚组织的细胞特异性标记。此外,Kikume荧光笔具有更广泛的绿色和红色发射最大值(75纳米)的分离比Kaede

已被隔离软珊瑚的珊瑚中和名为登德拉的(来自属名,DEND的前四个字母的缩写ŗ ED 一个 ctivatable的)的另一个独特的荧光笔进行绿色到红色的光转化登德拉最初分离的四聚体,被转换成一个真正的单体通过位点定向诱变,得到一个红色的物种,可以使用紫外线或蓝色光,可以将光转换成绿色的荧光探针。光电转换后,登德拉呈现红色荧光的4000倍的增长,并表现出显着的耐光性。不像许多的多管水母蛋白变体,成熟的Dendra和绿色发色团在很宽的温度范围内是非常有效的,从20至37摄氏度。一个商业版,Dendra2,包含一个单一的氨基酸为丙氨酸,缬氨酸取代,第224位(A224V),从而导致光电转换之前和之后的较完整的成熟和更亮的荧光。在高强度使用488纳米激光能力photoconvert将Dendra是独特的,其他的绿色到红色光荧光笔需要更多的紫外线光毒性或紫外线(405纳米)的光。然而,谨慎调整时,应使用488纳米的激光成像登德拉的,以避免不必要的光转化。

其中作为光学荧光笔Kaede家庭中使用的蛋白质的优点是大的分离在所需的高效率的光电转换和随后的观察(在60和75纳米之间)之间的吸收带的峰值波长的,使一些激光器中的应用进行实验。例如,用405纳米的蓝色激光二极管诱导光转化的照射后,图像采集可以很容易地完成,在488纳米和绿色或黄色的氦氖激光器工作在543纳米或594纳米氩离子激光,分别。请注意,没有会引起进一步的观测波长的光转化荧光笔。虽然很容易选择的感兴趣区域的光转化,使用共聚焦显微镜观察,也可以被成像的蛋白质,与传统的宽视场荧光显微镜配有适当的过滤器的组合。在下行路上,许多的珊瑚礁珊瑚和海葵蛋白的是专四聚体,包括主Kaede衍生工具,导致形成聚集的倾向时,荧光笔其他蛋白质融合。在许多情况下,这件神器将限制Kaede及其亲属使用散装的细胞质细胞的跟踪调查。进一步的基因工程涉及四聚石珊瑚光学荧光笔的努力可能最终产生是有用的的单体衍生产品,融合结构,讨论如下。

礁珊瑚EOS荧光蛋白

另一种四聚体,石珊瑚(Lobophyllia hemprichii)的,称为荧光蛋白类似Kaede EosFP(命名后,希腊神话中的黎明女神Eos的 ;见表1),发出明亮的绿色荧光,在516纳米转移到橙红色(581纳米)用紫外光照射时,在波长为390纳米的近紫外区域中。在这种情况下(如上面所讨论的与Kaede蛋白),谱移所产生的光引起的变形例,相邻的发色基团的肽主链中包含一个停顿。已经采用两个单点突变野生型成二聚体亚基的四聚体,其中每一个都能够被并入保留正常的生物学功能的蛋白质,具有多种功能的融合构建分割。此外,串联二聚体(tdEos)的变体具有蜂分隔的一个12氨基酸接头的荧光蛋白质序列,其中包含两个副本。的串联二聚体的成熟在摄氏37度的温度下有效地和有效的行为作为单体的融合产物,尽管以两倍于分子的大小和重量。

Kaede和EOS染色体的光转化机制

到的野生型EosFP的四聚体通过引入单点突变的组合,功能性单体蛋白已被创建,它被简称为mEosFP“ 类似的二聚体亚基,单体能够被纳入作为活细胞成像中的标记的功能性生物嵌合体,虽然单体融合只在摄氏30度以下的温度下(在哺乳动物系统中限制了它们的应用程序的功能性表达) 。荧光笔蛋白的荧光光谱表明pH值依赖于光转化,表明生色团的质子化形式的激活,这是一致的激发态质子转移机制是必要的。EOS肽骨干裂解绿色到红色的光转化过程中也被观察到Kaede和KikGR荧光蛋白(如上所述,见图6),配有类似荧光笔特征。事实上,Eos的,登德拉,Kaede生色团可能最终证明是相同或同分异构体的结构,但组氨酸(His62)残基在KikGR生色团意外地适应一个顺式配置,而不是安排为图6中所示反式红色光转换物种。

