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尼康显微镜:随机光学重建显微镜(STORM)

2013-10-16  发布者:admin 

所提供的宽视场的多个成像模式中,激光点扫描共聚焦,多光子荧光显微镜允许非侵入性的,固定和活细胞和组织中有高水平的特异性生化时间分辨成像。尽管传统的荧光显微镜的优点,该技术在超微结构的调查,由于光的衍射,可以与标准的目标捕获的信息量限制设置的分辨率极限的阻碍。在过去的几年中,已经采用了一些新颖的仪器为基础的方法来规避衍射极限,包括近场扫描光学显微镜(NSOM),受激发射损耗(STED)显微镜,饱和结构照明显微镜(SSIM)和地面状态枯竭(GSD)。这些技术都实现了改进的横向(x - y)分辨率下降到几十纳米,更不是一个数量级的下方施加衍射极限的,但每种方法都有一套独特的局限性。

风暴超分辨率成像的基本原理

 

有限的空间出现在光学显微镜的分辨率极限从什么一个多世纪以来被认为是一个基本的物理规律的光聚焦到一个离散点在图像平面固定。恩斯特·阿贝在1873年首先描述,在显微镜的最终解决方案是不受制于仪器的光学质量,而是由光的波长用于收集图像和孔径角光学系统。在正式的书写方式,侧向和轴向分辨率限制的数学描述由下面的公式: 

 

 


Resolutionx,y = λ/2NA (1)
 Resolutionz = 2λ/NA2(2)

 

 

 

其中,λ是照明的透射光或荧光的激发波长频带的平均波长。的物镜的数值孔径(NA = nsin(θ))由成像介质的折射率(N,通常是空气,水,甘油,或油)的孔径角的正弦值乘以(sin(θ)被定义)。根据阿贝的理论,图象由从数组中的衍射限制的点,具有不同强度的重叠,以产生最终的结果。因此,优化的空间分辨率和图像的对比度的唯一机制是通过减少成像波长,增大数值孔径,或使用具有较大的折射率的成像介质的衍射限制的点的大小最小化。然而,在理想的条件下,横向分辨率仍然有限接近200至250毫微米(见公式(1) 的 相对适度的水平,而轴向分辨率则更差(公式(2) ),500 纳米的顺序。当试图高度曲折的图像的功能,如细 ​​胞器,衍射限制的分辨率表现为不良轴向切片能力,并降低对比度在成像平面上。此外,整体实现三维标本的标本的对比相对较差的轴向分辨率一般是占主导地位的。

已被广泛使用激光扫描共聚焦和多光子显微镜适度提高沿横向和轴向的轴的空间分辨率,但这些技术仍然有限的方面实现显着改善。加上针孔限制在共聚焦显微镜检测的聚焦激光激发,在原则上,由1.4倍提高空间分辨率,虽然这只有在信号与噪声在一个显着的成本实现。同样地,多光子荧光显微镜利用非线性吸收过程,以减少有效的激发点扩散函数的大小。但是,再次,更小和更精细的点扩散函数被抵消的必要性,使用较长波长的激励光。作为一个结果,而不是提供显着改善的分辨率,共聚焦和多光子显微镜比传统的广角技术的主要优点是减少排放源的焦平面(焦亮),使去除背景信号源自三维容积重建成像方式获得清晰的光学部分。

虽然近场扫描技术(例如近场光学显微镜),可以达到很高的分辨率的衍射极限的光学系统使用的情况下,它们是难以操作的,非侵入性的模式,必须紧跟在试样表面的地形轮廓,并没有多大用处胞浆内固定或活细胞成像深。被称为受激发射损耗,GSD和SSIM 合奏聚焦光成像技术,并基于对非线性光学效果,通常需要专门的调制滤波器的应用程序的多个高强度的脉冲激光激发光束的几何形状控制(一种技术通常被称为点扩散函数工程)。已解决成本过高的脉冲激光器CW-STED系统,实现成本较低的连续波激光器引进。即使能够实现横向分辨率在几十纳米测量点扩散函数的修改方案是,这些方法可能会损坏标本激发光水平高,要求耐漂白的荧光探针。此外,他们依赖于高度复杂和专门的显微镜配置的平均细胞生物学家难以组装。

