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尼康显微镜:显微物镜的属性

2013-10-16  发布者:admin 

三个关键的设计特点的物镜显微镜的极限分辨率极限。这些包括用来照亮试样的孔径角的光锥物镜捕获,和对象空间中的物镜前透镜和被检体之间的折射率的光的波长。

properties figure1

图1中显示的是通过一个简单的双透镜的阿贝聚光照明显微镜的物镜的剖开图。光通过聚光镜被组织成一个光锥到样品上发出,然后被发送到物镜前透镜元件作为反锥形。照明锥的大小和形状是一个函数的组合的物镜和聚光镜的数值孔径。物镜的孔径角是由希腊字母θ表示,将在下面详细讨论。

的分辨率衍射极限的光学显微镜的最小可检测两个紧密间隔的样本点之间的距离可以被描述为

R =λ/2n(SIN(θ))

式中,R是分开的距离,λ是照射波长,n的成像介质的折射率,θ是物镜的孔径角的二分之一。检查方程中,很明显的,分辨率是成正比的照明波长。人的眼睛与在400和700纳米之间,它表示利用显微镜观察的大多数在可见光光谱的波长区域。分辨率也取决于成像介质的折射率和物镜的孔径角。物镜旨在图像标本与空气或前透镜和试样之间的介质的折射率越高。往往是相当有限的视场,和前透镜元件的物镜是放置在靠近试样与它必须位于光学接触。一个增益由约1.5倍的分辨率达到浸油取代的作为成像介质为空气。

最后,但也许是最重要的因素,确定一个物镜的分辨率是角的光圈,其中有一个实际的上限约72度(与一个正弦值0.95)。结合使用时的折射率,该产品

N(SIN(θ))

数值孔径(简称NA为已知的,对于任何特定的物镜的分辨率提供了一个方便的指标。数值孔径一般是最重要的设计标准(除倍率)时要考虑选择一个显微镜物镜。值的范围从0.1非常低倍率物镜(倍到4倍),以尽可能1.6高性能的物镜,利用专门的浸泡油。由于数值孔径值增加了一系列的物镜,相同的放大倍率,我们通常观察到一个更大的聚光能力和提高分辨率。显微镜应仔细选择一个物镜的数值孔径相匹配的放大倍率,在最终图像中产生。在最好的情况下,应充分扩大只是解决的细节,被视为与舒适,但到如此地步,不空倍率阻碍精细标本细节的观察。

正如在显微镜的照明的亮度是由聚光镜工作的数值孔径的平方,由物镜产生的图像的亮度,是由它的数值孔径的平方。此外,物镜放大倍率也发挥了作用,在确定图像的亮度,这是横向放大率的平方成反比。数值孔径的平方/倍率表示的物镜,当利用透射照明的聚光能力。因为高数值孔径物镜往往是更好的像差纠正,他们还收集更多的光线,产生出更明亮,校正后的图像高度解决。应该指出的是,图像的亮度迅速降低,提高放大率。在光线水平的情况下,是一个限制因素,选择一个物镜的数值孔径最高,但具有最低放大倍率能够生产足够的分辨率。

在装配过程中的物镜,镜头是第一战略间隔一圈坐在进入细胞坐骑,然后打包成一个中央套筒油缸内部安装的物镜桶。个别镜头安装镜头纺纱在精密车床夹头,其次是镜头锁定到位(或透镜组)用薄的金属边缘抛光黄铜肩靠在。球面像差进行校正,通过选择最佳的间隔物,以适应在较低的两个镜头支架(半球形和弯月形透镜)之间。该物镜偏光向上或向下翻译整个镜头群内套筒锁紧螺母,使安置物镜的倍数的物镜转换器可以互换不失焦。昏迷调整完成与三个中心螺钉,可以优化内部透镜组的位置相对于光轴的物镜。

物镜规格放大
消色差校正
放大 数值孔径 工作距离(mm)
4倍 0.10 30.00
10倍 0.25 6.10
20倍 0.40 2.10
40倍 0.65 0.65
60X 0.80 0.30
100×(油) 1.25 0.18
消色差校正
放大 数值孔径 工作距离(mm)
0.5倍 0.02 7.00
1倍 0.04 3.20
2倍 0.06 7.50
4倍 0.10 30.00
10倍 0.25 10.50
20倍 0.40 1.30
40倍 0.65 0.57
50倍(油) 0.90 0.40
100倍(油) 1.25 0.17
40倍 0.65 0.48
100倍 0.90 0.26
平常萤石校正
放大 数值孔径 工作距离(mm)
4倍 0.13 17.10
10倍 0.30 16.00
20倍 0.50 2.10
40倍 0.75 0.72
40倍(油) 1.30 0.2
60倍 0.85 0.3
100倍(干) 0.90 0.30
100倍(油) 1.30 0.20
100倍(油​​虹膜) 0.5-1.3 0.20
平常复消色差校正
放大 数值孔径 工作距离(mm)
2倍 0.10 8.50
4倍 0.20 15.70
10倍 0.45 4.00
20倍 0.75 1.00
40倍 0.95 0.14
40X(油) 1.00 0.16
60X 0.95 0.15
60X(油) 1.40 0.21
60X 
(水浸泡)
1.20 0.22
100×(油) 1.40 0.13
100X(油​​NCG) 1.40 0.17
NCG =无盖玻片
表1

