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奥林巴斯显微镜:荧光显微镜解剖式讲解

2013-10-16  发布者:admin 

到其他模式基于宏观上的试样的功能,如相位梯度,光的吸收,和双折射的光学显微镜相比,能够仅仅基于荧光发射性能的一个单一的分子种类的分布成像的荧光显微镜。因此,用荧光显微镜,与特定的荧光基团标记的胞内组分的精确位置进行监测,以及其相关联的扩散系数,传输特性,以及与其它生物分子相互作用。此外,在荧光显着的反应,以本地化的环境变量可以调查了pH值,粘度,折射率,离子浓度,膜电位,和在活细胞和组织中的极性溶剂。

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最早的荧光显微镜配置的特点是古典的明或暗场透射(透射光)光学聚焦激发光通过过滤器到标本平面的列车。由物镜收集荧光发射,以及具有显着量的激发照明,并通过第二过滤器投射到目镜隔膜形成中间图像。由于激发光的强度,通常是几个数量级大于荧光发射,在这些早期的透射光显微镜的试样的视图往往非常低的对比度和水浸散射的激发照明的背景上的重叠。使用高数值孔径的油浸暗场聚光镜照射试样高度斜方位有助于消除大部分的背景噪声,但并没有提供足够的照明,但最低数值孔径物镜。由此产生的图像遭受贫困的分辨率和亮度很低的水平。

事件反射光或落射荧光显微镜照明最早是在20世纪20年代末在不透明冶金标本来观察荧光。明场同行一样,这些反射光的荧光仪器采用半反射镜分光镜被限制为约25%的整体效率(每次通过镜子时失利后,50%的照明强度)。然而,反射光的荧光显微镜享受具有高数值孔径的物镜,作为聚光镜的优点是,能够生产具有显着更高水平的亮度比在类似的数值孔径的透射光显微镜图像。此外,杂散的激发光反射回的物镜(在高数值孔径)降低到只有几个百分点。物镜的双重作用,在反射光显微镜也大大简化对齐的任务。仅仅聚焦到样品上的物镜建立的照明视野及视场使得入射的激发光,并遵循相同的路径,通过显微镜的光学列车所观察到的荧光发射。

紧凑汞蒸气和氙弧放电灯的照明光源时,在20世纪30年代中期开发的技术进步的带动下反射光荧光(至少金相)。在此期间,有色玻璃和明胶过滤器,也变得更加复杂,使该应用程序通过使用钨卤素灯的蓝色和绿色可见光激发的荧光染料。防反射涂层和改良玻璃配方到物镜设计的重大改进,在20世纪40年代,但最根本的入射光荧光显微镜的发展贡献双色分光镜引进俄罗斯光学科学家Eugeny的布伦伯格(也称为分色镜)于1948年。这种创新克服与使用普通的半反射镜的反射光显微镜的光损失的固有问题。由约翰S. Ploem 20世纪60年代中后期,是谁在发展野生莱茨Ploem Opak,含有多个光模块是可以互换的,安置各种组合过滤器荧光显微镜反射光荧光显微镜,首次在大规模商业化

落射荧光显微镜的基本策略

反射光的荧光显微镜绝大多数是广角非相干光源,以及那些用激光扫描共聚焦和多仪器进行的调查,目前的首选方法。这种普遍使用的荧光显微镜也被称为入射光荧光,落射荧光,或简单地落射荧光一个典型的现代的反射光的荧光显微镜,透射光观察中还配备了多种对比度增强模式,提出如图1所示。显微镜包含一个三目观察头,其耦合到电荷耦合器件(CCD)摄像系统,并具有两个照明源,一个用于透射光,落射观察(钨卤素和水银弧光放电,分别) 。这种设计的显微镜可以合并或交替反射光荧光与透射光相衬,微分干涉对比(DIC),偏振光,或霍夫曼调制对比观察。

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任何荧光显微镜的基本特征是提供一种机制,用于激发的选择性过滤照明试样的更弱的荧光发射,使用第二个过滤器具有最大的灵敏度,使图像形成深色背景上的隔离。本地化的探针在生物试样中的浓度是如此之低,在许多实验中,只有一小部分被吸收的激发光的荧光物种。此外,这些荧光团是能够吸收一定量的照明,发射二次荧光的百分比,甚至更低。由此产生的荧光发射亮度电平的范围为三至六个数量级小于的照明。因此,在荧光显微镜中最根本的问题是产生高效率的照明,试样,同时捕捉微弱的荧光发射,有效地分开的更为激烈的照明带。满足这些条件的组合协调的激发和发射双色分光镜的行动和性能的基础上要求的过滤器,在现代的荧光仪器。

