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奥林巴斯显微镜:什么是荧光?

2013-10-16  发布者:admin 

当试样,活的或非活的,有机或无机,吸收和后来重新焕发灯,这个过程描述为光致发光如果光的发射,激发能量(光)后,便不再持续几秒钟,该现象被称为磷光荧光,在另一方面,描述了光发射的激发光的吸收仅在继续。激发光的吸收和再辐射光荧光发射的时间间隔是异常持续时间短,一般不超过百万分之一秒。

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荧光的现象是19世纪所产生。英国科学家Sir George G. Stokes首先观察矿物萤石具有荧光,用紫外光照射时,他创造了这个词“荧光”。斯托克斯观察荧光光具有更长的波长比激发光,已经成为一种现象,被称为斯托克斯位移在图1中,一个光子的紫外线辐射(紫)在一个简单的原子,令人兴奋的电子碰撞,并提升到一个更高的能量水平的电子。随后,被激发的电子放松到一个较低的水平,并在可见光区域的低能量光子(红色)的形式发射光。图2是可见光范围内的电磁辐射,其中包括约400〜700纳米的波长范围内的图解表示。周边的可见区域高的紫外线能量和较低的能量的红外光。

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荧光显微术是一个极好的方法,可以发出荧光,可以在它的自然形态(称为原发性自体荧光)或用能够荧光(称为次级荧光)的化学品处理时的研究材料荧光显微镜卡尔·赖克特8月科勒,和海因里希·莱曼在二十世纪早期的一部分,制定,等等。然而,此仪器的潜力没有实现了几十年,和荧光显微镜现在是一个重要(也许是不可缺少的)工具中的细胞生物学。

早期的调查显示,许多标本,包括相关微量矿物质元素,晶体,树脂,生药,黄油,叶绿素,维生素,和无机化合物,用紫外线光照射时表现出的自体荧光。然而,它不是直到1930年,奥地利研究者最大Haitinger和其他科学家开发的技术,它采用二次荧光荧光染色标记特定的组织成分,细菌和其他的病原体,不自体荧光。标签特定的生化指标,在这些荧光染料的污渍,促使人们使用荧光显微镜。该仪器的价值显着增强,由1950年的组织中,用荧光素标记的抗体反应,当阿尔伯特浣熊和弥敦道卡普兰显示本地化的抗原。

 

荧光显微镜的基本任务是允许激发光照射试样,然后单独远远弱于从明亮的激励光发射的荧光。因此,只有从检体的发射光到达眼睛或其它检测器(通常是一个数字或传统的胶片相机)。黑暗的背景下产生的荧光的领域再铸辉煌足够的对比度,这样可以检测。越暗的背景后面的非荧光材料,仪器的效率就越高。

图3表示用荧光显微镜观察荧光的标本时,出现的图形表示。通过光从紫外线发射源通过励磁机过滤器所产生的紫外线(UV)光的特定波长或波长组。过滤的紫外线光照射的试样,在这种情况下,氟石的晶体,这反过来又通过紫外线光照射时发射荧光的光。从检体在图3中,红色,发出的可见光通过屏障过滤器不允许通过反射紫外光,然后过滤。应当指出,这是唯一的模式,其中显微镜标本,激发后,产生自己的光。所发出的光在所有方向上(在一个360度的角度),激发光的方向无关的再辐射球。

荧光显微镜是一个迅速扩大的调查和宝贵的工具。其优点是根据属性不那么容易可以在其他光学显微镜技术。荧光染料的使用使得有可能具有高度的特异性荧光材料之中,以确定细胞和亚微观细胞成分和其他实体。更重要的是,在荧光显微镜可以揭示与精致的灵敏度荧光材料的存在。一个非常小的荧光分子数(50每立方微米的分子数)可以被检测到。在一个给定的样本中,通过使用多个染色,不同的探针将揭示单个目标分子的存在。虽然在荧光显微镜不能提供的各试样的衍射极限以下的空间分辨率,低于该范围内的荧光分子的存在下显着可见。

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荧光显微镜的技术可以应用到有机材料,以前住(生物)材料,或有生命的物质(与使用在体外在体内的荧光染料)或无机材料(尤其是在半导体晶片上的污染物的调查) 。也有许多研究使用荧光探针监测快速变化的生理浓度的离子,如钙和镁,和在活细胞中的pH值。

许多植物和动物组织中,以及材料和试样,固有荧光照射时更短的波长的光(主或自体荧光)。自体荧光植物研究,煤岩,沉积岩岩石,在半导体工业中已发现有用的。自体荧光在动物组织或病原体的研究,往往是极其微弱的,或如非特异性自发荧光用处很小。的更大的价值等标本,通过照射光,被激发和发射的光的最终产率是力度更大的外在荧光染料(也称为荧光团)。这样的荧光被称为次级荧光。

