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徕卡显微镜:荧光相关光谱

2013-10-16  发布者:admin 

荧光相关光谱(FCS)的测量的荧光强度的波动,在一个子femtolitre卷来检测这样的参数,扩散时间,荧光标记的分子的分子或暗的状态数。在20世纪70年代初,该技术是自主研发的瓦特·韦伯和鲁道夫Rigler。的术语FCS铸造,由韦伯实验室。这项突破性的技术是引进共焦光学Rigler和同事,在20世纪90年代初增加其灵敏度单分子水平随着更高的灵敏度与激光扫描共聚焦显微镜FCS仪表的可用性乘以其效用生物学。应用包括分子大小,聚集状态,绑定和生化反应动力学,无论是在体外在体内的测定

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FCS - 的方法

FCS是一个光谱的方法。在这种情况下,“比色皿”是受衍射限制的点(图1)。因此,使用显微镜的原因,是具有高数值孔径的透镜将光束聚焦到一个femtoliter大小的光斑。一个可喜的副作用有显微镜能够采取的样品图像引用和定位测量点(ROI)。在FCS小学读出​​荧光强度随时间(荧光的跟踪或强度跟踪)。的荧光的波动隐式编码的粒子数(即振幅波动)和粒子的停留时间(即频率的波动),见图2。一个进行自相关分析,(“自相似性”试验)和曲线拟合,定量地获得这些参数(图3和4)。共聚焦点的激发和检测的光的几何形状大致如下一个三维的正态分布。近似​​高斯函数,人们可以找到FCS自相关函数的分析模型。它的参数和它们的物理意义总结于表1。

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 1(左):观察量和重要的参数。扩散时间τ<SUB> D </副>表示分子观察量内花费的时间,即需要多长时间横向扩散。的横向延伸(光束束腰),瓦特<SUB> 0 </次>,和轴向延伸部分和z <SUB> 0 </ sub>的观察量(右侧)。他们比Ž<SUB> 0 </ SUB> /瓦特<SUB> 0 </ SUB>是偏心率或结构参数,κ。
图。2(右):荧光强度跟踪。流入和流出的观察量(上排)的分子的运动导致的荧光强度的随机波动。

 

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 3(左):自相关原理。荧光跟踪乘以本身被复制,并总结出的结果。这样做是为了多次,每次移增量设定的第二数据τ<SUB> </ sub>的(滞后时间)。小的滞后时间后,数据仍然是自相似的,产生一笔较大(红色)。更长的转变意味着更小的数字(绿色和蓝色)。这种技术通过观察量的分子扩散的频率分析中的基本信息。
图。4(右):自相关函数G(τ)被绘制在滞后时间t。从图3(红,绿,蓝点),G(τ<SUB> </ sub>的)代表不同的滞后时间定性绘制。在G(0)的振幅,编码的粒子数N的时间在半最大振幅(INFL挠度点)产生的逆扩散时间τ<SUB> D </ sub>的,也被称为为相关时间。从这些数字中,我们可以得到的浓度c和扩散系数D使用适当的校准。

 

详细“解剖”的FCS曲线,即过程的观察在什么时间域,以及一般介绍的主题,请参阅佩特拉Schwille和埃尔克·斯特因一篇网上文章  

 

3D高斯三联模型

GT-Equation

 

参数

意义

ρ

电流幅度

G(0)振幅贡献的分子种

τ ð

扩散时间

V EFF内花费时间分子

τ Ť

三胞胎时间

在黑暗状态下度过时间分子

Ť

三联分数

在黑暗状态下的分子分数

κ

结构参数

的V EFF的偏心率,κ= Z 0 / W 0

表1:三维高斯三重模型数据拟合一个分子物种和正常扩散3D参数。

 

校准 - 从相对绝对数字,

FCS测量感兴趣的是两个主要的参数的扩散系数,τ ð,分子的数目,N.他们直接相关的扩散系数D,和浓度角分别。然而,无论τ ð和N,是由每个单独的仪器和一些实验参数的影响的相对数。取得的绝对编号D和c是仪器校准的目的。

有效体积

这两个参数,扩散时间和数目的分子,这取决于观察量的大小。应当这里所指的有效容积,V EFF校准是确定的V EFF的大小

校准策略

三种方法确定V 效率的文献中描述:

  1. 共焦量用荧光珠在3D及装修的一个三维高斯函数的测量。
  2. 准备浓度系列和N作为绘制c的函数。斜率产生V EFF
  3. 已知的染料与已知的D.曲线拟合产量测量τ ð和κ,其中V 效率可以计算出来。

每种方法都有其缺点和优点。对于实施例1。共焦量,给出了一个确切的描述细节以及3D高斯近似持有。这是不测量在水溶液中的实际测量一样。第二种方法是modelfree的,V EFF或扩散模型的几何形状作出任何假设因此,它含有没有关于它的形状,它是费力,而且可能遭受黑暗的状态,如果无科幻拟合曲线被用来估计N,但它工作在一个大的浓度范围内。最后一种方法的条件下,非常接近实际FCS测量,包含了一些信息的几何形状的V EFF可以轻松实现。在下面,我们将研究这一战略一步一步。所有三种方法进行了详细的比较

通过曲线拟合得到的有效容积

由于这种方法是基于曲线拟合的结果,质量非常强烈的依赖,对如何做好模型描述了现实。最强的假设是一个三维高斯几何形状的V EFF,通常做在FCS分析。因此系统的错位将导致违反了这一假设。此外,一个很好的信号-噪声比的自相关是必需的,因为τ ð和κ都确定拟合相同的数据集。这是最好的满足明亮,光稳定的染料在水中的浓度范围从0.1纳米到10纳米[1] 的有效体积,然后给出在方程1。

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公式1:有效容积。观察体积的大小有关的FCS测量与瓦特<SUB> 0 </子>的横向和z <SUB> 0 </ SUB>的轴向延伸。这两个参数依赖于τ<SUB> D </次>和κ得到的曲线拟合的校准测量。请注意,这V <SUB>有效</ sub>的是大于2 ^(3/2)〜2.8的一个因素在文献中通常被称为共焦体积。