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尼康显微镜:活细胞显微漂移校正焦点

2013-10-16  发布者:admin 

直到20世纪80年代末,大多数生命科学的研究生物的结构复杂的细节,捕捉各种使用固定和染色标本(实际上,非生物)的细胞学特征的单一快照。然而,在过去的几十年中,在生物科学和医学的研究已经在很大程度上转移了重点调查浩大的时间尺度上,从几毫秒到几小时不等的生命系统的分子,细胞和整个生物体水平上发生的动态过程。过渡到活细胞成像的司机已经先进的显微仪器和更敏感的数码相机的发展,以及新的合成和基因编码的荧光基团,能够针对特定的细胞器,具有精度高。因此,已经在很大程度上取得了单杆固定,死细胞的显微照片和数字图像时代的活细胞成像,使用广泛的合成探针,量子点荧光蛋白,维持细胞在显微镜舞台上的焦点长时间是一个关键任务的因素。

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时间推移活细胞成像技术在透射光荧光显微镜的应用越来越也许是最好的证明了数量浩繁的研究报告,几乎每天在科学文献中出现。在大多数情况下,细胞活性监测在组织培养中的成像腔室专门设计的显微镜载物台,使用荧光探针耦合到顺序的图像捕获技术。可以采用广泛的在长的时间期间内的标本作为连续序列的用于记录的动态对比增强的高级技术,如微分干涉相差(DIC),相衬,暗场,荧光,和Hoffman调制反差(HMC)。同样,更先进的荧光技术,包括激光扫描共聚焦,旋转盘,多光子,和全内反射显微镜TIRF)越来越多地被用来监测细胞内过程,随着时间的推移。

除了 ​​其在细胞生物学中的重要性,时间推移成像也可以用来研究广泛的液体样品和固体材料在化学,工业,和地质系统,以及液晶的相变和结构分析的新的和先进金相材料。时间推移成像(也称为cinemicrography在基本的生命科学领域,已被证明是一种有效的工具,调查粒子的运动,分子间的相互作用,细胞迁移,细胞分裂,细胞器动力学,细胞凋亡,分化,神经过程的产物,而其中新的和有前途的应用程序的主机。最近,发展跨越整个可见光谱的荧光蛋白的革命已经导致发现无数的动态细胞内事件随着时间的推移,只能通过观察调查。

图1给出的是从一些更加有用和流行的时间推移成像对比增强技术,在活细胞显微镜的例子。粘附印度麂鹿皮肤成纤维细胞在图1(a)所示,在DIC模式成像,可视化应力纤维细胞骨架的产物。相衬成像袋鼠大鼠肾上皮细胞(PtK1线)图1(b)中揭示了一个双核细胞产生的中止细胞分裂,而个别人成骨肉瘤(U2OS线)细胞被捕获成功的分工与HMC图1(c)。这些功能强大的透射光技术被广泛利用时间推移活细胞成像。同样,激光扫描荧光技术和旋转盘共聚焦显微镜(图1(d)中DEOS荧光蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中,和图1(e)中,EGFP-标记在HeLa细胞的内质网)可以采用数的观测,包括光活化,共振能量转移(FRET),光漂白技术,运动性,荧光蛋白分布的动态。全内反射荧光显微镜(全内反射萤光显微镜,图2(f),示出mCherry融合到纽蛋白狐肺成纤维细胞中的荧光蛋白)的事件发生在细胞膜附近的盖玻片。

时间推移成像的历史透视

报道时间推移成像在活细胞中的首次应用在100多年前(大约五年之前,查理·卓别林他的第一部电影),由一位年轻的法国研究生在梅毒螺旋体检查蠕动。学生,让Comandon耦合到一个更小的暗视野显微镜,一个复杂的配置期间使用一个巨大的电影胶片相机拍摄的图像序列,但认为很简陋,按现代标准。在二十世纪后半期,通常采用紧凑型16毫米相机配备相衬照明显微镜时间推移图像序列的。由笨重的辅助intervalometers的,,可将灯泡的装置,打开和关闭,以避免过度的照明和加热的标本的图像之间的连续的图像捕获之间的时间间隔的控制。光源电子显微镜百叶窗市售直到20世纪80年代。