单分子成像

全内反射荧光(TIRF)显微镜检查居住在几百纳米的盖玻片平面的荧光探针作为一种可行的技术的出现,本方法所提供的单分子检测能力提供了新的可能性,获得子衍射分辨率成像。可以收集足够数量的光子,单发射器的位置可以被确定为几乎任意精度高。基于这个原则,一个TIRF相关的技术称为荧光成像与纳米精度(FIONA)是第一显示本地化的荧光探针具有精度高,准确地确定其衍射极限点的中心位置的方法之一扩散函数。不幸的是,定位精度FIONA不直接转化为超分辨率成像由于这样的事实,在靠近的多个发射器(将被发现的标记的细胞器或膜)仍然是困难的,如果不是不可能的,要解决的。

一些其他单分子成像技术已聘请独立的发射器本地化具有精度高。通过施加光,有选择地去除单个分子一个FIONA相关的称为本地化纳米的多个单分子荧光显微镜(NALMS)被证实为解决受衍射限制的区域内重叠的相同的荧光探针之间的距离的技术。同样地,类似的技术相关的FIONA称为单分子漂白与高分辨率成像(SHRIMP)利用光漂白紧密间隔的荧光基团中的两个或更多个顺序地从已漂白的最后一个发射器来确定自己的位置。单分子高分辨率共存(鸿业)推出的两色版本FIONA使用两个检测通道之间的受托标记监察注册。另一项相关调查监测扩散到一个固定的生物目标漂白高分辨率成像的荧光探针的结合,被称为纳米地形(油漆)的成像点积累。不像虾,NALMS,鸿业涂料不仅限于发射器,就可以解决,随后将讨论与超分辨技术,更紧密的分子密度。其他相关方法涉及利用量子点的基础上随机的和可逆的进入黑暗状态,荧光团的本地化实验也被分离和本地化基于其光谱的差异。

商业风暴仪器配置

上述新型的单分子技术能够本地化个别荧光发射精度高,但他们是唯一有用的探头时,都非常好密度介乎10至50每平方微米的分子彼此隔离。的相当大的分子间的间距是必要的,以确保可以精确地确定每个荧光团的位置不重叠的发射器的显着的干扰。此外,单分子的方法,如菲奥娜,NALMS,涂料和虾都无法识别具有不同的分子机制,使单个发射器的顺序读出从定义一个特定的亚细胞结构的荧光团大合奏。因此,它不是直到重标记的试样施加两个不同的荧光发射状态之间的光控或光转化单分子(也称为基于探测的)的超分辨显微镜成为了现实。支持基于探测的超分辨成像技术发展的另一个定义是引进微光电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)相机系统,有精致的单光子探测灵敏度。

如图2中所示是一个设计的显微镜进行单分子的超分辨率图像的二维和三维的(这将在下文中更详细讨论)的商业实现。该仪器能够实现20和30纳米和50和75纳米的三维成像之间的轴向(z)的分辨率之间的横向(,)分辨率。单分子成像的轴向范围为约500纳米,并且通过扫描样品载物台或目标在Ž方向,可以进一步提高。注重漂移校正系统,使研究人员能够保持正确的焦平面进行单分子成像时,在60倍的目标,以100倍的范围使用水和浸油技术。此仪器的激光器包括50毫瓦405纳米二极管装置,以及个人200毫瓦的固态激光器的光谱线在488,561,647纳米的覆盖范围通常用于单分子荧光团成像。最后,图像EMCCD相机连接到显微镜控制软件系统,使用记录。振动隔离表是需要仪器的稳定性。

