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尼康显微镜:共聚焦成像模式

2013-10-16  发布者:admin 

共聚焦显微镜的主要应用是在厚的部分的各种各样的标本类型的改进的成像。共焦的方法的结果的能力,通过试样序列在高分辨率图像的各个光学部分的优点。一些使用不同的成像方式,全部依靠的光学部分,其基本形象单位。

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单光学部分

光学部分是图像的基本单位,在激光共聚焦显微镜方法。数据可以收集固定和染色标本的单,双,三,或多个波长的照明模式,并从多个标记的标本采集的图像将在注册与对方(如果有足够的校正色差物镜像差被使用)。轻微的登记错误,通常可以使用数字图像处理方法来校正。大多数激光扫描共聚焦显微镜(LSCMs)以约1秒获得一个单一的光学部分,虽然有几个收购通常是由软件来提高信号噪声比的平均值。采集图像的时间当然会发生变化,与以像素为单位的图像和系统的计算机的速度的大小。在保存时,一个典型的8 -比特图像的768×512个像素的大小,将需要约0.3 Mb的存储空间。

图1中显示的是同时收集在三个不同的激发波长(488,568,和647纳米),用一个单一的氪/氩激光的光学部分。的标本是果蝇三龄翼成虫磁盘标记三种基因,涉及图案翼。三个基因成像和他们各自的荧光染料标记(一)退化的(荧光素 - 496纳米);(二)无翅(丽丝胺罗丹明 - 572纳米),(三)CID(花青5 - 649纳米)。合并后的复合材料的三个空间翼构图基因表达域显示在右下方的(图像(四))。

时间的推移和活细胞成像

时间推移活细胞研究加强与激光扫描共聚焦显微镜成像分辨率的提高。细胞的运动进行的早期研究,使用16毫米电影胶片连接到相机上了发条定时曝光,以及最近使用时间推移视频盒式录音机,光存储硬盘录像机,视频采集卡。现在,可以使用激光扫描共聚焦显微镜,收集在预先设定的时间间隔单一的光学部分。

用激光扫描共聚焦显微镜的成像生物体组织比固定的标本成像极为困难的,并且并不总是一个实际的选择,因为试样所涉及的条件,可能不能耐受。表1列出了一些要考虑的因素与激光扫描共聚焦显微镜成像活细胞和固定细胞。有些标本根本不会爽利的显微镜的舞台上,它们不能维持生命在舞台上观察。的现象或结构还可能无法访问到物镜的视场。例如,飞翼成虫盘的水果太深发展进行成像的幼虫,解剖出时,他们不能在培养基中培养。因此,目前可用的唯一的方法,在这种类型的组织图像基因表达是解剖,修复和染色采取成虫磁盘的从不同的试样在不同的发展阶段。

固定和活细胞成像与物流及供应链管理应用技术研发中心

标准 固定细胞 活细胞
照明限额 淡出荧光 染料的光毒性和衰落
抗淬灭试剂 苯二胺等。 没有!
封固 甘油(1.51  水(N = 1.33)
最高NA镜头 1.4 1.2
每幅图像的时间 无限
感光度标本有限公司速度的现象;
信号平均 没有
决议 波动光学 光子统计

表1

成功的活细胞成像显微镜舞台上需要格外小心,整个成像过程中应采取保持容忍的条件。通过多次扫描,所以应保持在最低限度的必要,以获取图像暴露于激光束照射激光束的光损伤可累计。抗氧化剂如抗坏血酸通常加入到培养基中的氧气量减少,会释放出荧光分子的激发,导致自由基形成和杀死细胞。广泛开展初步控制实验光照射荧光标记的细胞的影响进行评估,保持详细的注释,对所有的成像参数通常是必要的,无论他们被认为是相关或不。成像测试,持续经营能力的活标本应进行评估。胚胎,例如,应继续其正常发育后,成像过程中,应确定由成像或所使用的荧光染料的任何异常引起。时间推移成像图2给出了一个活生生的果蝇胚胎注射钙绿色。的一系列的图像显示的荧光探针的分布随着时间的推移的变化。