早期时间推移依靠胶片相机的成像技术受到一些陷阱。最重要的是,这部电影被发送出去(在大多数情况下),商业处理,这意味着可能会延迟几天甚至几周,实验结果的评价。此外,膜的使用是昂贵的,并可能会到一个主机的处理变化,通常导致不一致的结果。例如,暴露的错误可能不会被发现,直到几个星期后,实验已得出结论,焦点漂移的常见的问题往往是不可检测的,直到处理过的膜被看过。虽然很多时间推移成像,如焦点漂移,试样加热不均匀和振动相关的文物,仍然妨碍用现代数码相机的最终结果时,该技术已在过去十年显著成熟。

视频管摄像机和图像采集卡的电脑卡时发生的第一次重大进步时间推移cinemicrography中终于整合与显微镜,在20世纪70年代开始。虽然由视频摄像机产生的图像是较低的分辨率比传统的基于乳液的膜,与胶片相机的曝光设置的不确定性显着降低。作为一个额外的好处,对图像序列可以被视为在收购过程中,和一个较长的时间推移实验的结果是立即可用的审查和编辑使用的录像带输出。相比较而言,耦合到一个录音机摄像机的成本显着小于胶片处理的费用被认为是一个电影时的电影摄影机。相对于膜的录像带的复制成本也少得多,磁带含有不良序列可以被擦除或覆盖放回生产。

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活细胞动力学的一个例子是图2中使用photoconvertible 光学荧光笔荧光蛋白标记的线粒体。标本是一个坚持的兔肾上皮细胞培养(RK-13 ​​线)红-的绿色photoconvertable DEOS到线粒体靶向肽序列的荧光蛋白融合表达。用488纳米的激光照射后,丰富的线粒体,整个细胞质中观察到(图2(a))的绿色荧光。一个单一的线粒体位于长filopodium在是使用一个简短的脉冲光转换,从405纳米激光在第一帧。新红色荧光的细胞器被捕获后,未转换的线粒体途径(图2(b))的时间间隔为20分钟。粉碎后,使未转化的线粒体密切的光转换邻居(图2(c)),两个线粒体其后的保险丝(图图2(d))的光转换的荧光蛋白标记细胞器之间的分布的方法。的第二碎片事件后(图2条(e)),一小部分的光转换线粒体接近的第二未转化的线粒体,但,而不是定影,形成一个环形(图2(f))。在图2所示的帧选择从时间推移序列含有超过1000个在2小时内收集的图像。

虽然越来越多的研究者开始参与时间推移活细胞利用荧光蛋白质序列采集,数字静止图像记录长时间在细胞培养的动态事件继续被广泛采用。在许多情况下,间歇性的单一的图像可以被捕获,具有改进的信号与噪声的使用更大的照度水平比是可行的串行时间推移成像在更高的分辨率。然而,技术的迅速发展,计算机体系结构和数据存储能力,推动时间推移cinemicrography到一个新的水平。上一页主存储器中的局限性,已克服了快速缓存,处理器速度和硬盘驱动器的能力,使复杂的含有数千帧的图像序列,组成几个GB,可以存储在本地的主机计算机上。硬件的进步已经由新的和复杂的软件套件能够控制几乎所有方面,包括高速图像采集阶段,运动,光照强度,曝光时间(和其他的相机参数),辅助的光学元件(如DIC棱镜平行光路)和波长。最先进的软件也可以进行收购后的图像处理,增强的视频功能。在简单的系统中,中等性能的计算机可通过一些接口来控制科学级数码相机。

现代的专门的荧光显微技术,包括激光扫描共聚焦,旋转盘,全内反射荧光,和多光子耦合到新兴电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)技术的进步,已使科学家能够观察到了广泛的动态事件,利用新开发的荧光针对特定的细胞区室,生物分子和受体蛋白的探针。通过采用这种先进的方法,多个事件可同时被记录,可在四个或更多的尺寸(横向,轴向,时间和光谱)在一个选定的时间内进入细胞内的活性,提供一种非侵入性的窗口。此外,活细胞成像技术已经导致了当前的革命,这是科学家提供空间和时间的信息是以前无法在细胞生物学。

