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徕卡显微镜:荧光简介

2013-10-16  发布者:admin 

荧光是由乔治·加布里埃尔·斯托克斯在1852年首次被发现。他指出,萤石开始发光后,用紫外光照射。荧光是一种形式的,它描述了由辐射产生的光子的材料被光照射后的光致发光。所发射的光具有比激发光的波长较长的。这种效应被称为斯托克斯位移(Stokes shift)。

 Application

 

作为一种工具,荧光显微镜

被广泛用于荧光显微镜观察特定的分子的分布的一个重要工具。大多数细胞中的分子不发出荧光。因此,他们被称为荧光染料的荧光分子标记。可以直接标记的感兴趣的分子(例如DNA用DAPI),或者它们可以被耦合到特异性抗体的免疫染色的荧光染料。通常是固定的细胞所必需的免疫染色。

荧光显微镜也允许时间推移成像活细胞或组织。为了这个目的可以被标记蛋白质的利益,如GFP(绿色荧光的蛋白)基因编码的荧光分子。感兴趣的分子(例如钙2 +),也可以使用可逆地结合合成染料(例如,呋喃-2)或遗传修饰的天然存在的蛋白质(如GFP的衍生物)标签。

电子的能量状态的变化导致发光

发光描述一个电子从激发态到较低的能量的状态下的变化所造成的发光效应的发生。电子可以存在于不同的能量状态。电子的基态是一个非常稳定的状态,并具有最低的能量水平。如果电子吸收能量时,它们可以被提升到一个更高的能量水平,提供一个激发态。由于更高的能量比基态激发态,能量被释放时返回它的基态电子。这种能量可以释放的形式发射光子。

有几种形式不同的方式,系统被激发,例如,在电致发光系统通过电流激发发光,化学发光的发生是由于发生化学反应而从通过光子激发的光致发光的结果。

可以进一步分成两个小组,荧光和磷光的光致发光。荧光和磷光之间的主要区别是其发光的持续时间。荧光照明停止时立即结束。与此相反,磷光可以持续几个小时后的激发已经结束。

Basics-Fluorescence

 1:当使用一定波长的光(激发波长)的光子被吸收的分子的电子击中的分子(例如荧光团)。然后,电子被从它们的基态(S 0)提升到一个更高的能量水平,激发态(S 1 ')。这个过程被称为激励(1)。激发态寿命很短(通常为10 -9 -10 -8秒),在这段时间(2)的电子的能量损失。当电子离开(1激发态返回到基态(3),他们失去了在激励过程中采取了剩余的能量。在荧光基团的情况下,能量被发射的光(荧光发射)的较长波长比激发光(并因此使用更少的能源)。这种现象被称为斯托克斯移位。

荧光的机理

荧光染料的荧光是当它们存在对应的波长的光照射。的波长取决于荧光团的吸收光谱,它必须确保合适数量的能量被传递到提升到激发态的电子。后电子被激发,它们可以驻留在这种高能量的状态下,只有很短的时间。当电子放宽到基态或其他国家具有较低的能量水平,释放能量,作为一个光子。在此过程中由于一些能量丢失,增加的波长和能量较低的光由荧光染料相比,所吸收的光的发射。

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 2:COS 7细胞,绿色:未知的蛋白,绿色荧光蛋白,红色:α-微管蛋白,CY3,蓝:细胞核,DAPI。礼貌的卞伟教授,细胞研究中心研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海生命科学研究院,中科院,上海,中国

 

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 3:小鼠成纤维细胞,绿色:F-肌动蛋白,FITC红:微管蛋白,CY5,蓝核,DAPI。由君特·吉斯博士,医学研究的马克斯普朗克研究所,海德堡,德国

 

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 4:小鼠海马神经元,蓝标记的转染细胞,绿色:肌动蛋白,TRITC,红色:红色,灰色,德州GluA AMPA受体单元:突触囊泡蛋白,CY 5

 

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 5:果蝇幼虫,绿色:RNA结合蛋白,Alexa的488

 

磷光的机理

由于磷光的分子可以更长的时间比荧光染料的发光,就必须有一个不同的方式中,它们存储激发能量。这种差异的基础上,发现在两种形式的激励水平,单线激发态和激发三重态,这是基于对不同自旋对齐。

自旋电子的属性。以简化的术语的自旋描述的电子通过其旋转造成的角动量。一个电子的自旋的方向可以是正的(1/2)或负(-1 / 2)。自旋对较高的能量水平可以是在它们的方向彼此平行或反平行。在反平行自旋对个别的角动量相互补偿,总自旋得到的值为零。这被称为自旋排列单线态。两个平行的旋转不补偿,并得到一个非零的值。在这种情况下,自旋被说成是在三重状态。

荧光发生当电子从单线激发态回到基态。但在某些分子,被激发的电子的自旋可以切换到在这个过程被称为系统间横穿三重态。这些电子失去能量,直到他们在三重态。此状态是更高的能量比基态,但也比单线激发态能量较低。因此,电子无法切换回单状态,也不是他们可以轻松地返回到基态,总自旋允许值为零,由于量子力学。因此,这些分子都被困在他们的能量状态。 

但是,来自三重态到基态的一些变化是可能的时间。这些变化会引起辐射产生的光子和磷光。由于只有少数事件是可能的时间,三重态呈现一种能源水库,使磷光可能在一个较长的时间段。

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 6:果蝇幼虫体育场,绿色:Feb211阳性神经元和轴突,Alexa的488,红色的纤维部分:中枢神经系统(即所有轴突),CY3,蓝核,DAPI。礼貌,德国克里斯托夫Melcher先生,博士研究所卡尔斯鲁厄,毒物学和遗传学研究所,Eggenstein-Leopoldshafen
 
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 7:鼠标肾部分,绿色:肾小球和曲小管,Alexa的488 WGA:F-肌动蛋白(多见于肾小球和刷状缘),红,蓝:细胞核,DAPI
 
 
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 8:新生儿心肌细胞,黄色:DNA,的DAPI,绿:Myomesin,Cy3的红色:钙粘蛋白,德州红,蓝:肌动蛋白,Alexa的633
 
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 9:中期蔓延FISH - 收购染色染色体荧光体视显微镜。的苏托由美子博士,人类演化实验室,前沿科学研究生院,东京大学提供
 

荧光显微镜

显微镜,荧光发光是最有用的一种。可以很容易地与他们的特定波长通过特定的光源(例如灯和过滤系统或激光)可区别于所发射的光的激发光的波长(斯托克斯移位)激发荧光染料。

使用荧光成像,实验者可以表征分子在细胞内的量和本地化。荧光显微镜的另一个优点是,可以同时使用多个荧光染料。的荧光染料只需要在他们的激发和发射波长变化。因此,可以同时观察到不同的目标分子,允许一个巨大的各种试验,例如,以进行共定位研究。