在图2中的假设的检体含有绿色区域中被激发的荧光团在红色(550纳米)和发出荧光(620至660纳米)波长的背后的原理,在反射光中的荧光显微镜的二色性分束器(反射镜)的功能概述在可见光光谱。的高亮度光源的广泛的激发波长为高磁通密度(通常是覆盖大部分紫外线和整个可见光谱),通过所述照射器输出和第一次遇到一个过滤器,用于激发选择适当的波长带(标记为EF,参见图2(a))。在这种情况下,过滤器通过高效率地在510和560纳米之间的光的波长,而且还允许其它波长的光,通过在较小的程度。的激发光下一个到达的二色镜(DM在图2中),被反射到物镜后孔径,形成一个光锥,沐浴试样。的二色性反射镜在光路中的位置,在以45度的角度,设计为选择性地反射波长在490和565纳米之间(图3中所示),同时发送两个较短和较长的波长。

在图3中使用的过滤器的组合,单独的激发光照在图2中,从荧光发射的传输的档案。激发滤光片光谱(红色曲线)表现出高的水平(约80%),在510和560纳米与535纳米的中心波长(CWL之间传输二色镜(黄色曲线)反映了在该区域的激发光谱的波长,通过较高和较低的波长时,以相对较高的效率。需要注意的是0%的透射二色镜曲线上对应于100%的反射。的突出浸在490和570纳米之间的,代表的峰值反射率的传输特性文件,用于反映通过在一个90度的角度,到样品上的激发光滤光片的波长频带。中的最终组件的光的列车,排放量或屏障过滤器(白色曲线),发送波长大于590纳米,这对应于具有黄色,橙色和红色的颜色的可见光。的各种叠加的光谱的透射和反射的波长带之间的界限被设计成尽可能陡峭的反射和透射的波长,以确保几乎完全分离。正弦上升沿和下降沿尖峰出现在二色镜光谱的图案,是一种常见的薄膜沉积过程被称为振铃效应过滤器组合的表现,这是显着的,并,实现薄膜 ​​干涉滤光片技术的迅速发展,是一个明确的示范。

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因为只有一个窄带宽的光反射的二色镜,照明波长小于490纳米,长度超过565纳米的管理,通过激发滤光片也透过二色镜,示出的光,截止在图2(a)。注意的激发光的反射是不是100%的效率,因此,少量的绿色光通过而不被反射的二色镜。此外,并不是所有的透过反射镜565或低于490纳米以上的光的波长。这种光的一小部分被反射,通过物镜由反射镜到标本。从激发光滤光片的透射光通过二色镜(光,在图2(a)截止)被部分地吸收由平坦的黑色表面涂层的过滤器块的内部,但一些从表面反射,并穿过成斜角的屏障过滤器,导致荧光背景噪声。

荧光发射由检体(主要为红色波长),这会导致从绿色光激发,收集的物镜和通过二色镜和屏障过滤器(以上的光切断,在图2(c))。的屏障过滤器(在图2中标记为BF)是专门设计允许只有波长大于590纳米的光到达显微镜目镜和/或检测。在服务这一责任,阻挡过滤器有效地防止从检体(和成功穿过二色镜)到达探测器反射的激发光的波长。然而,大多数从检体返回的激发波长的激发光滤光片和照明器反射向由二色镜(下面的光切断,在图2(c))。在图2和图3中示出的过滤器配置的净效应是分开的激发光,这是相当高的强度,从弱得多的荧光发射。在所有情况下,如附图中所示,在荧光显微镜中所涉及的过滤器的截止水平不是绝对的,而是使一些光波长范围以外的渗透。事件的整个顺序以图形形式显示在图2(b)中,示出所需的高效反射光的荧光显微镜的光学路径和战略滤波器装置。

垂直荧光照明

 

应的现代荧光显微镜的心脏是普遍的反射光垂直照明,观察观看管和携带的物镜,如在图1和图4中示出的物镜转换器之间。所述照射器被设计成直接产生的光到样品上通过第一通过显微镜的物镜的光传递的方式向试样,然后使用相同的物镜捕捉到的被检体发出的光,由高强度的源。这种类型的照明策略有几个优点。下一个显微镜物镜,它的作用首先,作为一个良好的校正后的聚光镜,集传送到目镜或相机检测系统的图像形成的荧光发射。因此,其物镜是始终在正确的取向相对于每个这些功能。此外,大多数由检体(超过360度的角度),散射或反射的激发光的行进相差的物镜前透镜元件,而不是被直接投影到玻璃的情况一样,在发射的荧光照明。这种效应被称为作为前端面照明,与厚的样品是特别有用的。最后,试样被照亮的区域被限制到被观察的相同的区域中,照明和光收集可以利用完全的客观的数值孔径。