焦点漂移的起源

尽管各种各样的技术进步,在过去几年发生在光学显微镜,标本对焦缓慢变化的过程中,时间推移成像表现轴向波动仍然是一个重大的问题。焦点漂移的术语经常被用来描述的显微镜不能保持在一个延长的时间内选定的焦平面。此构件是独立发生的自然运动的活标本,主要影响的因素,下面列出了一些。在一般情况下,重点漂移更是一个问题,当使用高倍率和数值孔径的油浸目标(有一个非常浅的景深),比它低倍率(10倍和20倍)具有更广泛的震源深度的目标。

  • 热漂移 -焦点漂移温度变化也许是最常见的来源。作为一个结果,在实验室中的空调和中央加热单元,在显微镜上的强烈的照明光源,以及受热不均目标和阶段产生的温度波动通常是主要的焦点漂移的罪魁祸首。此外,差的膨胀和收缩率的材料用于构造培养室和/或显微镜光学列车可能会导致物镜前透镜与盖玻片之间的距离的变化,导致失焦。具有最高的倍率物镜,只是一个度的变化往往足以产生在焦平面上的偏移在0.5和1.0微米之间。

  • 盖玻片的Flex -热梯度和其他变化,在培养室的温度,以及与迫使流体通过灌注过程中的摄像室的工件,可以制作试样反弹的重点盖玻片弯曲膜片效果此神器往往是明显的在灌注系统控制不佳室。盖玻片弯曲可能不存在重大问题灌注会话之间可以是交错的情况下,图像采集序列,但它会严重影响这些研究需要相对较高的时间分辨率(2秒或更少)。盖玻片的弯曲可以通过减少灌注输入端口的直径在流室,和装备在显微镜用客观的加热器,补偿室温度波动最小化。盖玻片小,但重现性好,运动也可能发生在文化室配备,透明导电涂层,以维持温度。在这种情况下,施加电流负载的涂布盖玻片可以产生收缩或扩展暂时打乱焦点。正确的焦平面通常会被重新建立,一旦电流负载被删除。

  • 成像室加热不均匀性 -活细胞成像腔中产生各种各样的配置,通常使用完全不同的技术,保持在恒定温度下的试样。例如,设有加热用导电涂层的盖玻片(图3(a))的腔室通常在整个玻璃表面产生卓越的热一致性比腔室,热只盖玻片的周边周围的金属。在后一种情况可能是巨大的热梯度(图3(b))。此外,高数值孔径的油或水的浸入目标可以作为一个接收器进行从试样腔室并进入金属目标的热量带走,这样就产生了在该区域的液浸介质的热梯度。其他文物,如电流从电源和室温大幅波动变化也可以负责标本室加热违规。

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  • 振动 - 与众多的起源-一种常见的神器,振动往往会产生各种器乐配置相关的元素,除了在周围环境产生的来源。在显微镜和配件,过滤器车轮,百叶窗,自动阶段,过滤器的炮塔,和其他机电运动部件,是一种常见的振动源,干扰稳定的聚焦。常见的外部(非显微镜)振动源是空气处理系统,客流量,冰箱压缩机,电梯,重型设备附近的成像设置的议案。隔离表,减震垫,台式平台,从各种各样的分销商的使用,是有用的,以减少振动。

  • 机械不稳定性 -满载目标的物镜转换器3和5磅重,这往往代表了显着的引力涉及显微镜对焦机构的机械部件上的应变。因此,重点漂移可能发生,只是由于物镜转换器上的引力。此神器可以只使用一个单一的目标,记录的时间推移录像,在一定程度上缓解。此外,它是明智的,以确保(如果可能),配备有具有短的机械长度的精密聚焦系统的显微镜,聚焦张力控制以维持适当的设置。机械不稳定性的其它来源包括松散的齿轮组,在焦点机架或冷凝器的支柱,以及辅助元件。

  • 沉浸媒体波动 -在高分辨率活细胞调查的时间推移实验,在显微镜目标可能需要浸泡介质油,水,甘油组成。需要收集到足够的数据,粘度波动和化学分解的成像介质在长时间浸没介质的属性和传播的影响。浸没油的粘度和折射率也常常依赖于温度和水容易蒸发,是必须考虑的因素和监视,以避免焦点漂移。新开发的高性能有机精油可在广泛的折射率(包括水和甘油是相同的值),并提供优秀的解决方案,采用传统浸泡媒体。在某些情况下(取决于成像室配置),垫圈或管道可以利用形成的目标和盖玻片之间的密封,以减少水蒸发的水平。