有是物镜桶上刻了丰富的信息。简单地说,每一个物镜上登记的倍率(例如10倍,20倍或40倍等),其物镜旨在给出最好的图像(通常为160毫米或希腊的无穷大符号)管长和厚度覆盖玻璃保护标本,这是假设在校正球面像差(通常为0.17毫米),有一个恒定的值由设计者。如果物镜被设计成一滴油和标本之间,物镜上会刻上油或OEL或HI(同质浸泡)。后者指定这些在物镜上不刻的情况下,物镜上意味着要使用干燥,空气的最低部分的物镜和标本之间。物镜还经常随身携带雕刻的数值孔径(NA)值。这可能会有所低倍率物镜从0.04至1.3或1.4为高功率油浸复消色差的物镜。如果没有指定物镜进行更高的修正,通常可以假设它是一个消色差物镜。更高度纠正的物镜有铭文,如复消色差透镜或APO,FL,平常氟等旧的物镜,往往焦距(镜头到图像的距离),上刻桶,这是一个衡量的放大倍率。在现代显微镜,其物镜是设计为特定的光管的长度,因此包括在枪管上的焦距和放大倍率变得有些多余。

表1列出了工作距离和数值孔径作为功能的倍率四种最常见的类物镜:消色差透镜,平常消色差透镜,平常萤石,平常复消色差。需要注意的是干的物镜都具有用于液浸介质的数值孔径小于1.0,唯一的物镜设计值,超过此值的数值孔径。

当制造商的集匹配的物镜,例如,各种放大倍率(单表1中列出的物镜子集)的所有消色差的物镜,被安装在物镜转换器上,他们被通常设计投影约在相同的平面在体内的图像管中。因此,改变物镜旋转物镜转换器通常只需要极少使用微调旋钮重新建立大家关注的焦点。这样的一组物镜被描述为是齐焦,一个有用的便利性和安全功能。符合条件的物镜集的设计也是预定心,从而使视场中的一个物镜为中心的标本时,仍然为中心旋转物镜转换器带来的另一个物镜,使用。

多年来,大多数厂家的生物应用设计的物镜都符合国际标准齐焦距离。因此,大多数的物镜有一个齐焦距离为45.0毫米,并且被认为是可以互换的。一组新的设计标准随着迁移到无限远校正的管长度,出现在物镜与镜筒透镜的像差校正。加上需求增加更大的灵活性,以适应需要越来越大的工作距离与更高的数值孔径和视场大小,物镜来自不同制造商之间的互换性消失。这种转变体现现代尼康CFI-60光学系统,具有“无铬”的物镜,管镜头和目镜。没有一个被利用,以实现校正另一个单独校正的CFI-60系统中的每个组件。管子的长度设置为无穷大(平行光路)使用的管透镜,已增加至60毫米的齐焦距离。即使物镜安装螺纹尺寸已经改变从20.32至25毫米的光学系统,以满足新的要求。

properties figure2

在用光学显微镜的视场直径所表示的字段的视图数或简单的视场数,这是视的直径以毫米为单位表示,并在中间像平面测量。在对象(检体)的场直径平面上变为视场数除以物镜的放大倍数。虽然视场数的放大倍率和眼(目镜)视场光阑的直径往往是有限的,有明确的限制,这也是所施加的设计的物镜。早在显微镜物镜是有限的,最大的可用场直径约18毫米(或相当少的高倍率目镜),但现代的平场复消色差和其他专门的平场物镜的范围可以在22毫米和28毫米之间往往有一个可用场结合大视野目镜。不幸的是,有用的字段的最大数目一般不刻在物镜桶,也没有广泛显微镜目录中列出的。

没有任何明显的浓度变化在图像锐度的轴向范围内,通过该物镜可以集中被称为景深此值从低到高数值孔径物镜根本变化,通常随数值孔径的增加(见表2和图2)。在高数值孔径,主要取决于波光学景深,而在较低的数值孔径,几何光学“的错乱圆圈”占主导地位。字段的总深度由下式给出的波和几何光学景深的总和

ð TOT =λN/ NA 2 +(N / M×NA)É

其中,λ是波长的照明,Ñ成像介质的折射率,NA是物镜的数值孔径 M 是物镜的横向放大率,ë键是最小的距离,就可以解决由一个检测器,其被放置在图像平面的物镜。请注意,衍射限制的景深(方程的右手侧的第一项)缩小与数值孔径的平方成反比,而与第一功率的数值孔径的分辨率降低的横向限制。其结果是,由系统的数值孔径更轴向分辨率和光学部分的厚度的影响比在显微镜的横向分辨率(见表2)。