在远端的垂直照明灯箱(见图4),其中包含了高强度的电弧放电或灯丝的白炽灯光源。最流行 ​​的照明源是100瓦的高压汞灯(HBO,通常称为燃烧器),但氙气和金属卤化物弧光灯,激光,和卤化钨白炽灯可以达到同样目的。由源发射的光通过聚光透镜系统和沿着所述照射器的内部,在桌面上,并垂直于显微镜光轴平行聚焦。图4中所示的照明器的设计包含了多个组件的聚光透镜系统,但也正在实施,以提高在近红外和紫外区域的色差校正非球面透镜元件。的热的目的是消除或抑制红外线的波长的过滤器被放置灯箱内或相邻的灯箱安装在后方的垂直照明。此外,一些显微镜包含一个双或多波段激发平衡器系统(参见图4和图8)灯箱附近选择性地过滤,将不再需要以微调的荧光过滤器的性能集包含激发波长的对所述照射器的另一端。

fluoromicro figure4

此外,附近的垂直照明灯箱中的定位是一组中性密度过滤器,可以被用来调整光通过系统的整体强度,并降低荧光褪色或漂白。这些过滤器通常安装在滑块的帧,使他们能够快速插入和删除从光路,一边欣赏标本荧光。为了建立科勒照明,垂直照明灯包含一个的定心孔径和视场光阑的组合,两者都具有可变光圈孔径决定该字段的大小和光照强度。围绕光圈和视场光阑的光圈大小的调整是通过几对位于每个外侧的垂直照明器壳体的旋钮。在某些设计中,滑动旋钮,可以消除从光路,所述照射器的光通过量最大化整个膜片组件。其他显微镜包含安装在一个滑块,可以被插入到光路中,专门的应用程序,如荧光漂白后恢复(FRAP)调查,极大地限制了照明视野光圈的固定大小的针孔

在垂直照明光学列车的字段和光圈隔膜是场透镜,这是必要的传播的光,并产生足够的照明场建立科勒照明。后场镜头,所有现代的垂直照明含有光快门(手动开关控制),阻止强烈的激发光到达过滤器的荧光时没有被观察或记录集和标本。百叶窗是一个关键的特征,因为在荧光显微镜标本连续照明可以大大减少由于漂白排放,高强度的光对活体细胞是不健康的。此外,快门使电弧放电灯保持活跃(减轻了一场热身期间),而标本瞬时透射光检查。高端荧光显微镜通常配备了电子快门,提供快速和远程控制照明。装配到照明器壳体的前部,以保护操作者免受任何意外泄漏的潜在危险的短波长的紫外线辐射时,在快门开启的紫外线防护罩(在图4 breathshield类别)。盾提供双重职责,也保护了标本观察时呼出一口气。

几个垂直照明设计提供了一个插槽矩形的偏振片帧,可以采用荧光偏振调查。在大多数情况下,偏振器被插入后面的场透镜(相差的一个共轭面)的照明光路中,但前的光快门(参见图4)。的偏振片可以被固定到适当的位置与预先确定的传输方位角,或安装到齿轮组,允许通过使用一个指轮要变化的透射轴的方向。由于偏振器被安装在一个滑动架,它可以很容易地在不使用时从光路中移除。随附的分析仪(第二偏振器所必需的荧光各向异性测量)可以安装在垂直照明器,过滤器块炮塔,或在一个专门设计的中间管的偏光显微镜。辅助管往往使刻度,旋转偏振器单元的插入分析仪发送的方位角相对于偏振器和显微镜光轴,以确保准确的定位。

垂直照明的最后阶段,包含一个旋转的转台或滑动支架容纳光学块,含有荧光的过滤器组合。该过滤器块旋转(或滑动)进入光的列车,当需要用于成像的特异性荧光滤光器组合。单个块包含一个匹配的激发和发射滤光片组,以及二色性分束器,仔细定位,以最大限度地提高试样的照明,在特定波长的荧光发射和捕获。光学块炮塔和滑块托架可以装载3和6之间有一个定位在光路中的各个块,其余的旋转或滑动的方式临时存储。这些附件可快速切换荧光过滤器集观察标本时,有两个或两个以上的荧光探针标记。配备荧光照明在显微镜透射照明的使用促进了虚拟光学块放入炮塔或滑块托架上的插槽。伪块激发发射(当快门打开时),但不包含任何过滤器,允许光通过不受阻碍地从客观观察管。

在标准模块化直立显微镜,垂直照明定位显微镜之间的框架和观察管(参见图1)。许多制造商提供偏光片,DIC棱镜,或是其它配件的照明和目镜单元之间可以插入中间管。现代显微镜帧通常是由于计算机辅助设计努力的结果显着的减振和增强的人体工程学特性。合成材料,如金属基体陶瓷和铝的复合材料,显着地提高静态和热刚性的框架,从而使该仪器能够承受先进的荧光技术的严格要求,需要几乎完全消除所需要的时间在长时间的振动弱荧光成像。

科勒照明在荧光显微镜

在荧光的垂直照明,是这样定位的光源的灯丝或电弧放电等离子球位于附近的聚光透镜的主要焦点。科勒照明灯聚光透镜供应显着放大的二次光源,以提高整体照明的功能。科勒照明的一个主要要求是,最终必须的灯丝或电弧的图像投射到后侧焦点面上的物镜,也兼作反射光照明的激发过程中(通常是高的数值孔径)聚光镜。上述光源最好填满整个物镜孔径,同时最大限度地提高的辐射强度,以产生均匀照明的字段。在某些情况下,接地的玻璃过滤器放置到垂直照明灯箱和中性密度滤光片之间,以增加照明的均匀性,特别是当采用弧灯,往往会产生过多的强度的区域(称为热点)。但是,由于扩散过滤器的照明水平也降低了,他们应尽可能避免。