  • 添加试剂 -许多调查需要改变培养基或添加化学试剂时间推移成像序列的。引入到培养室中的试剂的实际行为,可以产生机械冲击,这将导致在焦点漂移,加入试剂,不作为成像介质在相同温度下,可以产生类似的效果。在加热灌注系统中,引进的新的媒体或化学品产生的轴向聚焦平面的显着的改变,但加入一个开放的腔室,使用移液管或注射器的液体,可以扰乱焦点。

  • 侧向阶段呈 -在某些情况下,房间内的温度波动或振动会产生一个小的横向 - Ý)翻译的机械载物台,(在某些情况下)会导致轴向聚焦漂移。这通常是一个微不足道的问题,但可以成为严重的,如果一个开放的管道推动直接在显微镜上的冷或热空气。如果阶段都配有一个夹子,它应该被启动,开始时间推移成像之前,但除此之外,也有一些补救措施。先进的显微镜阶段,采用步进电机一般不影响由横向移动文物。

  • 不安全标本室 -试样成像室运动在时间推移顺序可能会导致焦点漂移由于盖玻片到新的位置。适配器固定玻璃底培养皿舞台光圈在第二阶段,在盘位置的变化可能发生的结果柔性钳或干扰电线和气体/液体腔油管连接控制器和其他机械制品,如辅助元件。此外,经常遭受多井成像室时从轻微安置变化连接到单独的盖玻片每口井,导致聚焦误差,同时扫描板。商会的运动和盖玻片高度不一致是一种常见的定期神器,必须加以解决。

  • 标本运动 -活细胞成像的一个不可避免的神器是远离的标本在显微镜焦平面的运动。这通常发生在收集贴壁细胞进行有丝分裂,细胞显着改变形状,在中期时间推移序列。在其他情况下,试样完全可以移动的视场,可以通过分离盖玻片或通过蠕动。除了 ​​使用凝胶和试剂,如纤连蛋白,锚定的细胞和组织的盖玻片,有没有机械,化学或电气补救办法试样移动。

焦点漂移的解决方案

多年来,纠正焦点漂移的最佳解决方案是到车站学生或技术人员在显微镜附近,以提供手动重新聚焦在必要时。不幸的是,这是一个相对成本太高,基本上是无效的解决方案,那肯定是不适合长期的成像实验。通过多种途径,包括软件算法,硬件专用的显微镜​​,防震衬垫和表,并包围在一个保护环境(如在图4中示出),在显微镜焦点漂移的问题已得到解决。在这些方法中,得到不同程度的成功,但都没有提供一种通用的解决方案,可以扩展到几乎任何活细胞成像场景的焦点漂移。

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对热不稳定,这也许是最重要的焦点漂移源,可以在很大程度上消除了大的有机玻璃外壳(被称为环境试验箱 ;图4(C))绝缘显微镜,从外部环境,也提供了良好的条件,促进日志期的细胞生长。的保育箱式的外壳包围,几乎涵盖整个显微镜和标本的显微镜载物台,目标,荧光过滤器,和传输的光线的聚光。这些房间可以使用与多种文化的容器,包括标准培养瓶,培养皿,安装盖玻片显微镜载玻片和各种各样的开放式和封闭式的成像室。与外部加热单元(通常强制空气)和二氧化碳的浓度来控制的感测单元,其耦合到一个稳压器,它的输入由纯气体的气缸的温度被保持。

环境室配有湿度控制等多种设计方案也可以提供橡胶手套访问操纵细胞时,在成像过程中对环境的平衡,以避免干扰。为了维持高度的温度控制,以避免焦点漂移,一些更复杂的孵化室括几乎整个显微镜目镜,摄像头,lamphouses异常。在下行路上,环境试验箱可以阻碍快速访问标本和繁琐的重复操作时是必要的。此外,腔室内部的高湿度水平可加至维持齿轮润滑油过早降解和氧化的金属表面和透镜涂料由于仪器费用。作为替代方案,耦合阶段的最佳孵化器的目标加热器可以使用,但这些设备并不总是具有难以去除的保护桶浸入目标兼容。