独特的绿色到红色光荧光笔迄今为止发现的礁珊瑚蛋白质中肯定保证积极努力,重点解决与聚合相关的问题,以及微调光敏要求和成像光谱。工程迅速地在37度的变体的成熟,Eos的单体蛋白,它具有的光学性质非常相似,Kaede,应该要更加有用,由于显着降低的倾向,形成在体内的融合蛋白之间的分子间的关联的表位标签在未来,工程光学荧光笔蛋白变速光转化照明波长的蓝色和绿色光谱区域,这是显着减活细胞的毒性,加上黄色荧光发射的变化通过远红光的波长带的,潜在的应用Kaede和EOS衍生探头可以大大扩展。

Kindling荧光蛋白(KFPS)

一个有用的非水母光的荧光笔,点燃荧光蛋白(KFP1)的已被开发非荧光生色分离Anemonia苏卡达,现在是商业可用。,慢性点燃荧光蛋白不表现出发射,直到照明的绿色或黄色的光,在525和580纳米之间的区域。在瞬态红色荧光(火种),在580和600纳米,最大激发和发射,缓慢衰减的照明停止时,作为蛋白质放松返回到它的初始的非荧光的状态(表现的半衰期低强度的光的结果约50至60秒)。强烈的蓝色光照射淬火立即完全点燃荧光,允许严格控制荧光标记。请注意,与低强度的绿色光和蓝色光的荧光淬灭两个火种为野生型蛋白的可逆过程。在对比度,高强度的照明或者续照射在中等水平导致不可逆的点燃与荧光强度约30倍,超过的非活化的蛋白(参见图1中的第3栏)。不可逆点燃分子不失去它们的荧光,并与蓝色光的照明不灭。此功能允许长期稳定高亮的细胞,组织和细胞器PA-GFP和其他荧光笔蛋白相似。

跟踪细胞器运动的Kinfling荧光蛋白

图7中给出了一系列的跟踪使用的火种荧光蛋白(KFP1)的培养基中培养的真核细胞线粒体的图像。负鼠肾皮质近曲小管上皮细胞(线)转染的质粒载体含有KFP1融合到线粒体靶序列,并转移到一个活细胞成像室。一个典型的场(图7(a)条),氦氖激光照射在543纳米,用3%的功率输出,建立标记线粒体单个细胞内的分布格局。这种激光的功率电平诱导可逆的火种在所有的标记线粒体启用可视化的大小和位置。接下来,一个地区的利益被勾勒出来(黄色框;图7(a))和40%的激光功率输出不可逆转地点燃了线粒体在选择区域中,照明用的457纳米谱线氩照射离子在2%的功率激光淬火可逆点燃的可视化领域内线粒体。不可逆点燃线粒体一段时间为15分钟,使用1%的功率氦氖激光跟踪。图7(b)和图7(c)示出的KFP1标记的线粒体在5分钟内(图7(b)和15分钟(图7(c)),证明跟踪遍历的微管网络的细胞器。请注意在较长时间尺度的线粒体发生碎裂。

其他定点突变本地海 ​​葵生色(ASCP)和几个变种的努力,已经建立了一系列新的火种,可以激活(日光灯)和灭活(非荧光)状态之间的可逆的光转换荧光蛋白。海葵点燃蛋白质表现出荧光橙红色区域的可见光谱的吸收有极大的型材约580纳米的发射峰从600到630纳米不等。各路这些变种之间的黑暗,点燃状态接近光学对比度增强70倍。然而,半衰期短展出点燃状态,防止使用这些探针作为一个长期在体内跟踪了解亚细胞动力学研究有针对性的活化荧光标签无论如何,能够精确地控制荧光信号强度是在拥挤的环境中追踪粒子的运动时,特别是有用。例如,火种荧光蛋白已经被成功地用于跟踪在开发非洲爪蟾胚胎和个人PC12细胞中线粒体的运动神经板细胞的命运目前的研究努力的方向努力开发更先进的火种荧光蛋白可以激活的时间较长。