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在反射光科勒照明(在图5中示意性地示出)的光源,图像被聚焦到位于在垂直照明器的孔径光阑的聚光透镜。此隔膜共享一个共轭面与后孔的目的和灯的电弧或灯丝,因此,确定的照明场光圈的大小。在一起,构成了照明光源,垂直照明孔径光阑,和客观的后侧焦点面(瞳孔)共轭的平面设置。在透射光显微镜的情况不同,孔径光圈和光源成像到的物镜(作为聚光镜)后开口面,而不是在该位置处的物理位置。作为该结构的一个额外的好处,所有的障碍物(如光阑)时,从光路中移除的物镜是,提供激发照明或者形成图像,从所收集的荧光发射。打开或关闭的孔径光阑是用来控制杂散光,并没有改变,照明场的大小来调节的强度(数值孔径)的照明。在图像中,孔径光阑的调整会影响亮度和对比度。

在反射光中科勒照明的共轭面上的图像形成或字段集包含的视场光阑,在试样表面,中间图像平面。因此,当在试样平面视场光阑被放置在焦点中,图像的光源的显着焦点从除去,以提供均匀的照明领域。视场光阑控制的照明场的大小,而不会影响所观察的区域的照度。在实践中,视场光阑的开口的大小应尽可能地小,以增加图像的对比度和降低的程度不被直接观察到的区域中的光漂白。科勒照明产生均匀的照明试样字段,尽管所产生的电弧放电和灯丝的光源的照度不均。当显微镜配置正确,后焦平面的物镜是完全照亮,提供一个领域是从边缘到边缘均匀光亮。科勒照明,在理想情况下,沐浴试样组的波阵面,每个进入聚光镜孔径成像的光源所产生的单独的点上的会聚。在适当配置的荧光显微镜,其结果是获得最佳图像的对比度和分辨率。

光源和灯室

对于严格的定量分析,在荧光显微镜,标本的照度必须是时间和空间的不变在整个视场。随着时间的推移不稳定普遍反映灯的光芒,由于电力供应输出变化发生波动。相比之下,最常发生弧光灯,空间障碍,出现的现象被称为闪烁电浆球电极之间来回迁移。闪烁一般是通过电源波动,电极电阻的微小变化,或机械振动。基于灯丝的光源,例如流行的钨卤灯,是非常稳定的条件下操作时,恒定的直流电流与稳压电源。在一般情况下,应选择光源,从它们的光谱内容,灯丝尺寸比较客观后方开口面积,空间和时间上的稳定性,和视场照明的均匀性。必须认真注意还可以考虑窄频带的波长的光源的强度,因为通过激发滤光片包括:只有一个非常小的部分的总的照明器的输出。

首要考虑的是在选择荧光显微镜的光源,用于在被调查的荧光染料的量子产率和吸收紫外线和可见光的光的光谱分布。此外,源必须是兼容的捕获图像所用的检测器的灵敏度,无论是人眼来说,传统的薄膜,光电倍增管,加强视频管,或数码相机系统。的选择还依赖于模式的照明。广角荧光显微镜与电弧放电或卤钨灯来源的要求得到满足,而聚焦和多光子显微镜需要适应各种激光系统。钨和钨 - 卤素白炽灯已被使用了有限的成功,由于这样的事实,其排放的大多数发生在红光和红外区域的光的频谱,由紫外线,蓝色和绿色的波长,而多数的被激发的荧光团。此外,输出的光从弧放电灯的10倍和100倍的亮度比通常用于透射光照明的石英卤素灯12伏之间的范围。在宽视场荧光显微镜喜爱的照明光源是汞弧灯,它通常是常规包括在基本模型显微镜配置。在某些情况下,氙气和金属卤化物弧光灯,但这些通常仅限于专门的光的频谱和强度分布图的情况下,与特定的荧光团的要求相匹配。

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汞和氙气灯的设计是类似的,除了括在灯泡外壳的物理尺寸和气体。汞灯包含两个电极密封在高压下,还包含汽化元素汞在石英玻璃灯泡。当电源通电时,一系列的高电压脉冲被发送到电极,电离的水银气体的一小部分,点燃的灯。在烧成后,电压被减少,电离的气体供应承载电流的产生,在两电极之间形成的等离子体球。在灯工作期间,汞的汽化会产生大量的热和压力的玻壳内,最终产生的高强度的光。汞弧灯产生的光,即使连续的紫外和可见光谱集中在离散波长为365,400,440,546,和580纳米。氙气灯在整个频谱中有更均匀的强度分布图,从紫外到红外。在确定适当的光源,荧光显微镜荧光染料的选择是至关重要的。一些荧光探针的激发带,配合突出的汞线,而其他受益分布比较均匀照明的氙灯。