在过去的几十年中已经制订了一些软件算法,以解决基于对比度或边缘检测的焦点漂移。许多这些最终被纳入科学的设计也处理图像和控制显微镜的成像软件包。软件控制的焦点漂移需要在显微镜配备了一台数码相机和电动物镜转换器在计算机控制下。通常情况下,重点调查的基于软件的显微镜需要两个互补的算法来实现聚焦控制。首先建立一个客观真实的焦点的轴向(z)的位置之间的对应关系第二个是一个搜索算法(图5),样品的焦平面,所捕获的图像,以确定最大聚焦“分数”(最佳位置)的位置。然而,大多数软件控制重点开发的算法,已建立使用静态的标本具有稳定的几何和动态活细胞时间推移调查时,适用于远低于有效。此外,该算法通常是优化的一个特定的照明情况下(明场,相衬,等),可能会失败时,适用于对比度增强技术(如荧光),它们并没有设计。

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软件聚焦算法一般依赖于一个事实,即良好的聚焦图像中含有较多的对比度或重点比图像更精细的细节(实际上,更高的频率)。作为一个例子,使用拉普拉斯算子来估计焦点时,该算法计算图像样本的二阶空间导数,向上或向下移动的目标由一个预先确定的量,然后重复该过程,直到确定最适合。越来越小的步骤通常是在两个方向上,在分析过程中。从过滤器的输出值表示大的强度的变化,这通常表示一个图像内的边缘区域。在任何图像,最高的频率成分发生在边缘,当试样是优化的重点,应该是最突出的特点。为重点的漂移,边缘模糊,在图像上产生较低的二阶导数。直到确定最合适的重复采样。这通常需要几分钟的时间,只有那些时间推移实验需要使用较长的时间间隔拍摄图像之间的降级软件重点例程。

在共聚焦时间推移显微镜,每一个形象仍然是大家关注的焦点,无论仪器是否遇到轴向漂移,对焦校正可以通过定期收集了一系列从标本z栈的(光学部分)的厚度,不论。各个堆进行分析,然后使用软件来确定Ž堆栈中的每个图像的参考图像的记录,可在该序列的开头之间的Pearson相关系数堆叠分析后,具有最大相关系数的图像的像素强度是用来识别正确的焦平面(对应的参考图像的平面)。共定位信息可以被用于重置的焦平面上的目标。虽然这种技术应该工作得非常好,提供的软件和硬件正确连接,目前还没有商业应用。

从理论上讲,荧光标本应使用软件算法产生极好的效果,由于之间有极高对比度的明亮的荧光结构和黑暗的背景。然而,在实践中,基于软件的补偿技术需要基于捕获图像的几种荧光物种,这可能会导致光漂白和光毒性加重每次曝光时与试样光的效果的计算。此外,该算法确定重点用清脆的生产工具集中的轴向焦点位置(如共聚焦,多光子,DIC)光学部分,无论实际上是无用的。使用软件时,保持焦点另一个缺陷是,该算法往往能决定一个最佳的,不同的是开始时选择的时间推移序列从初始平面的焦平面。当使用组合的荧光与软件确定聚焦算法,另一种方法是用试样的透射光图像进行聚焦分析步骤。然而,这需要应用机械快门的荧光和透射的光路中,可引入额外的振动。

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图6中所示的两个时间推移进行没有任何焦点漂移校正(图6(a),图6(b)和图6(c)),或基于硬件的焦点维护系统的,如下面所讨论的序列(图6(2),6(e)和(f)条)。样品是狐肺癌(FoLu线)成纤维细胞的培养,表达的mPlum荧光蛋白的融合产生的明亮的荧光的细胞器线粒体靶序列。图像聚集在的组合荧光和DIC模式在30秒的时间间隔超过7小时内共聚焦显微镜操作。如果没有自动对焦系统,在显微镜迅速失去焦点,证明荧光强度在图6(b)和图6(c),其中发生在不到45分钟内连续亏损。相比之下,硬件自动对焦管理产生锐利,整个调查的良好聚焦图像(图6(四)通过图6(f)条)。