最接近的表面的玻璃盖和物镜前透镜的间隙之间的距离被称为工作距离在试样的情况下被设计成没有盖玻璃成像,工作距离的测量是在实际的试件表面。一般来说,工作距离减小了一系列的匹配物镜的放大倍数和数值孔径的增加(见表1)。可以查阅标本作为成像介质与空气的物镜应该工作距离尽可能长的时间,数值孔径的要求得到满足。浸没物镜,另一方面,应该有较浅的工作距离,以包含前透镜之间的浸没液体和试样。许多设计物镜有密切的工作距离有一个弹簧加载的回缩塞,允许前置镜头组件缩回推到物镜的身体和扭曲,将其锁定到位。物镜是旋转物镜转换器,所以它不会拖累整个表面的干净的玻片浸油这种配件是方便的。在相反的方向扭动回缩止动件释放的透镜组件的使用。在一些应用中(见下文)中,很长的自由工作距离是不可缺少的,和特殊的物镜是用于这样的用途而设计的,尽管在实现大的数值孔径和光学矫正的必要程度的困难。

properties figure3

物镜设计的一个最显着的进步,在最近几年的是,这有助于降低时出现的光穿过透镜系统的不希望的反射的防反射涂层技术的改善。每个未包衣的空气 - 玻璃界面能反映4%和5%之间,垂直于表面的入射光束,从而在垂直入射时的透射率值的95-96%。四分之一波长厚的具有适当折射率的抗反射涂层的应用可以增加这个值由三至百分之四。物镜变得更复杂的透镜元件的数量不断增加,需要消除内部反射,相应增长。一些现代的具有高度校正的物镜可以包含多达15个镜头有许多空气 - 玻璃界面的元素。如果镜片涂层,反射损耗仅轴向光线透过率值将下降到50%左右。单层一次利用透镜涂层,以减少眩光和提高传输产生的传输在可见光谱范围内的值超过99.9%的多层涂层,现在已经取代了。

场的深度和图像深度
放大 数值
孔径
景深
(微米)
图像深度
(毫米)
4倍 0.10 15.5 0.13
10倍 0.25 8.5 0.80
20倍 0.40 5.8 3.8
40倍 0.65 1.0 12.8
60倍 0.85 0.40 29.8
100倍 0.95 0.19 80.0
表2

图3中所示的光波反射和/或通过涂有防反射层的透镜元件的示意图。入射波取得的第一层以一定角度在图3中的层A),产生的光的一部分被反射(R(邻))的一部分被传输通过所述第一层。遇到的第二防反射层(B层,在相同的角度的光的另一部分被反射,并从第一层反射的光干扰。一些其它光波继续到玻璃表面上,在那里再次反射和透射。从玻璃表面的反射光干扰(和相消)与防反射层反射的光。防反射层的折射率的玻璃和周围介质(空气)的变化。由于光波通过的防反射层和玻璃表面,大部分的光(取决于入射角-通常的光学显微镜中的透镜法线)最终透过玻璃集中以形成图像。

氟化镁是一种利用薄层的光学增透膜的许多材料,但现在大多数显微镜制造商生产自己的专利配方。总的结果是在对比度和可见光波长的传输并发的破坏性干扰,在位于传输频带之外的频率谐波相关的显着改善。这些专门的涂料可以由操作不当容易损坏和显微镜应该意识到这个漏洞。防反射多层膜有一个稍微偏绿色调,而不是单层涂层的略带紫色的色调​​,观察,可以被用来区分涂料。内部镜片上使用减反射膜的表面层往往比相应的涂层设计,以保护外部镜片表面柔和得多。清洁光学表面已经涂有薄膜,特别是如果在显微镜已被拆解和内部镜头元件受到审查时,应采取非常谨慎。

properties figure4

被定义为从透镜中心的距离平行光线的光轴上(通常被称为主要的焦点集中到一个点的透镜系统的焦距被称为主要焦点的假想平面垂直于透镜系统焦平面的。每一个镜头有两个主要的焦点为光进入每边,一个在前面,一个在后面。按照惯例,被称为前焦面更靠近所述前透镜元件的物镜焦平面和焦平面位于后面的物镜被称为后侧焦点面(参见图4)。后侧焦点面的实际位置的变化与物镜建设,但一般是位于高倍率物镜的物镜桶内部的某个地方。低倍率的物镜往往有一个外部桶,坐落在线程区域或显微镜物镜转换器内的后焦平面。

由于光线通过一个物镜物镜的,它们被限制由后孔或出射光瞳的物镜,如在图4中示出。这个光圈的直径12毫米低倍率物镜之间下降到约5毫米,最高权力的复消色差物镜。光圈大小是非常关键的外延照明应用,依靠物镜上充当成像系统和聚光镜,出瞳也成为入瞳。的图像的光源必须完全填满整个视场的物镜后孔径,以产生均匀的照明。如果光源图像比孔径小,视场照度不均匀的体验暗角。另一方面,如果光源的图像大于后孔,一些光不进入物镜的照度降低。