使用位点定向诱变在点燃的荧光蛋白的荧光激活的机制调查表明,在位置64中的发色基团在空间上邻近的酪氨酸残基的氨基酸的光转化反应是至关重要的。生色团的电荷分布,分子构象的变化或其他环境变量是最合理的解释这些结果。大多数绿色荧光蛋白变体的中性和阴离子的种类有显着不同的激发光谱,但点燃的蛋白质的激发最大值是非常接近的光转化前的最大吸收。这一观察到一个假设,即另一种现象是负责点燃效应变得可信。的基础上的结构模型,X-射线衍射分析,和突变的结果,已经提出了一种机制,涉及光子引起的异构化反应的发色基团的酪氨酸残基的背后作为基本的驱动力转换成荧光状态的蛋白质。支持这一理论派生的能力,转化到点燃火种和非荧光发色团的荧光蛋白,通过适当的氨基酸替换。

DsRed和Kindling荧光蛋白质发色团

在图8中示出的示意性的分子模型DsRed和发作和非发作形式KFP1展示的生色团之间的类比。的碳原子,而氧和氮原子中的红色和蓝色的颜色,分别表示,为白色枝。的红色荧光蛋白的第66位的酪氨酸(相等于的Tyr64,KFP1)的相邻的残基是异亮 ​​氨酸165和丝氨酸148。该模型生成在火种蛋白的荧光涉及激发的荧光发色团的顺反异构化(图8)。曾有人建议在点燃的发色团(DsRed的异亮氨酸,图8)的158位的丝氨酸残基的关键,以稳定的酪氨酸66反式构型的残余物在(非荧光状态)。激励点燃生色团,使酪氨酸64个残基异构化顺的位置,从而产生荧光。这一假说已经得到为缬氨酸取代,第158位的丝氨酸的突变体,其中的建设。突变体失去所有火种属性和自然荧光,贷款由缬氨酸甲基,立体禁止转化为反式异构体的染色体(非荧光)被封锁状态的理论证据。

所有海葵火种检查蛋白质的主要缺点是他们的倾向,聚合成四聚体,从而严重影响的潜力没有一定程度的干扰正常的生物过程用于蛋白质标签。然而,点燃蛋白质批量光化学法和跟踪个别的细胞器和细胞内人口众多优秀的候选人。点燃的蛋白质的其他优点包括红色和远红光的荧光发射光谱的档案,这有利于它们的效用多色标记实验中,青色和绿色荧光蛋白。此外,点燃过程的可逆性允许调查前检查整个荧光图案的标记细胞不可逆转的特定区域的光化学法。作为一个额外的好处,脱水点燃蛋白保留可逆的光转换的能力,并因此可能在生产的光致发光膜,光化学的存储单元,以及各种其他的纳米技术的应用提供了有用的服务。

Dronpa:读擦除 - 写于​​光灯开关

新一代可逆的开关切换功能的专业光学荧光笔预示通过引入来自Pectiniidae,一个家庭的几个成员,自然散发出淡淡的荧光紫外线照射后的石礁珊瑚,单体荧光蛋白Dronpa融合后的忍者长期消失(德龙)和光敏(PA)的名字命名,Dronpa表现出不寻常的,因为它能够切换荧光照明两个不同的激发波长的光致变色行为。使用两个定向随机诱变,以产生野生型低聚物具有重大的最大吸收波长为503纳米,和在中性pH值小峰在390纳米的荧光蛋白的单体的版本被设计dronpa。在503纳米的吸收峰是由于该蛋白的去质子化的物种,而较小的峰在390纳米来自质子化形式。当在488纳米照射的去质子化的物种的荧光发射光谱的档案有一个最大的,在518纳米具有相对高的量子产率为0.85。与此相反,从质子化的蛋白质几乎是无荧光的。光控Dronpa发生去质子和质子形式的光学荧光笔之间相互。在488纳米强烈照射后,其蛋白质人口是非常有效驱动质子物种,承诺减少荧光暗淡(关闭)状态,其中390纳米吸收峰为主。在朦胧的状态很容易转换回原来的荧光灯()去质子化状态以最小的照度在405纳米。

