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徕卡显微镜:荧光蛋白 - 从入门到诺贝尔奖

2013-10-16  发布者:admin 

荧光蛋白是最近荧光显微镜及其现代应用的根本。他们的发现和随后的发展是最令人兴奋的创新在上个世纪的生命科学和无数自然现象破译的起点之一。这篇文章是献给谁参与了荧光蛋白的命运输入其科学的参与到人。它应该给一个最美丽的生化工具,从一开始到诺贝尔奖的漫长道路的洞察。

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早期的荧光观察

荧光蛋白的人的兴趣可以追溯到公元一世纪时,罗马自然哲学家老普林尼描述[ 1 ](盖乌斯皮林纽斯Secundus,公元23年-公元79年)在地中海的一个发光的水母(Pulmo MARINUS) 。在他的眼睛这些动物发出的光,其发光强度,它几乎可以被用来作为一个火炬(博恩,1855)。除了 ​​这种水母有丰富的其他生物,吸引了我们的注意,因为他们在黑暗中发光。事实上,他们没有做到这一点赶上我们钦佩,但其他的理论之中,与他们的同种(萤火虫发挥自己的队友,例如一拉就)沟通,吸引猎物(如蛙鱼)或吓唬天敌(短尾鱿鱼例如)。这些迷人的生物都生活在黑暗的世界-如深海-灯是一种原始属性。而上200米的海洋底下的边境渗透阳光,现存唯一的照明是由生活在那里的生物。

利用化学发光和荧光发光,演变发展的最令人印象深刻的和最强大的工具,这是基于科学的好奇心几个人最近的生物化学和细胞生物学之一。他们的努力,发现应在下面提及。

中世纪后,随着即将到来的自然科学的兴趣,喜欢西班牙医生和植物学家尼古拉斯莫纳德斯描述一个闪闪发光的木1565降香nephriticum的提取物制成。后来这种光可以归因于这是发现在这家工厂,并表明泛着不仅限于动物黄酮类化合物的氧化产物。三个多世纪后(1858年),爱尔兰数学家和物理学家乔治·加布里埃尔·斯托克斯,形成那种自然发生的现象:荧光的名称。他认为这个词后的蓝色发光萤石矿物,并扩大了观察动物在植物石头的辐射对象

 

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 1,2:维多利亚水母。来源:Ssblakely,通过维基共享资源

 

然而有这个令人费解的问题,为什么会出现蓝色光完整的生物体中提取,而在绿色发光?下村和他的同事们几年来解开这个谜。但最后他们的研究表明,蓝色的光芒来自水母,只是另一种闪闪发光的蛋白 - 水母绿色荧光蛋白(GFP)的能量来源。他们意识到,水母发光蛋白所发射的光的吸收,用这种能量产生绿色荧光的绿色荧光蛋白。

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图3:绿色荧光蛋白(GFP)的分子结构

 

 

等待下一个开创性步骤凯旋游行的GFP克隆技术的发明,在20世纪70年代。而美国微生物学家道格拉斯普拉舍的工作,在1992 [ 3 ] 的第一次克隆了完整的GFP基因A.维多利亚cDNA文库之前,他准备与他的同事米尔顿科米尔一起在佐治亚大学的,已经知道准的GFP。不幸的是,由美国癌症学会的资助Prashers跑了出来,他才可以开始在细菌表达的重组GFP。

由Martin Chalfie的,一位美国生物学家,谁可以受益于普拉舍的前期工作,初步怀疑,GFP不会在外面工作的水母被抹去。通过引入GFP基因插入大肠杆菌和线虫,他可以表明,有没有其他的水母特定的蛋白质或必要因素产生绿光[ 4 ]。

GFP在活细胞成像

有了这些经验,门被打开了绿色荧光蛋白在生命科学,开始其惊人的职业生涯。GFP成为观察活细胞和生物合成的标签,而不需要或荧光抗体结构的关键。在免疫荧光染色的情况下,在细胞内的抗体的访问目标结构一致来保证。这是通过用洗涤剂(例如),这不可避免地诱导细胞死亡的透化细胞。此外,大多数抗体变性抗原的偏好。因此,免疫荧光技术,使用代理,像第甲醛变性细胞靶蛋白结构。共使用GFP可以克服这些非生理条件和生活细胞成像铺平了道路。