焦点漂移补偿系统

多年来,已开发了一些基于硬件的解决方案,以补偿焦点漂移。在大多数情况下,这些设备试图测量的目标和试样夹持器或阶段之间的距离,以保持试样在很长一段时间的焦点。例如,涡电流传感器连接到显微镜的物镜转换器的设计是由一个发明者监视的距离的阶段,使用的直流电动机耦合到聚焦机构的正确的波动。另一种技术利用的试样夹持器和领子连接的目标,以提供支撑的试样夹持器的压电元件的误差信号之间的距离相关的电容。第三,更复杂的方法依赖,全息光栅放置在客观瞳孔保持标本的焦点。专门的光栅产生两个散焦的第一,被检测到的图像由单独的传感器来产生聚焦校正信号。最后,纳入到现代的硬件解决方案的前体使用两个光电二极管阵列的离轴的氦 - 氖激光束被定向到一个小的棱镜放置在光学列车和监测的背面反射的焦点依赖性变化。自发漂移的焦点被检测为一个非零的差信号,然后将其用于驱动一个简单的电机连接到细焦点的机制。虽然这些硬件焦点补偿方案在不同程度上取得了成功,都没有看到值班商业显微镜系统。

作为一个通用的方法来提高显微镜聚焦稳定性,制造商已经花费了相当大的努力来生成工程改进焦点漂移降低到最低限度。例如,一些嵌入式的机械系统(对焦组件,百叶窗,电动平台,炮塔旋转)的改善,重目标的问题得到解决。仪器帧正在制作专门合金的是耐热膨胀的,而辅助元件如物镜转换器正在与耐热聚合物。这种改进已经加上先进的线性编码器,机动阶段或物镜转换器组件,可以搬迁到一个精确的位置精度优于50纳米。即使这些改进导致了先进的显微镜,可以保持注意力集中于一两微米或更长的时间内,它们仍然无法克服的事实,加热试样室(以及它们的相关联的盖玻片)热膨胀和收缩,导致备份到原来的焦点漂移问题。

为了解决热漂移文物固有的几乎所有基于盖玻片成像室,显微镜和厂家售后最近推出新的硬件解决方案,以弥补焦点漂移雇用几个有所不同,但仍密切相关的方法。一个重要的一点要注意的是,与浸没目标,其中的大部分设备基础上进行操作的假设下观察试样,并在盖玻片的水性表面之间的关系是固定的(因此,细胞或薄的组织是不自由浮动在培养液中)。相反,无论是自然粘附在玻璃上的细胞或组织(例如果蝇卵室)或通过,层粘连蛋白,纤连蛋白,多聚赖氨酸,或糖蛋白的薄层连接到盖玻片。所有的市售系统定位上的外部盖玻片表面(玻璃及组织培养基或缓冲液之间的界面),通过测量弱的近红外线激光或发光二极管(LED所发出的反射光的位置的形状的线图案;图7中所示)。相反,对于干燥的目标,从盖玻片的下表面(与空气接触)的光反射是用来确定试样是否是关注的焦点。

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插图图7图焦点漂移补偿系统如何能够利用从盖玻片衡量相对焦点位置的光的反射。试样中感兴趣的一个区域是用于由操作者设定的初始偏移量,其中规定的焦平面上,并作为补偿(图7(a))的基础上盖玻片表面。当焦点漂移时(在此,更接近客观的盖玻片的轴向运动,如图7(b))的结果,检测到的强度的激光或二极管反射从盖玻片提供所需的信息来重新定位目标,并恢复偏移补偿。因此,电动轴向对焦单元接收的反馈补偿系统,以纠正检测到的漂移在盖玻片,然后恢复到预定义的轴向值偏移,提供锐聚焦的试样(图7(c)和图7(d) )。请注意,试样本身是不参与聚焦校正,而上面的玻璃 - 水界面的反射控制这些设备所产生的干涉图案。

的一个流行的,廉价的售后商业聚焦校正系统的操作,通过测量从盖玻片使用全内反射的近红外LED光源的反射率的。这种设计在操作时非常有效地使用高数值孔径物镜(1.4或更高)一起可被改进​​的聚焦控制电机,以任意显微镜帧。在使用全内反射以评估焦点的主要限制是绝对的要求非常高数值孔径的油浸目标,以实现聚焦测量光束的入射角的临界角。缺水和水浸泡的目标,具有更小的数值孔径,物镜的数值孔径必须显着高于试样及其周围介质中沐浴在生长的活细胞(约1.33至1.38的折射率这一事实,本变形例中,由于不适合或成像介质)。因此,虽然适合高分辨率活细胞成像调查的大多数,这个装置是不是适用于水浸泡的情况下,或进行高通量的考试,涉及多孔板和干目标是至关重要的。另一个售后市场产品采用一个高分辨率的传感器(5纳米的精度)来衡量,以确定聚焦的物镜前透镜和被检体之间的间距。在该装置中,安装在目标的目标线程和物镜转换器之间安装一个压电纳米定位。的纳米定位的运动范围是大约100微米,这是足够的,提供了广阔的焦距范围。