除了 ​​事实,Dronpa荧光强度大大超过了增强型绿色荧光蛋白(EGFP ;见表1),最显着的特征,这种光学荧光笔速度在488纳米(生产绿色发光)的光激发后,它可以很容易地全面恢复,通过随后的照射在405纳米(如上所讨论的,参见图1的第4列)。需要注意的是光活化Dronpa需要少得多的光子的能量,比光控的非荧光的状态(这两个过程的量子产率比为超过1000)。其次是激活失活这种模式可以不断重复和PH值不敏感,表明一个潜在的真正独特的能力,可逆的光控荧光嵌合融合产品。主要的缺点是比较快的光控率非荧光质子化的物种的Dronpa在488纳米照射时,限制,可被光活化后收集的图像的数目。然而,审慎使用中性密度滤光片,或小心地控制激光衰减(声光可调谐滤波器的AOTF)应使处于激活状态的能力,捕捉多个图像的Dronpa标签蛋白。

dronpa荧光蛋白光控的步骤

可逆的光控的Dronpa荧光如图9所示,使用一个孤立的转化的非洲绿猴肾细胞(COS-7行),在培养基中培养。贴壁培养转染的一个向量,包含只的Dronpa蛋白基因(没有亚细胞融合目标)和生长在活细胞成像室。最初非常明亮的绿色荧光激发波长为488纳米(图9,图像的时间点= 0秒)慢慢变淡后观察一段50秒到60秒(图9(a)和时间点的10到55秒),检测不到在中等程度的照度水平。荧光笔转换的去质子化,以质子化的物种的衰减曲线(绿色),图9(a)中示出。光敏化后,使用405纳米二极管激光器(紫色曲线在图9(a)),Dronpa荧光完全恢复。衰落之后通过光活化荧光恢复的顺序重复超过10个周期(图9(b)),揭示的初始荧光强度完全康复Dronpa的慢慢减小续轮。10个循环后,在此试样的Dronpa回收的荧光强度降低到初始值的88%的,但可以迅速地重复光控周期(毫秒时间尺度上)与超过100回合的孤立的单一的蛋白质分子。

光致变色(荧光和关闭切换的能力)虽然已观察到野生型和几个黄色荧光蛋白变种维多利亚多管水母 GFP在单分子水平,都没有表现出这种现象,测量时散。在这些研究中,在488纳米处的照度数分钟,产生的分子荧光几秒钟,随后同样短的时间间隔,没有发射,随后再次恢复发射。被称为闪烁的行为,这和关断开关序列可以重复许多次每个绿色荧光蛋白分子前约一百万的光子的发射时,最终达到最终的长寿命的非荧光的状态。明亮的状态可以恢复为五分钟内重新启动的顺序由488纳米激光照射前照射紫外光(405纳米)。以这种方式,许多原生的绿色荧光蛋白衍生物显示光诱导的切换效果,其中每个分子是单独可寻址的。然而,能力强的大型Dronpa标签分子合奏(包括细胞器和整个细胞)集体行动的能力,写,擦除和非破坏性读取信息作为信息存储介质,具有效率高,是真正的领域独树一帜的荧光蛋白。

实验设计的实际考虑

荧光笔荧光蛋白利用光学设计实验时,应考虑的几个重要方面,关于活细胞成像,显微镜配置,载体构建,和蛋白质的选择,以优化图像采集参数。这些独特的探头主要用于监测活细胞中的动态过程,这往往需要保持细胞培养显微镜舞台上长时间处于亚健康状态。各种专门的加热成像室制作舞台插入市售的长期细胞在显微镜维修,但研究者也必须考虑一些必要的辅助要求,如二氧化碳源,轻紧显微镜外壳,和振动隔离。总之,成功形象长时期的活细胞必要的实验条件下,应仔细着手与光学荧光笔蛋白实验前成立。

光学荧光笔荧光蛋白质上述几个可以成功使用传统的宽视场荧光显微镜技术成像,但严重的定量调查,涉及的漂白方法和光敏往往必须配备专门的激光系统的多光子共聚焦显微镜进行。具体而言,PA-GFP,PS-CFP,Kaede,EosFP,Dronpa所有需要近紫外或紫色的照明光活化或光转化,但成像的蛋白质所需的较长波长的光源(蓝色和绿色激发)。因此应配备的紫外或紫色激光,以及可见光激光器,发射蓝色和绿色光谱线,共聚焦显微镜。当下最流行的激光光学荧光笔配置,虽然紫外线高能量的氩气,二极管泵浦固态二极管405纳米,488纳米氩离子,和一个543纳米的氦氖,氦镉激光可作为光敏(牢记潜在的细胞损伤工件可以用紫外线照射)。其他有用的成像激光器包括一些新的二极管和氦 - 氖模型和多光谱氪 - 氩系统。最好的多仪器配置与宽带钛蓝宝石激光器的波长范围在750纳米到1100纳米之间的可调输出。

