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徕卡显微镜:荧光显微镜介绍

2013-10-16  发布者:admin 

荧光显微镜的光学显微镜是一种特殊形式。它使用目标波长的光激发后发射光的荧光染料的能力。蛋白质的利益可以通过抗体染色或荧光蛋白标记的荧光染料标记的。它允许一个单一分子物种的分布的测定,其量和其在细胞内的本地化。此外,可以进行共定位和相互作用的研究,观察到的离子浓度,使用可逆地结合染料,如Ca 2 +和呋喃-2和内吞作用和胞外分泌的细胞过程,如观察。今天,它甚至可以将图象分的帮助下,荧光显微镜的分辨率的颗粒

斯托克斯位移

荧光的一个重要特点是斯托克斯位移。它描述了一个令人兴奋和发射的光子的能量水平的差异。由荧光发射的光子是一个令人兴奋的光子的波长比更大。这是由于被激发后的荧光染料,但在此之前发射的光子的能量释放到周围环境中。由此产生的波长偏移,使得它可以令人兴奋的和出射光之间的区分。可以被看作是具体特征的分子物种的吸收和发射的能量。

荧光显微镜

直立或倒置荧光显微镜()是类似于一个普通的光学显微镜下,除了用激光为单色光或水银灯或氙弧灯像一个充满生机和强大的光源提供照明。此外,它还包含一个激励滤波器和发射滤波器。激发滤光片传输只能够激发试样,用其特定的染料的光。由样品发射的光到达检测器之前,通过发射滤光片。由样品发射的光到。只与一个不同的波长的光的透光性,例如由试样发出的光的发射滤光片

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 1:通过荧光显微镜的光路

 

近年来,发光二极管(发光二极管)也被用作光源,用于荧光显微镜。由LED发射的光的波长取决于用于生产的材料。然而,在大多数情况下,需要的激发光滤光片,因为LED通常在一个相当宽的波长范围内发射光。

大多数荧光显微镜落射荧光显微镜。照明器和物镜被定位在试件的同一侧,并通过试样的光不通过。除了激发和发射滤光片,分色镜,需要为这种荧光显微镜。甲二向色反射镜,使目标波长的光通过,而其他波长的光被反射。过滤器和分色镜经常一起插入在过滤器中的多维数据集。

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激发光通过激发光滤光片和分色镜。这反映了对试样的光通过物镜。标本中的兴奋和荧光染料发出的光子。这个发射光线通过客观的分色镜。所发射的光具有适当的波长,并且能够通过。由试样反射的激发光,无法通过二向色镜,会被阻塞。如果激发光能够通过分色镜将被阻塞,当它到达发射滤光片。可以测量的检测器的发射过滤器的光通过。 

在荧光显微镜中使用不同类型的过滤器。带通,长传和短通滤波器可以区分的。传输的频带的波长带通滤波器,而具有更大或更小的波长的光将被阻止。长传和短通滤波器边缘过滤器。长通滤波器的长波长的光传输。与目标的截止值以上的波长的光将无法通过。相比之下,短通滤波器传输短的波长,并阻止长

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 3,绿色荧光蛋白转基因小鼠胚胎

 

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 4:荧光原位杂交染色体。红色:TRITC,蓝色:CY5,绿色:FITC

 

在荧光显微镜中的不同的技术

荧光显微镜被广泛使用,并提供了巨大的特异性。的各种技术使人们有可能以解决不同的问题,甚至规避,阿贝描述的衍射极限。

可确定的分子物种的本地化与助染色的细胞器,如细胞骨架或膜。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM),使得它可以观察到在该样本中没有信号从外部的焦平面的区域,并允许光学切片。全内反射显微镜(TIRF)是一种技术,它允许接近到细胞表面的薄区域的观察。在这方面的一个渐逝场激发的荧光染料。

观察一个分子物种的动态变化的一种技术是荧光漂白后恢复(FRAP)。在一个受限制的区域的荧光染料的光漂白和未漂白的分子的扩散,进入此区域可以测量。荧光能量转移(FRET)的显微镜,可以进行交互研究。一个兴奋的捐助生色团的能量转移到受体荧光激发它。如果两者都汇集了非常密切的,这是唯一可能。如果这些染料被耦合到不同的蛋白质,它们只能够传递能量,发出荧光的蛋白质,如果彼此交互。  

技术,使受激发射损耗(STED)显微镜,地面状态消耗(GSD)显微镜,单分子和基态耗尽显微镜由单个分子的回报(GSDIM),光敏定位显微镜(PALM)和随机子高分辨率图像光学重建显微镜(STORM)。子显微镜用于这些技术也被称为作为nanoscopes,因为他们解决在纳米尺度的图像。

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 5:Pukinje的细胞,矢状节三重标记小鼠小脑皮质。红色:anti-calbindin-D28k/Cy3,绿色环保:,蓝色anti-GFAP/Cy5:赫斯特33258

 

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 6:鼠标组织切片,自发荧光,荧光寿命microcsopy(FLIM)



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