各大显微镜制造商在过去几年已经出台一些商业焦点漂移补偿装置。所有这些系统的目的是利用近红外光反射从的盖玻片媒体接口在活细胞成像室确定的目标之间的距离和盖玻片,但没有一个是适合使用高折射率的介质中固定的标本(接近1.5,的值大多数盖玻片)。在操作过程中,通过专用的光学系统,其与主显微镜的光学列车相交源自激光或LED的线状光,由物镜聚焦上支持下观察细胞的盖玻片和介质之间的界面。从该界面的反射光,然后传送到校正光学系统的焦点和一个专门的,集成的电荷耦合器件(CCD的表面上CCD所获取的反射光的强度和位置的基础上,该软件的反馈系统建立的玻璃-水界面或物镜焦点之间的关系。

激活后的焦点校正硬件,操作员可以引入一个偏移移动物镜焦点的选择区域内的检体的界面处,同时保持相同的参考点,从而提供清晰的对焦的试样,在一个特定的界面距离的(见图7)。因此,偏移值被定义为物镜的焦平面之间的距离和水玻璃(或玻璃-空气)接口边界。根据制造商,这些重点补偿系统能够监测和纠正焦点漂移在不同的时间尺度上,从几毫秒到10秒或更长时间不等。这提供了一个明显的优势,在基于软件的聚焦补偿例程。此外,在大多数情况下,注重漂移补偿参数可以被定义在坐标漂移校正图像采集,以及将与其他外围设备,如快门,滤光片轮,电动载物台的显微镜控制软件。

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长期聚焦漂移硬件补偿之前和之后的一个例子是图8中的(一)。该标本是贴壁培养的人类肿瘤细胞(HeLa细胞线),与EGFP融合了人α -微管蛋白的标记图像被抓获一个60X的油浸物镜旋转盘共聚焦显微镜的荧光照明下,在4分钟的时间间隔四个小时。在饲养细胞在盖玻片的温度被保持在盖玻片周围的金属的元素嵌入在一个电阻的加热腔室。在显微镜实验室温度下降一摄氏度,每小时的速度。过一段时间240分钟,没有硬件补偿,焦平面的轴向位移约2.8微米。相反,在硬件焦点漂移校正,焦平面的精确度约200纳米,在相同的时间内保持。图8(b)表示打开检修门平衡至1分钟,为期37摄氏度的环境室的影响。请注意突然浸在轴向位移(约3.4微米),温度冲击的结果发生。

国家的最先进的聚焦漂移补偿硬件的一个例子是尼康完美的对焦系统(PFS),这是融入轴向控制硬件的Ti-E系列倒置显微镜(如图9所示)。广泛的干式和油浸目标,从4倍到100倍,具有不同数值孔径,可以采用的Ti-E-PFS仪器聚焦补偿。于加油站的目标的工作距离范围覆盖120微米至超过15毫米,得到高度的通用性。近红外线LED 870纳米和加油站所使用的CCD行传感器被安置在一个专门的物镜转换器单元(图9),不需要无穷大的空间,使主显微镜的光学列车继续致力于成像。其中最先进的功能的尼康PFS为5毫秒(200赫兹)的采样率,这是独立的显微镜和相机控制软件,大大快于其他系统,必须反复探测盖玻片接口到焦平面利益。利用长波长的LED,可以使用在340和750纳米之间的波长范围内发射的荧光团的Ti-E-PFS。此外,加油站可以使用种类繁多的对比增强成像模式,包括明场,相衬,霍夫曼调制相比之下,DIC,广角荧光,激光共聚焦,TIRFM,旋转盘,和线扫描后掠场。