照明光转换和光活化过程中的具体区域的划分是最有效的声光可调谐滤波器(AOTF),可以很方便地用来定义选择圆形,椭圆形,矩形或手绘照射试样进行。AOTF还可以进行微调激光功率水平调节强度试样,并能够使用的技术被称为高速通道切换或multitracking的顺序扫描标本这种方法使排放的顺序激发和收集一些荧光探针,以避免出血,通过文物,更准确地单独的发射光谱。定义地区的广角镜的兴趣,提出了更大的挑战。研究级显微镜通常配备照亮选定区域中的试样,可以进行调整的可变光圈,虽然用少得多的精度比共聚焦显微镜的声光可调谐滤波器的系统。广角仪器也必须配置专门的荧光滤光片组合以图像的几个光学荧光笔蛋白。相比之下,共聚焦和多仪器更适合定量分析细胞动力学,利用光电转换和光活化技术比宽视场显微镜,因此应为这些应用的首选。

光学荧光笔蛋白的亮度水平和图像

光学荧光笔探针的选择应取决于具体的实验要求的宿主细胞系统,参与调查,它可以包括膜,细胞器,核酸和蛋白质的生物目标。在一般情况下,单体的荧光蛋白的亚细胞定位实验中使用的融合载体,大大优于那些形成高阶的聚集体(主要为二聚体和四聚体)在体内的表达。例如,Kaede是一个预留的四聚体可能无法达到预期效果融合时感兴趣的蛋白质的光转化实验。而是选择单体版本的聚EosFP或PS-CFP荧光笔确保成功的概率更大。在本文中讨论的几个光学荧光笔是市售的,并包含在宿主质粒的多克隆位点,其目的是为了使含有广泛的限制性核酸内切酶切割位点的互补DNA序列的掺入。这些载体是理想的用于克隆特定的亚细胞定位的靶基因产生的融合蛋白。

产生足够高的荧光信号电平为最佳的图像采集也是使用光学荧光笔时要考虑的一个重要因素。在这方面,可以采用的吸收摩尔消光系数和荧光量子产率的值的本机和光转换蛋白物种,以此来衡量,以确定相对的亮度水平。例如,Kaede和mEosFP都具有相似的光谱带宽配置的可见光光谱中的绿色(母语)和红色(光转换)地区。然而,Kaede的固有绿色形式大约有绿色mEosFP由于到一个更高的消光系数和量子产率的荧光发射强度或亮度电平的两倍。因此,在光电转换之前,成像信号 - 噪声比Kaede远高于mEosFP。光电转换后,这两种蛋白具有类似的亮度水平(见表1),并产生媲美的图像。在当前可用的光荧光笔蛋白,Dronpa,Kaede,mEosFP的是最亮的,其次是PA-GFP,在亮度电平的光转换Kaede物种类似,但显着低于天然蛋白。市售的PS-CFP2变种是大约一个半光亮如Kaede,而火种和PS-CFP蛋白质,无论是在本土和光转换形式,是迄今最暗的光荧光笔,收益率只有约25%的亮度电平表现出的光转换的Kaede(表1)。后者荧光笔生物目标具有低丰度的水平,或需要高成像速度的调查计划时,应考虑的一个因素,在成像过程中,表现出显着较低的信号信噪比。