荧光染料渍,有点类似较知名的可见光吸收组织污渍,重视自己可见或亚可见的有机物。这些荧光染料,能够吸收,然后再照射光,往往是高度特异性的,在他们的附件定位在吸收发射比(称为量子产率的概念,并有显着的产率这使得荧光染料极其宝贵的生物应用。使用荧光显微镜的增长,数以百计的荧光染料与已知强度激发曲线(吸收)和排放和理解生物结构目标的发展是紧密相连的。

图4中所示的两个最常用的荧光染料,在荧光显微镜。流行的核酸染色,4',6 -二脒-2 -苯基吲哚(DAPI),在图4中左边的分子,是具有两个亲核性很强的脒基部分,这是有用的荧光标记核酸的吲哚衍生物,并具有被广泛地应用于病原体的快速鉴定的荧光分析。最初作为一个潜在的抗锥虫剂的合成,DAPI结合腺苷和胸苷(AT)碱基对的DNA区域中被激发的最大吸收波长为355纳米的紫外线。在可见光光谱的蓝色区域中的染料发出荧光。DAPI分子的右侧(图4)是另一种荧光染料,德克萨斯红,荧光共轭物中的属性已经过深入研究。此荧光染料被开发用于在应用程序中的双标记被称为流式细胞仪,但广泛地用于在荧光显微镜中用于抗体检测的罗丹明(另一种常用的荧光染料)。

在许多情况下,组合使用得克萨斯红用DAPI和异硫氰酸荧光素(FITC)的乘法,由于红色,蓝色,和绿色的荧光染料,可以观察到染色标本。当决定哪些标签使用荧光显微镜,它必须牢记,选择应具有较高的荧光激发光吸收的可能性,并应保持连接到目标分子。还应该能够提供令人满意的产率发射的荧光的荧光。

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荧光显微镜的最重要的应用之一是在免疫荧光字段活的动物制造无数的使用,配合白血细胞,以消除任何进入异物,如病毒,细菌,外源蛋白,其中含有或产生抗原的抗体。抗原-抗体反应是高度特异性的,常示意性地比作锁和钥匙的关系。免疫荧光显微镜的敏感性和高度的特异性免疫展出之间的婚姻将其成功归功于。

在直接免疫荧光法中,被标记的特异性抗体,通过化学附加荧光色素的形成,什么是已知的作为共轭物含有怀疑存在已知的一个特定的抗原刺激抗体的生产显微镜载片上,然后将其传播。如果抗原存在时,标记的抗体结合物与抗原结合,并结合到所述试样被洗涤之后。当被激发的荧光在其激发峰,随后在不同波长的发光强度可以被目视观察或捕获的检测器系统(数字或传统相机)的化学附着的荧光共轭物和抗原的存在下证明。

另一种常用的技术被称为间接免疫荧光法,其中可能含有未标记的抗体及其相关的,但已知的血清,抗原一起孵育。甲荧光标记的抗人抗体(如果被测试的试样是人类),然后放置在幻灯片上含有的未标记的抗体-抗原。如果确实出现了抗原-抗体反应,荧光素标记的抗人抗体附着形成的复合物的抗原和抗体。随后,抗原,抗体,和荧光染料标记的抗人抗体的标记的分组在该荧光强度的峰值波长激发,观察到任何因此而产生的排放。间接免疫荧光技术,降低库存大量标记抗体的必要性,也通常会导致更大的荧光强度。

à相当面积的荧光调查与细胞化学和组织化学染色。荧光染料已被用于识别染色体DNA含量,蛋白质,细胞结构,激素和维生素。荧光显微镜是一个功能强大的工具,在这些研究中,因为所选荧光染料精湛的灵敏度和他们极微量标本中特异性。事实上,虽然在荧光显微镜是有限的,其空间分辨率受数值孔径衍射极限,荧光探针的一般规则,可以通过发射光,揭示存在的荧光材料,这种材料可见,即使目前在只能分分辨率的数量时(例如几个分子)。

涉及了一批新兴的应用荧光显微镜荧光探针(荧光染料)生活物资,无论是在体外(玻璃)和体内(在生活中)的应用这些探头,因为可能的毒性限制繁殖困难。此外,相当数量的重视,必须支付的时间间隔,因为不断变化的性质的生命过程和细胞内结构的运动。荧光调查已经应用到重要的生物离子,如氢(pH值),钙,镁离子浓度的变化,绑定和非绑定,。

其中最有名的是研究细胞内钙离子荧光探针采用了时下流行的Fura-2 对于这种染料,双激发波长为约340纳米和380纳米(使用光斩波器和双激发滤光片或单色仪)可以监测在一个单一的发射波长,这是衡量独立地为每个激发带。一台主机控制显微镜是用来计算的比率(被称为荧光成像过程)绑定到细胞内游离钙荧光强度的变化所揭示的。的比的方法的优点是,基本上所有的因素,除了双近紫外光的激发波长,其中每个产生在可见光谱的绿色部分中的排放保持恒定。用探针被称为印度1比成像进行类似的类型对于该荧光染料,绑定和非绑定的细胞内钙的测定,也可用于一个单一的激发波长,但发射的测量是在两个波长区分绑定未结合的钙。