单分子超分辨率成像

浮现在四个月内优雅地展示在2006年的顺序和随机读出多个单分子光开关的染料或光学荧光笔荧光蛋白的荧光标记在密度接近普遍采用的标本的精确定位技术独立三重奏广角和共聚焦荧光显微镜(高达100,000分子每平方微米)。这些几乎相同的单分子超分辨成像技术被称为随机光学重建显微镜(STORM ;见图1),光敏定位显微镜(PALM)和荧光光敏定位显微镜(FPALM)。他们依靠在低功率应用激活激光发射开关触发,所以任何特定分子具有小概率光敏,但大部分的人口仍然在原来的(黑暗或本地的)发射状态。虽然作为他们最初发表的方法之间的主要区别只是用来实现超分辨成像的荧光探针的性质,这些技术几乎是相同的。事实上,原困的研究报告提到使用的荧光蛋白,而前掌论述了应用笼合成荧光。

风暴背后的基本原则,,PALM,FPALM,以及相关的方法是,光开关分子的激活状态,必须引起足够的光子发射连续使精确定位,然后进入一个黑暗的状态,或停用漂白。此外,人口稀少激活的荧光分子,必须相隔的距离超过阿贝衍射极限(实际上,大于约250纳米),以使并行记录许多单独的发射器,每个都具有一组不同的坐标系的横向图像中平面。如将要详细讨论的,来自图像的区域阵列检测器捕获的单分子的质心,用于确定是根据发出的光子的数量(参见图3)用精密的分子坐标。发射器的图像被捕获使用一个低功耗的读出激光(通常是跨越从1到3个摄像头帧),直到它们自发地光漂白剂或重新输入暗状态。对于多周期重复这个过程,每次产生一个随机活化的荧光基团的独特的子集,使许多荧光团的位置,来确定和总结在实验结束后,重建的图像。

参与创建风暴超分辨图像的基本步骤,在图1中使用了一系列的卡通图画。图1(a)中示出的目标结构示出了假设标记的丝状密集的细胞内结构的网络,它可表示与微管蛋白和肌动蛋白的单体单元构成的细胞骨架的生物聚合物。在图1(b)中,一个稀疏的荧光探针被激活以产生单分子图像(用橙色圆圈)表示不重叠的。后用数码照相机拍摄的图像,点扩散函数的单个分子的定位精度高的基础上的光子输出前探头自发光漂白剂,或者切换到暗状态。本地化分子中心的位置用黑色十字架表示。重复该过程,在图1(三)通过第1(e),直到所有的荧光探针由于光漂白或耗尽,因为背景荧光变得太高。最终的超分辨率图像(图1(g))是通过绘制荧光探针的测量位置的构造。

单分子定位显微镜超分辨率成像

在20世纪30年代,精度高,单个分子本地化的概念最早是由德国物理学家海森堡更正式的几个研究小组在上世纪80年代和20世纪90年代解决了坚实的数学基础。基本上,虽然表现在一个有限尺寸的点具有受衍射限制的尺寸时,与基于CCD的摄像头捕获的图像的一个单一的荧光发射极,可确定了精度与该分子的确切位置可以明显较高(在几纳米的范围内),提供足够的光子被捕获。这是由于这样的事实,每个捕获的光子提供了一个独立的位置测量的,与最终电平的精度,即总的测量次数的平方根成正比。用于确定分子定位坐标的方法是基于一个统计测量的光子的分布的高斯函数的曲线拟合算法。该练习的目的是要确定的光子的分布(μ),并在安装位置(不确定性,σ)的标准误差的平均值,根据公式:

 (3)

 

其中,s是发射极近似真正的点扩散函数的高斯函数的标准偏差 N 是从荧光分子捕获的光子的数量,一个是成像检测器的像素尺寸,  b 的标准偏差的背景(包括背景荧光结合探测器噪声)。公式的右手侧的平方根符号下的第一项(3)需要考虑到光子散粒噪声,而第二项包括有限的像素大小的检测器中的效果。过去长期因素的影响背景噪音进入方程。通过应用这些简单的技术,可以实现定位精度约10纳米时,测得的荧光团的激发光分布是约1,000光子和背景噪声相比可以忽略不计的分子信号。在后者的情况下,方程(3)可以近似为:

 

 


σ ≈ s/N(4)

正如所描述的方程(3)方程(4) ,在获得所需的精确的分子定位STORM成像,以尽量减少背景噪声的同时,最大限度地提高从荧光探针的光子输出高精度的结果的最关键的元件。本地化的中心在一个最好的情况,如果10,000个光子可聚集在背景上的情况下,前,无论是光漂白的荧光团或关闭时,可确定的精确度下降到1至2纳米。然而,由于收集光子数较低,定位精度越来越少。因此,如果只有400至500的光子的测量,准确度下降到约20纳米或更坏。背景在暴风成像,从天然的或转染试剂诱导的自体荧光,以及从残留要么没有被激活,或者已经进入了一个暗状态(但不是光漂白)从邻近探针的荧光产生。因此,STORM成像的荧光探针的选择应显示高对比度,被定义为光活化或光转换之前和之后的荧光发射的比例。图3中所示的是一个单独的光开关探针的定位精度。在图3(a)所示的图像档案中的Cy3标记的Cy5染料对在一个单一的周期,而在图3(c)从多个激活周期的阶段漂移校正后的质心位置的分布。插图(图3(b))示出的质心的位置。

风暴的基本概念一个相当大的变化,Palm和FPALM已采用多种激励计划及合成荧光基团和荧光蛋白的诱导暗态。因此,直接的风暴(dSTORM)操作到它的父类似的方式,但代替配对photoswitchers的(如Cy3和Cy5),该技术是能够使用常规的单机硫杂羰花青染料(包括Cy5标记的Alexa Fluor 647,一些ATTO系列荧光团)。引进dSTORM是一个重要的发展,因为它已经成为研究的主要驱动力为开发潜在的新合成荧光光开关与一个单一的激光,可以选择性地开启或关闭。同样,在修改后的技术称为PALM独立运行的采集(PALMIRA),数码相机操作不同步激活激光器或荧光探针的开关周期的高速。PALMIRA需要荧光团要么photoconvertable的或可逆的光开关的应用(无论是合成或荧光蛋白),并大大加快了图像采集速度提高了100倍。

微管的超分辨率成像风暴

在其他基于探测的超分辨方法,使用合成荧光最初报道是一种技术,单分子返回(GSDIM),经营成亚三重态驾驶它通过填充一种人工合成的荧光暗态称为基态损耗其次是发射器的图像记录,因为他们随机返回到基态。许多类似的技术已经出现,充分利用和相关现象,包括闪烁显微镜和可逆漂白显微镜(RPM),两个例子,一个看似层出不穷的技术变种托管频谱的新的首字母缩写。这些新方法所提供的最显着的潜在的是,它们是能够生成使用标准合成荧光探针,如荧光素,Alexa的荧光染料,ATTO染料,的carbocyanines和相似的染料,无论是在简单的缓冲区的一个子集的超分辨率图像或耦合到氧拾荒者和脂肪硫醇。然而,这是值得注意的,以产生真正的高分辨率图像,需要具有非常低的平均时间关断时间比的荧光基团,所以在任何给定的时间,只有一小部分的分子被激活。更具体地,约10分子可以定位受衍射限制的区域内,如果平均的通断比等于0.1。根据奈奎斯特准则(下面讨论),这对应于只有50%以上的衍射极限的空间分辨率的改善。大多数传统的荧光团不表现出合适的比例,激励探针的发展,更理想的开关性能的研究。