在荧光显微镜中的弧光灯的适当的对齐是至关重要的,以实现科勒照明,以避免在荧光图像的亮区和暗区。因此,在灯箱的质量往往可以判断对应正确的灯的稳定性和由调整旋钮的效率保持对齐。的灯座应配备灯定心螺钉允许为中心的圆弧的图像中的物镜的后孔,灯箱应包括一个红外的波长很长的过滤器来阻止远红光和红外光,产生大量的热量。几个灯箱的设计有一个内置在红色抑制滤波器(例如,一个肖特BG38),或一个时隙为这样的过滤器,以消除在某些应用中的视场看透红色背景。此外灯箱本身不应泄漏有害的紫外线的波长,优选地,应设有一个开关自动关闭灯泡壳体在操作过程中被不经意地打开。最后,灯箱应该坚固,足以承受在操作过程中可能燃烧爆炸。

荧光显微镜应用广泛的多样性常常呼吁为光源,以满足特定荧光成像条件。在某些情况下,需要非常低的照射可结合一个超灵敏的照相机系统,而对于其他的调查中,强激光的激发可能是必要的,以便杀死活细胞或选择性地漂白的荧光团。波长的要求通常跨越整个可见光谱区中的,以及部分的紫外线和红外线。因为这些多个照明要求不能满足单一光源,制造商现在提供适配器,使两个或两个以上的灯可以同时连接到一个单一的显微镜。

荧光滤光片组合

正如前面所讨论的,垂直照明光通过透镜和隔膜终于遇到激发光滤光片,安置在一个光学块的位置,以配合所述照射器的光路和显微镜的光学列车的轴线之间的交点。激发光滤光片选择从广泛由灯所产生的光谱的波长的窄频带,并且将它们传递到二色镜,这反过来,反射光的通过物镜到标本。由物镜聚集的荧光发射通过再次通过二色镜,并在固定的目镜膜片形成图像之前的排放量或屏障过滤器。常用的过滤器进行分离波长频带的宽视场荧光显微镜,包括有色玻璃滤光片和干涉薄膜过滤器(或两者的结合)。确定合适的过滤器中每一步的荧光显微镜的照明和成像计划会引起混乱,由于大量涉及过滤器的制造商,这有助于一个专有的字母数字命名的荧光文献。

一个典型的荧光过滤器块的解剖结构的示意性图解在图7中,随着二色镜,激发和阻挡过滤器相关的频谱档案。过滤器可以阻止通常由生产商提供的自定义工具组装在一起,因此,操作员可以互换滤波器和二色镜。激发和阻隔过滤器固定到位的固定夹,光学胶,或圆形螺纹安装(见图7)。在一般情况下,这些过滤器可以除去,因为它们被定位在在平坦的外表面的凹孔的光学块,而无需打开。更换二色镜是比较困难的,并且需要完全拆卸的块,以获得进入内部。大多数块部分投用45度对角线联合提供双重职责,保护内部和适当的角度支持双色镜。取出后块部分(标签或小螺钉)的紧固件,反射镜可以被删除,通过松开或移动的固定夹,然后非常仔细地滴块。双色镜应谨慎处理,因为通常不会干涉镀膜保护,可以很容易划伤。几个谁提供售后过滤器和各种荧光应用双色镜,显微镜公司还提供了多种选择的过滤器制造商。

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荧光滤光片的设计包括长通,shortpass(边缘滤波器),带通滤波器和窄,中,宽的家庭。一些常见的过滤器配置文件的实施例示出由图7中给出的光谱。发射滤光片光谱(蓝色曲线),在图7中所产生的一个长通干涉滤光器,具有约575纳米波长的切口上。通过过滤器发送较长的波长更短的波长,而被阻止。从相同的一组(红色曲线,图7)有一条狭窄的带通激发滤光片约20纳米的带宽,而在二色镜(绿色曲线)近似的培养基中(455-490纳米),和宽的带通滤波器(560具有透射区域-775纳米)。由于二色镜有效地作为一个长通滤光片的绿色,黄色和红色区域的可见光谱(560到700纳米),它被视为这样的过滤器集。如何荧光吸收和发射光谱的荧光显微镜,可以用来选择合适的过滤器设置的工作知识是这项技术的成功实施至关重要。

双色镜(分光镜)在荧光显微镜过滤器组合,是最关键的部件,类似于长波干涉型滤波器,多层介电材料制造紧公差。二色性反射镜和一个标准的干涉滤光器之间的主要区别是,镜子是专门设计用于在定义的边界波长的反射和透射,必须工作在以45度的角度相对于显微镜和照明器的光轴。二色性反射镜的位置与面临的激发光源的干涉涂层,以反映潜在的激发波长在一个90度的角度通过光火车试样。相同的反射镜也必须作为发送滤波器,通过从物镜到像平面的长波长的荧光发射。因为几乎全反射及最大传输的波长之间的过渡区域往往局限于只有20纳米或30纳米,二色镜是能够精确区分激发和发射波长。