上述的的聚焦漂移校正系统的设计主要是容纳在专门的成像腔室盖玻片的厚度范围从150到180微米(#1或#1.5盖玻片)配备图像的活细胞。其他标本可能要困难得多观察焦点漂移校正由于微弱的红外线反射或过度的散射光。这些包括高折射率的介质(更紧密地匹配,在盖玻片)被安装在固定的标本。在这种情况下,从聚焦监控系统的反射光的量可能不足以检测到的接口表面。同样的,厚实的组织标本,分散了大量的光,是很难用焦点漂移校正。厚玻璃盖玻片(大于180微米)或塑料组织培养皿不推荐,因为可能无法检测的边界表面由于没有足够的偏移。最后,盖玻片上表面的灰尘和碎片可以降低边界检测精度,导致过度捕猎或焦点校正错误。

尽管目前可用的的焦点漂移校正系统的设计测量反射从盖玻片接口,提供了众多的选择和潜在的缺陷的研究人员进行长期的时间推移成像的变化从一个设计到另一个。主要兴趣是主要的商业系统之间的价格变化,从而使研究人员能够在某些情况下,选择一个解决方案,更紧密地与适合他们的预算比他们的实际活细胞成像需求。如上所讨论的,一些厂家售后提供辅助聚焦校正单元可被改进用于在现有的机动(非机动项目)的显微镜。与此相反,更精致的显微镜制造商所提供的交钥匙系统完全集成到其反相的帧,因此不需要修改的光端口,用于安装在显微镜或使用。所有的焦点校正系统能够成像的多个特征在不同的横向和轴向位置(实际上,在每个时间点为每一个拍摄的视场)。

focus drift figure9

评估商业焦点漂移校正系统时的一个主要考虑因素是反馈回路的频率监控和调整的重点。尼康PFS系统提供了一个持续活跃的机制,独立的显微镜和相机控制软件运行,而其他每个图像被捕获之前,立即进行重点检测和校正过程。每种方法的优点和缺点。例如,如果实验涉及实时图像捕获,然后的尼康PFS系统采用连续进料的作用机制可能是更有用的,因为它会漂移校正独立软件调用。然而,对于实验中捕捉图像在长时间内间歇性是重要的考虑因素,速度较慢的系统评估焦点之前,每个图像捕捉可能是足够的。在一般情况下,在选择的聚焦补偿系统的首要考虑的是图像被捕获时的速度。更快的系统执行以及在长的时间间隔拍摄图像,而较慢的系统将是用处不大的图像捕获的时间间隔短于3〜5秒。

在典型的时间推移的情况下,其中一个显着的延迟之间发生图像捕获,需要短的时间间隔来测量反射率,然后偏移到一个特定的轴向位置盖玻片以上是无关紧要的。然而,当收集流中的图像的每秒30帧或更多的快速脉冲串时,最快的补偿系统会显示优越的性能。然而,应当指出的是,根据设计,一个连续的反馈系统可能不能够完成补偿步骤,而系统仍然是狩猎的参考平面之间的每一个暴露在捕获图像的风险,因此可能会对。在这种情况下,产生的视频经常遭受播放时的抖动工件(不可预知像素沿的横向轴发生间歇每隔几帧转移)。连续捕获驱动聚焦补偿系统之间进行选择应考虑的另一个变量是总的实验时间。时间推移实验的范围可以从几秒到几个小时甚至几天的长度。实验的最后几个小时或几天,连续依靠压电致动器的反馈系统可能会受到机械漂移或滞后蠕变由于定位不一致在短期的实验中,这些文物的影响通常可以忽略不计,但在长时间的收购,他们的贡献可能是显着的。

总之,解决问题的焦点漂移也许是最重要的进步,在最近的历史上已经发生的活细胞成像。此工件必须始终在一个实验系统的结构的设计的时间推移成像更为明显,当使用高数值孔径物镜窄的焦点深度可以很容易地转移丝毫的振动或变化的温度处理。焦点的漂移也是一个关键因素(以及一个相当大的挑战),以消除成像时,一个复杂的序列,在一个单一的试样在每个时间间隔的侧向和轴向位置。在大多数情况下,从显微镜制造商提供的新焦点的漂移补偿系统能够提供良好的校正,但在不同的水平速度。然而,无论仪器的复杂程度,与活细胞进行延时实验时,必须密切关注支付漂移上述因素​​,包括热的环境中,试样摄像室,振动,浸没介质,稳定性和机械稳定性。一旦所有的基本细节已经得到解决,应谨慎调查以优异的成绩回报。



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