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奥林巴斯显微镜:物镜的数值孔径和分辨率

2013-10-16  发布者:admin 

显微镜物镜的数值孔径是其收集光并解决细标本细节在一个固定的物体距离的能力的量度。图象形成光波穿过试样和在倒置锥体进入物镜,如图1这个锥形光的纵向切片显示了孔径角,是由物镜的焦距确定的值。

μ是二分之一的数值孔径角(A),它与通过以下等式的数值孔径

数值孔径 (NA= n(sin µ)

其中n是物镜的前透镜和试样玻璃盖,一个值,该范围为1.00空气1.51专门浸没油之间的成像介质的折射率。许多作者替换变量αμ在数值孔径方程。从这个等式很明显,当成像介质为空气(具有折射率,n= 1.0),则数值孔径仅取决于所述角μ的最大值为90°。角度的sin µ,因此,具有1.0(SIN(90°)= 1),这是一个透镜与空气作为所述成像介质操作的理论最大数值孔径(使用“干”显微镜物镜)的最大值。

在实践中,但是,它是很难实现的数值孔径值在0.95以上的干的物镜。图2示出了一系列从变焦距和数值孔径的物镜衍生光锥。作为光锥改变,角度μ从7°的增加在图2(a)至图2的(c)60°,从而增加了数值孔径从0.12至0.87,接近极限时空气是成像媒介。

通过检查数值孔径方程,很明显的是,折射率是在实现数值孔径大于1.0的限制因素。因此,为了获得较高的工作数值孔径,物镜的前透镜和试样之间的介质的折射率必须增加。显微镜物镜,现已允许成像在其他媒体,如水(折射率= 1.33),甘油(折射率= 1.47),和浸油(折射率= 1.51)。护理应与这些物镜可用于防止当一个物镜是,使用具有比它的物镜是为不同的浸没介质,这将产生不希望的伪影。我们建议显微镜从来不使用专为油浸无论是与甘油或水的物镜,虽然有几个新的物镜,最近已经出台,将与多个介质。您应与制造商检查是否有任何疑虑。

多数物镜在60倍和100倍(或更高版本)的放大倍率范围是设计用于浸油的使用。通过检查上面的数值孔径方程,我们发现,最高理论数值孔径与浸油获得的是1.51(当sinμ)= 1)。在实践中,然而,大多数的油浸物镜的1.4的最大数值孔径,以最常用的数值孔径范围为1.0至1.35。

物镜的数值孔径也依赖,在一定程度上,在校正光学像差的量。高度校正的物镜趋于如示于下表1中有大得多的数值孔径为各个放大倍数。如果我们采取了一系列典型的10倍物镜作为一个例子,我们看到,平场校正的规划物镜,数值孔径增加对应校正色差和球面像差平场消色差,NA = 0.25; 平场萤石,NA = 0.30; 并平场复消色差透镜,NA = 0.45。

物镜的数值孔径
放大平场
消色差
(NA)
平场
萤石
(NA)
平场
复消色差透镜
(NA)
0.5X0.025不适用不适用
1X0.04不适用不适用
2倍0.06不适用0.10
4倍0.100.130.20
10倍0.250.300.45
20倍0.400.500.75
40倍0.650.750.95
40倍(油)不适用1.301.00
60X0.750.850.95
60倍(油)不适用不适用1.40
100X(油)1.251.301.40
150倍不适用不适用0.90
表1

增加数值孔径横跨越来越光学校正因子在一系列类似倍率物镜的该特征保持在整个放大率范围内真如表1所示。大多数制造商努力,以确保它们的物镜具有最高校正和数值孔径是可能每个类的物镜。

的显微镜物镜的分辨率定义为在该仍然可以区分为两个独立的实体的检体的两个点之间的最小距离。分辨率是显微镜,因为在高放大倍率,图像可能会出现不清晰的,但仍然有点主观的价值被解析为物镜的最大能力。数值孔径确定一个物镜的分辨能力,但在显微镜系统的总的分辨率也取决于台下聚光镜的数值孔径时。较高的总系统的数值孔径,更好的分辨率。

显微镜光学系统的正确对准是非常重要的还有,以确保最大的分辨率。台下聚光镜必须匹配于物镜相对于数值孔径和调整孔径光阑为准确的光锥的形成。用于图像中的检体的光的波长光谱也是第一个决定性因素。较短的波长是能够解决的细节在更大程度的比是在较长的波长。有已被衍生表达的数值孔径,波长,和分辨率之间的关系数方程

R =λ/ 2NA(1)
R =0.61λ/ NA(2)
R =1.22λ/(NA(OBJ)+ NA(cond))(3)

其中,R是分辨率(两个对象之间的最小可分辨的距离),NA等于数值孔径,λ等于波长,NA(OBJ)等于物镜的数值孔径,及NA(cond是聚光的数值孔径。注意,等式(1)(2)相差倍增因子,这是0.5等式(1)和0.61等式(2) 。这些方程是基于许多因素(包括各种光学物理学家制成理论计算的)来解释的物镜和聚光镜的行为,而不应被认为是任何一个一般物理定律的绝对值。在一些情况下,如共焦和荧光显微镜,分辨率实际上可能超过置于由这三个方程中的任何一个的限制。其他因素,如低标本对比度和不当照明可用于较低的分辨率,并且更经常的情况是,对现实世界的最大值R(约0.25 微米的使用550纳米的中间光谱的波长),以及数值孔径1.35 1.40没有体现在实践中。表2提供的列表分辨率(R)和数值孔径(NA)由物镜放大倍率和纠正。