设计,使一个特定波段的激发波长完全匹配的二色镜的反射区域在荧光滤光片集。其结果是有效地通过显微镜观察,到样品上的激发光的反射。从检体的荧光发射必须与高透射区域中的二色镜,以使通过这些波长的检测器。屏障过滤器的总体方案中是不太重要的,但仍然起着重要的作用,在确保散射和反射的激发波长,荧光物镜以外的探针,和一般的背景由于自体荧光的强度被删除。在创建过滤器设置的最重要的因素是做出一定的透射,反射和发射的配置文件中所涉及的过滤器匹配适当的区域。否则,激发波长可能能够通过双色镜和雾图像,或者荧光发射,可以在不经意间反映在镜子危及图像亮度。

即使在看似完美的匹配滤波器的组合,个人滤波器的光谱之间发生的轻微重叠,以减少性能。特别令人关注的是激发光滤光片和二色镜,从而使部分的激发光通过镜子反映从过滤器块的壁之间的串扰。高度倾斜的角度处反射的光可以部分地透过的屏障过滤器,如上面所讨论的,以降低图像的对比度。通过过滤器的这种类型的泄漏被称为渗色交叉,发生或大或小的程度上,几乎所有的过滤器组合。两个过滤器的制造商和显微镜公司关注的主要领域之一是,提高了设计的荧光的过滤器组合,以减少交叉的水平。

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荧光过滤器组的配置如图8所示。的过滤器块,转塔(图8(a))包含了5个块,同时调查的快速切换滤光片组合的荧光基团的至少一些。炮塔插槽通常是充满了一个虚拟的光学模块或透射光观察空置。是完成了与激发平衡器(图8(b)),它包含一个单一的干涉滤光器安装在旋转微调的激发光谱成像双重或多重标记的标本。旋转调节杆的激发平衡器移动的过滤器,以更短的波长的带通透射区域。因此,当平衡器过滤器是从零度入射角(垂直于垂直照明轴)的最大旋转角度为45度的旋转,过滤器的带通区域的可移值的范围在25和50纳米之间。励磁平衡器可单独使用或串联下观察,以平衡的发光强度来改变荧光染料的激发带宽。此功能使标本中包含多个探针的荧光强度进行微调,例如,减少的荧光发射一个探测器,同时增加了强度另一个。

薄膜涂层技术的快速进步,证明了在一个单一的干扰滤波器和制造交错带色镜的反射和透射能力建立多个传输峰。正确匹配时,两个多频带滤波器和一个二色镜可以结合起来,以产生多个荧光的过滤器设置,可同时由多个荧光团的激发和发射观察。过滤器组可从制造商,适合用于与两个,三个,甚至在同一试样的4个荧光团。多个过滤器组的主要问题是它们的费用和交叉或放气,通过过量的发射荧光探针从一个发送用于另一个通过一个带通区域时所发生的。在某些试样(和过滤器集),具有显着的渗色的背景上的强度和图像的对比度的影响。许多研究者喜欢荧光图像分别与优化过滤器集,随后结合成一个复合的图像。

先进的荧光技术通常需要使用一些与一个单一的二色镜的激发和发射滤光片。为了方便这些调查,许多荧光显微镜都配有电动滤光轮或滑块含有多达六个独立的过滤器(参见图8(C))。设计用来与滑块的显微镜载用于插入滑块的垂直照明专用插槽中,或可以被取代的过滤器的滑块通常包含中性密度滤光片。排放滑块也可以容纳由垂直照明显微镜在某些设计中,或辅助中间管之间安装的照明灯和观察管,以容纳滑块。电动含有激发滤光片滤光轮单位一般都夹入垂直照明光学通路在直立和倒置显微镜之间的中性密度滤镜和灯箱。同样,被放置机动发射滤光片轮组件之间的垂直照明和目镜观察筒直立显微镜的设计,但通常通过相同的作为倒仪器的检测器,用于外部端口连接。激发和发射滑块和电动滤光轮单双色镜双重和三重激发应用是非常有用的。省去重新定位过滤块,同时观察一个单一的标本,这些配件的图像之间,使调查获得准确的登记。

荧光显微镜的物镜

在各种形式的反射光显微镜(包括荧光),图像强度是物镜的数值孔径和放大倍率的函数。事实上,强度或亮度(定义为每单位面积的光子通量和时间)增加的数值孔径的四次方,但只有放大倍率的平方成反比:

强度α(NA OBJ4 / M 2

其中,NA是物镜的数值孔径,M是放大倍率。很明显,从这种关系中,最亮的荧光图像,将被收集的高数值孔径的物镜和低倍率(如0.75/20x)。作为一个例子,一个60X的平场复消色差透镜油浸物镜数值孔径为1.4理论上将产生更明亮的图像相同的数值孔径比100倍的物镜,但也有权衡考虑。增加内部透镜元件的数目(具有最高的数值孔径物镜)产生相应的增加的自发荧光强度减少从内部透镜表面的反射。通常情况下,最高的校正因子和增加光传输之间的妥协是由制造商在他们的推荐物镜,荧光显微镜。