该系列的图4中伪彩色图像说明哺乳动物的成纤维细胞肾细胞中的微管网络的风暴超分辨成像。与多聚甲醛和glutaraldehyle的混合物中的贴壁非洲绿猴肾细胞被固定,处理前的小鼠原代α -微管蛋白抗体包被,然后用5%正常山羊血清。洗涤后,将样品与山羊抗小鼠第二抗体,以Cy3和的Alexa Fluor 647(Cy5标记的结构类似物,具有相似的光控性能)双共轭处理。暴风影音图像生成使用绿色激活激光(532纳米)和远红外成像激光(657纳米)。常规的宽视场的微管中的单个单元格的大面积的荧光图像示于图4(a)。在图4(c)相应的风暴聚集来自同一地区的图像。白盒装在图4(a)的区域放大显示在图4(b)在同一地区,使用图4(d)中所示的风暴解决。注意交织的微管划定风暴图像的清晰程度。

STORM成像的荧光探针

适合用于成像与暴风和相关的超分辨率方法的荧光探针是那些具有非常高的亮度和对比度的水平,在光漂白前每分子的光子产生的最大数目,或返回到一个黑暗的,非荧光的状态。对于所有的荧光基团的摩尔消光系数和荧光量子产率,在理想的情况下应该是100,000和0.75〜0.90的范围内,分别的值,乘以以达到最高的定位精度,相对亮度是由。此外,风暴成像的最佳的探头应表现出光谱的公司的活动和非活动的种类,充分分离,以便稳定和热稳定的光线控制的激活率相比,自发的相互转换率是非常低的。由于可以photoswitched STORM成像中使用的荧光基团,许多这样的事实,这些探针还应该表现出高开关可靠性,低疲劳率,和交换动力学,可容易地控制。因此,在光漂白或光控暗状态而言,最好的探针是那些失活可以平衡,以确保在任何特定时间,只有一小分子中是激活的激活率。

除了高亮度水平和光控稳定性的要求,超分辨率探针必须是能够拟定精度高的亚细胞目标化,他们应该具有尽可能低的背景噪声水平。荧光蛋白,混合动力系统相结合的一种基因编码的目的肽与一个单独的合成染料膜渗透物的组件,高度特异性的合成荧光团(如MitoTrackers LysoTrackers SYTO荧光团)是能选择性地靶向蛋白组装或细胞器。相反,大多数常见的合成染料和量子点首先必须是精确的标记的载体靶向分子共轭。原发性或继发性的抗体可用于免疫荧光法来合成的荧光基团和量子点定位到特定的亚细胞位置,但接近的荧光探针的目标是由10至15纳米的抗体分子介导的,精确的实际荧光涉及的单位又是不确定的。然而,免疫是一个明显的优势,它的目标是内源性蛋白,而荧光蛋白融合往往涉及的过度表达可能影响细胞功能的系统。

属性选择合成探针STORM成像

(缩写)
EX 
(nm)
EM 
(nm)
EC 
(×10 -3
QY N光子
CY3B 559 570 130.0 0.67 1400
CY3.5 581 596 150.0 0.67 5000
Cy5 649 664 250.0 0.28 4000
CY5.5 675 694 190.0 0.23 6000
CY7 747 767 200.0 0.28 1000
Alexa Fluor 488 495 519 71.0 0.92 1200
Alexa Fluor 568 578 603 91.3 0.69 2800
Alexa Fluor 647 650 665 240.0 0.33 6000
Alexa Fluor 750 749 775 240.0 0.12 450
ATTO 488 501 523 90.0 0.80 1300
ATTO 520 516 538 110.0 0.90 1200
ATTO 565 563 592 120.0 0.90 20000
ATTO 647 645 669 120.0 0.20 1500
ATTO 647N 644 669 150.0 0.65 3000
ATTO 680 680 700 125.0 0.3 1500
ATTO 740 740 764 120.0 0.1 1000
TAMRA 546 575 90.4 0.2 5000
Dyomics 654 654 675 220.0 NA 3600
DyLight 750 752 778 220.0 NA 700
IRDye 800 CW 778 794 240.0 NA 3000
罗丹明B 530 620 105.0 0.65 750
C-罗丹明 545 575 90.0 0.90 1000
C-荧光 494 518 29.0 0.93 1500
表1