生活的特殊要求,必须满足不同的细胞类型,是将被成像。某些细胞如昆虫细胞,通常可以在室温下保持在适当的介质中的一个足够大的体积。然而,大多数类型的细胞需要一个阶段的加热装置,并可能在适当的二氧化碳平衡时,他们是在显微镜载物台期间可以保持灌注室。选择的细胞类型,是更适合于在激光扫描共聚焦显微镜的成像条件,可避免许多实验的问题。现代共聚焦仪器的改善,潜在的问题都得到了显着降低。增加光子的效率,更高的数值孔径物镜(亮),减光毒性染料标记活细胞共聚焦分析一个实际的选择。最好的办法是用最少的激光功率,使成像,并尽快收集图像。如果针孔孔径比非生物固定,以加快图像采集标本的开度较大,成像后的卷积有时可以依靠恢复丢失的图像质量。

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许多生理过程和事件发生的速度比他们可以捕捉由的大多数LSCMs,有图像采集率通常在每秒一帧的顺序。使用LSCMs声 - 光器件和狭缝扫描速度比的检流计驱动的点扫描系统,更实用的生理研究。这些更快的设计结合了良好的空间分辨率,时间分辨率好,这可能是每秒30帧的全屏幕分辨率,或接近视频率。较慢的点扫描显微镜系统可达到最佳的时间分辨率,只通过扫描在试样上大大减少区域。如果需要完整的空间分辨率,帧必须被收集较少,失去一些时间分辨率。共聚焦系统也能够使用磁盘扫描振镜扫描方式成像快速生理或其他瞬态事件。

Z系列和三维成像

甲的z系列是一个序列的收集在不同的高度的光学部分垂直于光轴(z轴)内的标本。Z系列收集协调微调对焦的显微镜图像采集顺序在每个步骤的一步一步的变化。焦点中的步骤,通常是通过由计算机控制的步进电机,按预定的增量改变焦点。在计算机中可以使用宏程序,以获取和保存的图像,通过编程改变对焦距离在试样采集和保存第二个图像,再次改变焦点,所以直到编程的图像数量已经收集。

从z系列通过一个地区的利益采取一些图像可能被提取,并在图像处理程序合并,突出感兴趣的细胞。的z系列也可以作为一个蒙太奇图像,如在图3中所示的显示。这种类型的图像组合和显示,以及许多其他的图像操作,是目前大多数商业图像采集和处理软件的标准功能。图中所选择的图像(图3)是表示沿z轴的增量更小的更大范围内的一系列的代表。绿色发光污垢定位外周神经系统的被标记为与指定的抗体22C10果蝇胚胎。

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它可以是概念上是困难的复杂的相互连接的结构从几百光学部分用激光扫描共聚焦显微镜的试样的体积,通过采取了一系列的可视化。一旦收集,然而,Z-系列是理想的进一步加工成的标本使用量可视化技术的三维表示。这种方法是目前常用的澄清的结构和功能之间的关系,在生物和医学研究的组织。重要的是,图像被收集在一个适当的z电机的步长改变焦点,使试样的实​​际深度反映在图像中。只要试样本身不移动的图像采集过程中,在激光扫描共聚焦显微镜产生的z系列将是完美的寄存器,并保存在数字格式,它们被相对容易地加工成一个三维表示的试样。图4给出了一个单一的光学与z系列的凸台(b)条的(a)部分的比较,并且示出的值,该值在此技术中,在可视化的果蝇染色,外周神经系统的抗体22C10。

所采取的步进电机的步长大小,并设置由显微镜操作员,是关系到光学部分的厚度,但他们可能不具有相同的值。光学部分的厚度是指通过显微镜成像的样品的部分的厚度,和取决于物镜和所用的针孔的直径。聚焦步长和光学部分的厚度在某些情况下具有相同的值,但是,这可能是一个混乱的根源。