在一般情况下,高数值孔径的油(1.3〜1.4)和(1.2)水浸泡平成荧光和平场复消色差的物镜产生明亮的荧光图像,因为其巨大的聚光能力。这些物镜,显示出优异的颜色校正,并且因此,能够在同一平面上集中广泛的荧光发射波长。的光传输特性的复消色差和萤石的物镜是非常优秀到约350纳米,用于检查在紫外区(如DAPI,Hoechst公司的Alexa Fluor 350,和AMC)被激发的荧光染料的绝对要求。尽管有众多的内部镜片,这些物镜从低荧光玻璃制成,带防反射涂层,以尽量减少背景荧光和产量的图像非常高的对比度。在观察过程中的图像的亮度也可以通过减少从标准的10倍下降到8倍或更低的目镜倍率增加。

设计专门的应用程序的物镜是广泛使用的荧光显微镜。在这个类中,包括高数值孔径的水浸泡,多浸渍(油,水,和甘油),和紫外线的物镜有石英透镜元件。对于活细胞成像应用,长工作距离的物镜与校正铤必要通过观察厚(0.5-2毫米)培养瓶中墙。促进深厚标本内的考试物镜,有一个很长的焦距(工作距离),这是可从几个厂家的成像与盖玻片通过空气或水。长工作距离的设计,可以使用,不用玻璃盖的水浸泡物镜也有特氟隆的鼻锥,使得物镜可以浸入水溶液。类似的物镜产生的紫外线激发(340纳米)的水,在20和30毫米之间(包括水约5毫米)的工作距离。对于相对低倍率的调查中,20倍水浸泡的物镜具有非常高的数值孔径(0.75〜0.95)的建议。虽然挺贵的,这些物镜产生极其明亮的图像的荧光浓度和/或量子产率的情况下,边际。

荧光显微镜配件

制造商正在不断地生产有用的附加他们的仪器的辅助单位,以增加在荧光显微镜成像应用数量不断增长的可用选项。例如,一个长方形的场站(见图9),限制标本被照亮区域,以提高对比度和降低漂白,可作为一个选项在某些显微镜。取代传统的光圈的垂直照明的视场光阑(一个可移动的模块)的模块化的视场光阑,并设计成与数字成像传感器的高宽比相匹配。矩形区域停止科勒照明,提高了工作效率,并减少电子传感器的信号对噪声比。作为一个额外的好处,可以调整图像的矩形大小,以配合舞台步长时,采用可编程扫描卷积调查阶段。针孔孔径,坐落在的矩形区域停止类似的模块,需要一个高度受限的照明领域的应用。

fluoromicro figure9

其他配件包括双,使两个光源(如汞和氙弧放电灯),同时连接到垂直照明灯的灯壳体适配器。适应激光激发的专业照明,也可应用,如全内反射荧光(TIRF),荧光寿命成像显微镜(FLIM),比成像,和漂白恢复实验。此外,大多数的主要制造商所提供的研究级荧光显微镜容易地适应其各自的激光扫描共聚焦配件。直立接受激光共聚焦显微镜扫描单元通过三目观察筒,而倒工具可以附加束扫描仪显微镜框的侧面或后面港口。双端口之间的垂直照明和观察管插入引入额外的光源,或指示荧光多个检测器可以是有用的。大多数单位都提供可选的C型安装适配器或标准显微镜端口接头。双端口适配器也可用于同时从一激光源和电弧放电灯管外壳的后部的垂直照明的附加 ​​光纤电缆。

荧光显微镜专为电的调查已经变得非常复杂。许多人都配有专门的振动衰减的阶段,它可以接受显微操纵器配件各种各样的实验中使用的荧光,红外微分干涉对比(IR-DIC),和传统的明场对比增强成像技术。摇摆物镜转盘使快速振动的自由交换的物镜而成像的活细胞和组织,以防止干扰的标本或气泡的侵入。荧光宏观观察生物体是可能的新高数值孔径工作距离长,2x和4x微距镜头(物镜),都配备了专门的过滤器组合块。此外,一些制造商提供他们的体视显微镜配件荧光垂直照明器和过滤器集。

放大倍率为1.25倍至1.5倍,有时可在垂直照明作为一个选项,但只要有可能,应尽量避免使用辅助镜头由于引入空放大倍率荧光图像的固有问题几个模块化垂直照明设计包括安装分光器模块包含多个相机接口上面的照明灯,以增加成像能力的规定。考虑到广泛的电动配件现在可用荧光显微镜,包括nosepieces,聚光镜,过滤轮,阶段,调查比以往任何时候都更先进的成像技术。制造商设计配件施加一个显着的大量的努力,许多是一次可能只用显微镜使用从各种来源的售后零件构成的复杂的荧光应用。由于荧光显微镜在细胞生物学,神经生理学,临床上成为一个日益重要的工具,创新的新的显微镜配件的发展无疑将是一个持续的趋势。