表1给出的汇编所选荧光蛋白的性质和合成染料的超分辨率显微镜。随着共同的名称和/或缩写词的每个荧光团的激发峰(实施例)和发射波长(EM),摩尔消光系数(EC),量子产率(QY),相对亮度,和每分子发射的光子数每个开关周期(N个光子)上市。C-罗丹明B和C-荧光素指笼衍生物。指定ND表示尚未确定的值。创建此房产已被科学和商业文献资源的目的不是要全面。公布的报告,由于在某些情况下,广泛的光谱的激发和发射上市的高峰值可能会有所不同。以实际的荧光显微镜调查,一个特定的荧光基团的实验亮度可能会有所不同(相对而言),在此表中提供的亮度。在众多潜在的这些差异的原因,在传输或反射率的光学显微镜和相机的效率依赖于波长的变化。

最初是使用一对的橙色和红色发射硫杂羰花青染料Cy3和Cy5,组合以形成被称为作为花青开关的风暴。实际上,Cy5标记可以荧光灯和暗态之间切换在一个控制和可逆的方式,使用不同波长的光(参见图5)。用红色激光灯(633,647,或657纳米)激发产生荧光Cy5的PhotoSwitch的染料也可以回到一个稳定的黑暗状态。暴露在绿色激光灯(约532纳米)将转换Cy5的从黑暗状态的荧光状态,但恢复的速度取决于第二激活染料,CY3接近。CY3-Cy5的菁开关疲劳率是优秀的,因为Cy5 ​​的永久漂白发生之前,可以开启和关闭数百次photoswitched。这种染料对标记具有多个分隔的开关由一个明确定义的数目的碱基对的短的双链DNA分子,和风暴用于解决具有高的精确度之间的距离,相邻的花青开关。

STORM成像,也可用于各种其他光开关的合成探针。在其最简单的形式中,使用一个单一的荧光染料的光谱线的连续波激光器的工作紧密地重叠的染料的激发光谱时,可以实现风暴。的Alexa Fluor 647因此可以用657纳米的激光,完成所有三项任务所需的风暴,包括从探头的激发荧光成像,,驱动探头进入一个黑暗的状态,并重新再次回来荧光状态。的荧光花费其在荧光状态,当系统达到平衡的时间大约为0.1至0.3%,使约6,000个光子被检测每个开关周期。高光子通量和低活化平衡的结合提供了一个显着的提升图像分辨率明显提高,这是比传统的宽视场荧光图像。此技术非常适合于成像微管,肌动蛋白丝和中间细胞骨架细丝直径阿贝衍射极限远低于。

STORM成像光开关激活荧光报告基团对

图5中所示的光控特性和分子结构的硫杂羰花青STORM成像利用活化剂,报告染料对。光谱上不同的组合,这些荧光团具有光控的行为,如在图5中所示的(a)所示,在下部面板突出的荧光实时痕迹三个光开关记者:Cy5的(黄线),Cy5.5标记(橙色线),和Cy7(红色线)。每种染料配对用Cy3标记的单元,作为活化剂染料。在图5(a)的上面板的痕迹用于激活的报告染料的绿色脉冲激光(532纳米)。远红外激光(657纳米)连续照射试样激发荧光记者和切换回来到一个黑暗的状态。合适的分子结构硫杂羰花青记者和活化剂的荧光基团(b)至图5中显示的相似性,这些探针。

Alexa Fluor 647(图5)是光开关硫杂羰花青,呫吨类合成的探头,可以通过暴露于中等或强激光照明,这取决于实验参数的荧光和暗状态之间的可逆循环越来越多的家庭的成员。许多这些探针已用了数十年在制备标本宽视场和共聚焦荧光显微镜,应该是同样有用的超分辨成像。因此,广泛的荧光团,最初认为是耐光以来被证实进入黑暗状态,低氧条件下存在脂肪硫醇在温和的激光功率。其他人可以利用简单的无机水性的缓冲器或组织文化传媒具有较高的激光功率成像。表1中所列的几个研究得最多的合成染料是有用的风暴。这些措施包括ATTO Alexa的荧光染料,染料,carbocyanines,光致变色罗丹明和几个笼染料。