如图10所示,是几个比较有用的光学荧光笔在本次审查讨论了一系列的最佳条件下拍摄的数字图像。此外,图中为每个蛋白(光活化或光转化后)的绿色荧光蛋白的荧光强度的百分比列出的亮度电平。的亮度等级是由该产品的摩尔消光系数和荧光量子产率(在最大吸收)。请注意,图10和表1中列出的亮度值会有所不同,基本上,当被激发的荧光蛋白质固定的激光光谱线时或使用更宽的带宽,所产生的电弧放电灯耦合到带通激发滤光片离峰。此外,荧光蛋白的亮度水平可以大幅波动,从细胞到细胞,尤其是在瞬时转染不同数量每单元结果吸收大大不同程度的表达质粒载体。点燃荧光蛋白(KFP1,图10(e)条),这是定位到线粒体异常,荧光笔荧光蛋白如图10所示的光学耦合融合伙伴,往往会扩散到整个细胞质和细胞核。的的荧光笔蛋白图像(图10(b)和图10(c))被抓获后极短的一个选定的区域具有高强度的紫激光的光转化,前光转换的物种能够扩散到整个细胞质中。

结论

来自各种各样的海洋物种数量不断增加的荧光蛋白的生物学作用的复杂的相互作用才刚刚开始被理解。光致变化的自催化的发色团,包括光活化和光转化,可作为高度发展的光保护机制,以协助这些生物中的有用的高能量的阳光下,特别的损害更短的波长的功耗,通过吸收和随后的荧光再发射波长更长和更安全的。在许多情况下,这些显着的荧光蛋白显示很高的耐光性和动态光诱导相变特性,包括光谱微调共振能量转移给体 - 受体对(甚至级联)。大量的光谱变量已经发现,具有排放概况,覆盖了整个可见光谱表明,这些蛋白质的各种光学和生化特性,会产生一系列新的候选人作为探针进行生物调查,并确保持续发展的独特的基因工程荧光蛋白质。

能够有选择性地启动或改变光转化光学荧光笔蛋白的荧光分布呈现这些探头作为优秀的工具,探索蛋白质在活细胞的行为。荧光笔的荧光强度(光谱或颜色)发生后,才光子介导的转化,新合成的的非光敏蛋白池无法观测到的,不复杂的实验结果。这个信号独立于新的蛋白质的合成,可能会启用的技术,如光脉冲的标签和监测随着时间的推移的荧光标记的分子的蛋白质的降解动力学的研究额外的量化技术,包括荧光相关光谱(FCS),应该证明有用的衡量流动性的光敏光学荧光笔在小数字,甚至下降到单分子水平。

光活化及经光光学荧光笔一般是迅速的,并产生稳定的荧光信号。因此,这些探头可用于研究各种标签蛋白的动力学性质,如扩散系数,分数的流动性,房室居留时间和汇率。在许多情况下,光电转换FRAP和FLIP比传统漂白技术提供了更大的灵活性。此外,在发展中的有机体的细胞系或易位可以很容易地监测成像光活化后的单细胞或亚细胞荧光分散。在这些方面,光学的荧光笔表现出惊人的承诺,补充和扩展目前荧光蛋白成像应用的范围。

许多礁珊瑚的荧光蛋白光荧光笔专四聚体性质往往严重限制了它们的应用程序,在体内生物的结构和功能的调查作为融合蛋白标签一旦表达,可以制作形成的四聚体异常定位,扰乱正常的功能,或限制的融合产物聚集在一个特定的细胞器或细胞质中。荧光蛋白融合,如肌动蛋白,微管蛋白,或小窝,其本身参与在自然低聚物形成的合作伙伴时,这种效果是特别显着。创建荧光蛋白单体的基本策略涉及重复的位点定向诱变破坏四聚体的接口,通常是由疏水性和中性基团的亲水性或带电荷的氨基酸取代。荧光量子产率的显着下降,因为通常伴随遗传修饰的,圆的随机诱变是经常要救援荧光。

由于光学荧光笔继续发展,荧光蛋白,可用于光学标记应走向光明的发展,具有高对比度,可以很容易光转换和颜色的发射,显示了广泛的单体衍生物。例如,能够可逆的光活化,红色到绿色的光转化,在升高的温度下改进的表达,在远红外或近红外光谱区的发射和衍生物的蛋白质,将是特别有用的。加上这些进步将变得司空见惯,显微镜配备之间的顺利过渡照明荧光观察模式和区域标记在大多数细胞生物学实验室。与先进的荧光共振能量转移和多光子激发技术,如光活化和光转化的组合,可使蛋白质动力学的研究,以更高的精度和空间分辨率。最终,这些创新有潜力做出显著成绩的信号转导系统在空间和时间上的动态。