另一个人谁是实现和发展的巨大潜力GFP是钱永健。来自钙调节领域,美国细胞生物学家兴趣追踪活细胞内大分子相互作用。剑桥和伯克利在哈佛的学习和工作后,他终于落户在加州大学,圣迭戈。药理学,化学和生物化学教授,他GFP的提高了工作效率,通过利用在进化过程中的一个非常普遍的原则:突变。1994年,他和他的团队建立了一个单点突变(S65T)GFP一个更好的强度和光稳定性比野生型版本。除了明亮的光晕S65T的变异体有另一个引人注目的技术效益。而野生型GFP有两个激发最大值在395纳米和475纳米,在484 nm处只有一个变异版本。安装的“新的”绿色荧光蛋白的光谱特性,通过保持其发射波长在509 nm处,几乎成古典FITC荧光的属性(FITCex:496纳米,FITCem:520-530纳米)。由于其增强GFP变种被称为“增强”绿色荧光蛋白或EGFP。

做结构GFP钱学森和他的同事研究制定进一步的荧光衍生物。与GFP结构在他们手中,他们成立的一个变种(T203Y)照耀在明亮的黄色,因此定名为“黄色荧光蛋白”或YFP。其次青色(CFP)和蓝色(BFP)形成。

 

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图4:线虫的神经系统,青色:CFP,绿色环保:绿色荧光蛋白,黄色:YFP,红色:红色荧光蛋白

 

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图5:GFP小鼠

 

珊瑚虫荧光蛋白

延伸到红色的频谱范围内时,生物化学家 Sergey A. 我们简直不敢相信,他是自2003年以来,俄罗斯科学院一名对应的成员,发现红珊瑚的荧光蛋白的荧光蛋白的调色板买完这些刺胞动物门在莫斯科的一家宠物商店卢科亚诺夫研究这些原始的动物运往俄罗斯海洋水族馆的荧光行为。其中包括,他发现红色荧光的蛋白来自Discosoma的一个Corallimorpharia -他称之为DsRed的。除了红色荧光蛋白,简直不敢相信和他的同事确定其他发光珊瑚虫的蛋白质生化时间后的使用时间进行了优化,这是一个整体的调色板。

诺贝尔文学奖

所有的努力,研究发现,理解和增强荧光蛋白导致了大范围的应用在生命科学的投入。GFP及其变种打开门,科学家观看的FE转移或血管生成生物体。此外,的五彩荧光的神经(Brainbow)的使用将有助于了解大脑中复杂的神经网络。装饰疟疾的病原体疟原虫的寄生虫,如荧光蛋白的可能性,它是可以实现的,看着自己的命运在宿主细胞。的机会,可以继续的名单几乎是无止境的,不仅包括临床相关的项目,但还有其他基础科学的企业。

总之GFP及其突变体的使用改变了我们的生活和其病理修改在一个戏剧性的方式,2008年化学诺贝尔奖给他们三个人谁参与了绿色荧光蛋白的发现和发展得到了回报。修下村修马丁Chalfie的钱永健,装饰与他们的工作“的发现和发展绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白”在科学中的最高荣誉。

 

在化学(2008),诺贝尔委员会由的Måns埃伦贝格教授代表“ ...的发现和发展绿色荧光蛋白(GFP)从根本上改变科学议程。改进变种GFP和GFP类似的蛋白质协同的眼睛目前高分辨率显微镜,计算技术和强大的理论方法助长了复杂的生物系统侧重于定量分析的科学革命,现在的世界迄今看不见的结构和动态原则逐步外观影响几乎所有方面的生物,医学和医药的研究... 

此报价为2008年诺贝尔化学奖的颁奖辞一次代表当前生命科学和高冲击的荧光蛋白,在未来即将到来的利用率,也引起我们的好奇心。最近的事态发展,像的荧光笔蛋白(photoactivateable光开关或photoconvertable的FPS)和建立新的超分辨率光学设施,如显微镜,明确的,即荧光进化仍在进行中,离终点不远。