荧光蛋白也可以用于单分子的超分辨成像,首先利用公知的变化作为光活化定位显微镜。这些独特的基因编码的荧光探针的内在能力定义的波长带的光曝光时改变它们的光谱性质,并能够针对亚细胞结构具有高的特异性水平。荧光蛋白已被报道经过多种新颖的光致光控的特性,包括产生不同的发射和非发射状态,以及上销的闪烁行为。然而,这些属性最有用的是光敏,光电转换,光控,这是已统称为光高亮物业。因此,光可活化荧光蛋白能够从一个黑暗的状态被激活,一个明亮的荧光紫外或紫光照明时的状态,而,可以光学荧光photoconvertible蛋白转化荧光发射带宽从一个到另一个。其中最有用的超分辨成像的光活化的荧光蛋白的PA-GFP和PA-mCherry1的(参见图6)。已证明有效的超分辨技术的photoconvertible荧光蛋白包括串联二聚体Eos的(tdEOS),mEos2,Dronpa,rsCherry(可逆地切换),和青色的光活化的变型中,PS-CFP2。

潜在的最有用的一类光学荧光笔荧光蛋白包括那些能够光控间明亮的荧光和暗的状态,如Dronpa和rsCherry的。不幸的是,这些变种已经不是特别有用,在单分子超分辨调查,由于低光子输出在明亮的状态。改进的光开关的荧光蛋白变种出现时超分辨成像的候选人,因此,这将是有益的。荧光蛋白的亮度问题,仍然是一个问题,当这些探头相比,一般具有显着较高的光子输出每个分子的合成染料。例如,tdEos的相反,在超过6000的光子通常观察到的光开关的荧光Cy5标记的每个分子中产生大约500个光子。另外,硫杂羰花青染料,可以进行漂白,而不是使用荧光蛋白的数量非常有限,当之前的数十至数百个开关周期。除了从亮度的问题,新荧光蛋白候选人必须被监控生色团的成熟率和单体的性格与宿主蛋白,以避免缓慢的发展和聚集文物,分别为目标融合时表示。

量子点是无机半导体纳米晶体表现出由于密闭激子发光的荧光性质。由于这些荧光基团的金属性质的,钝化层和亲水性涂料必须应用到量子点作生物应用,和定位的,它们必须是缀合到链霉抗生物素蛋白,抗体,或一些其他的生物活性序列。在量子点的有利条件是其显着对称的荧光发射的个人主页上,可以忽略不计的漂白率,一般高的量子产率。此外,这些探头具有广泛的吸收分布,使他们能够在一个不同寻常的宽波长范围内被激发。不幸的是,卓越的耐光性的量子点,产生了一个问题,为的随机超分辨成像,直到量子点可以被转换成一个光开关的状态的情况下,就不会被解决。此外,针对量子点,这通常显示高背景水平和穷得多的合成染料标记的同行相比,本地化仍然是一个问题。

STORM成像的荧光蛋白质

一个大型图书馆笼合成染料相似的光可活化荧光蛋白(PA-GFP和PA-mCherry1)作为探针随机超分辨成像的所有变化,包括风暴将特别有用。然而,在目前的时间,此荧光类别没有被广泛开发和市面上唯一的候选人笼荧光素和罗丹明,这已被证明是有效的单分子超分辨实验版本。保持器型的合成材料可以使用的紫外线照射,以产生表现出优异的对比度,可以定位精度高,则光漂白的荧光物种的保护的酯部分脱离。尽管这些探头,其他合成染料相似,受到普遍缺乏特异性,需要援助的共轭抗体或其他靶向肽,他们持有高光子探头风暴的重大承诺。然而,直到出现较大的品种笼荧光团,这个类将仍然是有限的,对于许多应用。