以下收购的Z系列文件,它通常是出口到计算机专为处理共聚焦图像三维重建程序。这种软件程序在图形工作站上以极高的速度运行,或当前速度更快的处理器和大量的RAM,可以相当有效地运行在个人电脑上或工作站共聚焦显微镜。的三维软件程序包可以被用来产生一个三维表示的试样或电影序列的试样不同的意见,可产生的效果,旋转或其它空间变换的增强试样的赞赏编制立体字。该软件允许各种长度,深度和体积的测量值进行,和的图像的特定参数,如不透明度可以交互地改变,以显示在试样中的不同层次的结构还。

confocal2 figure4

中,串联的光学部分从时间推移序列可能被利用的另一种方法是对数据进行处理,使时间的z轴成三维表示。这是一个有用的方法,可视化有机体发展过程中的生理变化。这种方法已经被使用的一个例子,其中在澄清钙动力学在显影海胆胚胎。颜色编码的在不同深度的光学部分是显示三维信息的一个简单的方法。在实践中的颜色(通常为红色,绿色,或蓝色)被分配给每个得到的光学部分在不同的试样中的深度,然后在彩色图像被合并,且操纵的颜色,使用图像处理程序,以达到预期的效果。

四维成像

活体组织制剂或其他标本表现出动态的现象提出利用激光扫描共聚焦显微镜三维数据收集时间推移序列提交时间作为第四维的可能性。Z系列数据收集的时间间隔,会产生随时间的4维的数据集,三个空间维度ÝŽ)作为第四维数,这可以被视为使用4D浏览器程序。这种方案允许立体声对以建造在每个时间点,并作为一场电影,或,或者,每个时间点的三维重建回放可以被处理和显示的电影或一蒙太奇。

XZ成像

如果所需的试样,如上皮细胞层的垂直切片,xz部分的纵断面图,可以产生以下两种方式之一。的档案中,可以通过扫描的试样(x -轴)的一个单一的线横跨在不同的z轴的深度由步进电机控制的焦点发生变化,则显示一系列作为一个合并的图像构造另一种方法是使用一个三维重建程序中提取的档案中,从现有的z系列光学部分的剖切面选项。在建设蝴蝶翅膀上皮细胞在图5中的图像进行扫描,激光通过单一的线(水平黑线在左手的图像)在不同的z轴位置,或深度,进展成试样。共焦成像系统就建立起来了,并显示在图5中的的xz图像的呈现。翼上皮由两个上皮细胞层,但作为荧光强度下降更大的深度中的试样,只有上层是清晰可见的。

反射光成像

反射或后向散射光成像,所有的早期的共聚焦显微镜中使用的摄像模式。许多标本可以在激光共聚焦显微镜观察未染色状态,利用反射光,或试样可以用探针就是高度反光,如免疫胶体金或银颗粒标记。的反射光的方法,特别是对活组织样本的一个优点是,光漂白是没有问题的。某些类型的探头,衰减激光束,另一个潜在的问题是,在某些显微镜,可能会发生内部反射从光路中的光学元件。在狭缝的多波束版本的激光共聚焦显微镜的反射问题是不存在的,工具很是麻烦的情况下,使用的偏振器或成像相差的工件并可以减轻它离开光轴。

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透射光成像

不仅可以用在激光扫描共聚焦显微镜,包括相衬,微分干涉相差(DIC),暗场,或偏振光的透射光的成像模式中通常采用显微镜。甲透射光检测器是用来收集试样的光通过,一个光纤导光发送信号的光电倍增管的显微镜系统的扫描头中的一个。透射光图像和共聚焦萤光图像可以被收购,同时使用相同的照明光束,确保所有的图像都登记。当图像组合或合并使用图像处理软件,标记的细胞组织内的精确位置可以被映射。在一些研究中的一个的信息的方法是与一种或多种共聚焦荧光标记的细胞的图像在同一试样的透射光图像的检体,非共结合。使用这种方法将允许的,例如,确定的空间和时间方面的一段时间的小时或什至数年的未标记细胞的人口内的标记的细胞的迁移的一个子集。

彩色透射光检测器现已实施,收集发送的信号中的红色,绿色和蓝色(RGB)颜色通道来创建一个实际的彩色图像的方式,是类似的一些数字彩色摄像机。这种探测器是特别有用的病理学家,他们习惯于观看真面目组织在透射光荧光数据覆盖这些图像。