倒置荧光显微镜设计

垂直荧光照明的相似版本倒置显微镜支架(组织培养)。倒站还允许反射光的荧光和透射光显微镜不同的对比度增强技术的结合或交替之间。研究级倒置显微镜配有多个(最多6个)的输入/输出端口中,通常会与在框架的每一侧上的单端口,以及一个或两个端口(上部和下部)的后方和下方的基底部端口显微镜。在某些机型中,主图像可以通过以下方式获得的三个或更多个端口的同时,不使用中继透镜。这种级别的连接,可以使用多个光源,滤光轮,和摄像系统的复杂的荧光分析。含汞和氙lamphouses的倒置显微镜可与标准的多元素或以提高性能和减少紫外线和红外光谱区的像差的非球面收藏家镜头。此外,广泛的灯箱适配器可以用来附加一些照明光源,类似于直立式显微镜配件。

fluoromicro figure10

如图10所示,是现代倒(组织培养)荧光显微镜配备了珀耳帖冷却的CCD图像传感器和一个传统的35毫米胶片相机系统的剖开示意图。虽然胶片相机的用途有限,大多数倒置显微镜还包括这些附件的前线基地的下部的端口。在图10中示出在显微镜使用安装在柱子上的钨卤灯室可以执行传统的明视野透射照明(有或没有对比度增强)。汞或氙弧放电灯采用荧光显微镜使用专门配置的后端口连接到的反射光照明。随着中性密度滤光片,透镜光阑和视场光阑附近的端口进行访问,在显微镜的后部。在一些倒置显微镜模型(未示出),一个L形的反射光照明含定心隔膜是可用以提高访问额外的配件后辅助端口。通过显微镜光路在图10中示出在黄色的未经过滤的弧光灯照明的透射光,紫色,绿色过滤的荧光激发,红色荧光发射。

现代倒置显微镜帧,像他们的同行直立,计算机设计和制造复合材料结构和热稳定性。此外,机械的阶段的元件和电路结构的设计与短行程距离和高刚性,以避免在常规操作期间,如DIC棱镜插入或调整的客观校正铤物镜转换器时,被操纵的俯仰和偏航。物镜转换器的高级阶段是在时间的推移和长荧光观测,能够从根本上消除焦点漂移。其他阶段选项不适用于标准的直立显微镜包括滑翔和360度旋转的阶段,玻璃舞台嵌入板,加热板,培养皿板持有人,和二氧化碳培养箱室。

倒置显微镜具有模块化的设计可以很容易地被配置在电调查,体外受精,显微操作,高分辨率的DIC,视频增强的观测,以及各种先进的荧光技术。共聚焦和多光子显微镜,工具也很容易适应。摩托配件包括百叶窗,过滤轮,旋转物镜转盘,荧光块塔楼,聚焦驱动器和聚光镜。当加上先进的物镜,可在工作距离长,水浸泡,紫外线激发,相衬,都具有高度的光学矫正,倒置显微镜进行荧光活细胞和组织的调查,是理想的工具。

结论

在荧光显微镜中,试样内的本地化的荧光基团的浓度之间的巨大差异,从一个不同的消光系数和量子产率的荧光染料耦合到另一个,对于一个给定的量,激发光强度产生显着影响发射信号。这些综合因素考虑,许多标本中只有极少量的荧光材料在任何特定的视场,产生的荧光发射是四到六个数量级小于激发光强度的平均电平 ​​。此外,一些更复杂的荧光技术,如原位杂交和共振能量转移(FRET),有发射信号的强度,范围可以9至10个数量级小于激发。为了弥补这些大的激发和发射的强度差异,现代的荧光显微镜必须能够激发照明水平超过10亿次,而不会干扰的荧光信号衰减。

在荧光显微镜的主要属性是较高的特异性荧光探针的吸收和发射特征波长的光,导致该技术能够在非常低的浓度,在复杂的混合物中选择性地检测物镜物质。此外,高灵敏度和空间分辨率的荧光被精确定位,并研究了在长度尺度下方的光学显微镜的分辨率,使单分子。本地化的环境因素的影响也非常重的荧光发射,因此该方法是一种理想的pH值,粘度,离子浓度,分子的距离和方向,膜电位,疏水性,电荷分布和扩散系数的波动探针。的时间分辨率荧光激发的荧光探针,它可以是纳秒量级的寿命是有限的。由于许多生物过程发生在这个时间域,衰减动力学可以揭示细胞过程的动态信息。两者统称,这些因素在荧光显微镜的应用是至关重要的细胞生物学。

荧光显微镜已经进化惊人的速度在过去的十年中,激光技术的发展同样迅速,固态探测器,干扰薄膜制造,和基于计算机图像分析。发展高数值孔径的水浸泡物镜进一步协助调查的生物现象,让研究者深入探究在自然环境中在活细胞内。随着显微镜制造商应对不断变化的需求的研究社区,先进的的荧光仪器和配件的发展将毫无疑问地继续,他们最终的贡献,探索大自然的奥秘最终可能有着深远的意义。