分辨率和数值孔径
由物镜类型

物镜型号

平场消色差萤石平场平场复消色差透镜
放大不适用分辨率
(微米)
不适用分辨率
(微米)
不适用分辨率
(微米)
4倍0.102.750.132.120.201.375
10倍0.251.100.300.920.450.61
20倍0.400.690.500.550.750.37
40倍0.650.420.750.370.950.29
60X0.750.370.850.320.950.29
100X1.250.221.300.211.400.20
NA =数值孔径
表2

当在显微镜是在完美对准,并具有与台下聚光镜适当匹配的物镜,那么我们就可以代替物镜的数值孔径成方程(1)(2) ,与添加的结果是等式(3)简化为方程式(2) 。要注意的一个重要的事实是,倍率不会显示为在任何这些方程的一个因素,因为只有数值孔径和照明光的波长确定样品分辨率。正如我们所提到的(并且可以在公式中看到)的光的波长是在显微镜的分辨率的一个重要因素。更短的波长,得到较高的分辨率(对于较低值ř),反之亦然。在光学显微镜的最大分辨能力实现了与近紫外光,最短有效成像波长。近紫外光之后是蓝色,然后绿色,最后红光在解决标本细节的能力。在大多数情况下,显微镜使用由钨-卤素灯泡产生白光照亮样品。可见光谱的中心位于约550纳米,对于绿色光的主波长(我们的眼睛最敏感的绿色光)。它是该波长被用来计算在表2中的数值孔径值分辨率值也是在这些方程和更高的数值孔径重要也将产生更高的分辨率,可明显看出在表2中的光的波长的效果上的分辨率,在一个固定的数值孔径(0.95),列于表3。

分辨率与波长
波长
(纳米)
分辨率
(微米)
3600.19
4000.21
4500.24
5000.26
5500.29
6000.32
6500.34
7000.37
表3

当光从各点的试样的通过物镜,并重组为一个图像时,各点的试样的出现在图像的小图案(未分)被称为在艾里模式。这种现象是通过衍射或光散射引起,因为它穿过微小零件和间隔在试样和物镜的圆形回光圈。艾里模式的中央最大常被称作艾里斑,它被定义为通过所述第一最小值的艾里图案包围的区域,并且包含的光能量的84%。这些艾里磁盘组成的小同心轻和黑眼圈如示于图3本图显示艾里磁盘及其强度分布作为间隔距离的函数。

图3(a)示出一个假想艾里斑,基本上由包含中央最大的衍射图案的(通常称为零阶最大值)由同心第一,第二,第三等,依次递减的亮度顺序最大值构成包围的强度分布。两个艾里磁盘和在光学分辨率的极限它们的强度分布示于图3(b)中。在这一部分图中,在两个盘之间的间隔超过其半径,并且它们是可解析的。在其中两个艾里磁盘可以拆分成单独的实体的限制通常被称为瑞利判据。如图3(c)示出了两个艾里磁盘和在一个情况下的零阶最大值之间的中心到中心的距离小于这些最大值的宽度的强度分布,和两个盘都不能单独解析的瑞利判据。

在由物镜在形成图像,即变为可见的样本的更详细投射的艾里磁盘小。更高的校正(萤石和apochromats)的物镜产生较小的艾里磁盘比更低的修正物镜。以类似的方式中,具有较高的数值孔径的物镜也能够产生更小的艾里磁盘。这是高数值孔径和总校正光学象差的物镜所用的检体区分更精细的细节的首要原因。

图4示出的数值孔径的上成像的一系列相同焦距的假想物镜艾里磁盘的大小的影响,但不同的数值孔径。具有小数值孔径的艾里斑的大小是大的,如图4(a)中。作为数值孔径的一个物镜增加,并且光锥角然而,该艾里斑的大小减小,如图4(b)和图4(c)所示。在目镜膈肌水平产生的图像实际上是艾里磁盘这是我们所认为的光明与黑暗的马赛克。其中,两个磁盘过于靠近在一起,使得它们的中心斑点重叠很大,由这些重叠磁盘表示的两个细节都没有解决或分离并因此显示为一个,如在图3中所示的上方。

在图像形成理解一个重要的概念是由物镜截获衍射光线的性质。仅在较高的(第一,第二,第三等)衍射光的订单被捕获的情况下,可以干扰工作重新创建在所述物镜的中间像平面的图像。当只有零阶光线被捕获,这几乎是不可能重构样品的一个可识别图像。当一阶的光线被添加到零阶射线,图像变得更加连贯,但它仍然缺乏足够的细节。只有当高阶射线复合,该图象将表示检体的真实结构。这是基础的大数值孔径(以及随后的更小的艾里磁盘)的必要性,以实现高清晰度的图像,用光学显微镜。

在一天到一天的例行观察,大多数显微镜不要试图达到的最高分辨率图像可能与他们的设备。它只有在专门情况下,例如高倍率明场,荧光,DIC和共聚焦显微镜,我们力争达到显微镜的限制。在显微镜的大多数用途,这是没有必要使用高数值孔径的物镜,因为检体容易地解决了与使用较低数值孔径物镜。这是特别重要的,因为高数值孔径和高放大倍数都伴随着场的很浅的深度(这指的是良好的聚焦在区域正下方或者只是区域上方被检查)和短工作距离的缺点。因此,在标本,其中分辨率是不太关键的和放大倍率可以更低,最好是用温和的数值孔径较低倍物镜以得到具有多个工作距离和更多的景深图像。

台下聚光镜孔径光阑的仔细定位也以数值孔径和滥用此隔膜可导致图像劣化(如上一节中所讨论的控制临界台下聚光镜)。其他因素,例如对比度和照明的效率,也影响图像分辨率的关键要素。