在选择超分辨成像探针,研究者面临着使用合成染料或荧光蛋白的决定。利用免疫荧光技术标记细胞内的结构的缺点是,靶向抗体过大,无法渗透膜,因此,唯一有用的靶抗原,除非在固定和透化细胞的质膜的外部区域上显示。标记抗体的效率也相对较低,并可能增加10至20纳米的本土化标签和目标之间的不确定性。与此相反,荧光蛋白通常驻留于5纳米的靶向蛋白。的角度,但是,使用的抗体为目标合成探针风暴和相关技术提供了更高的信号电平比荧光的蛋白质,这是更有益的活细胞成像。应当指出,高浓度的氧清除剂和脂肪族硫醇,常常有必要与流行的合成染料和单激光器产生光控可以与活细胞的不兼容。

超分辨率显微镜探针发展的未来努力将集中在增加的特异性和非常明亮的光开关荧光标记效率的同时,降低靶向部分的大小。夫妇合成荧光基因编码的目标序列设计的混合动力系统,意味着目前的趋势和成功的那一天,这些探头可能是能够实现这个目标。在这些系统中的最高性能的候选人利用一个小的肽是在活细胞中表达,并能够招募合成的荧光基团,产生有针对性的荧光。其他方面的发展围绕减少通过寻找更小的基因编码的独立的单位,如植物光素的光,氧,和电压(LOV)域,其中包含大约一半的水母和珊瑚蛋白质的氨基酸的荧光蛋白的大小。然而,无论在建立新的,更美好的荧光基团的进度(或缺乏),超分辨率显微镜承诺今后许多年里继续留在最前沿的光学显微镜。

影响因素STORM成像分辨率

STORM,PALM,FPALM的技术,如超分辨单分子成像的理论基础虽然先前已详细讨论了,在确定任何特别的调查使用这些方法的实际结果的因素有很多。其中的关键方面是必须考虑的是,每个单独的定位测量的准确度,已被定位在最终图像中(通常被称为分子密度)的探针的密度,和标签本身的物理尺寸。分辨率和单分子定位精度之间的关系是很容易确定。能力解决两个荧光分子作为单独的实体的位置定位的精度,这决定了(不确定性)的每个分子中,从而对之间的距离是有限的。反过来,定位的精度,主要是依赖于单个激活,去激活周期期间收集的荧光分子的光子数,提供了背景噪声可以忽略不计。

分子密度和最终图像的分辨率之间的关系方面的奈奎斯特采样理论,这需要约两个数据点的每解析单位是最好的描述。在情况下,标记效率(有效,则该部分被标记的目标)的一个标本是不够的,如精细结构细节不连续的工件可以出现在超分辨率图像。因此,对于一个二维图像,具有大小为α的空间特征,所需的最低必要的,以满足奈奎斯特准则本地化的荧光探针的分子密度是:

奈奎斯特分子密度≈(2 /α)2 (5)

因此,例如,为了实现20纳米的分辨率在两个方面,一个荧光团被定位,至少每10纳米和一个非常高的分子密度为每平方微米约10,000个分子是必需的。20纳米级分辨率的三维超分辨,需要大约一百万的荧光团每立方微米。在实践中,分子密度低得多的试样的几何形状是考虑到时,通常就足够了。生物结构通常是异构的,所以,即使与靶标位点的相对高丰度的饱和标记可能会导致一个相对较低的总密度。在一般情况下,荧光探针,必须存在足够的密度,以充分的标记结构的细节映射。由相同的标准,必须有足够数量的这些荧光探针在成像过程中成功地定位。

在单分子超分辨率成像的分子密度

在单分子中的超分辨技术,在时间上分离的荧光发射通过采用光开关的荧光基团(如PALM和风暴),该比率的切换动力学实验是一个关键的参数,应该进行微调的分子密度。在上述情况下为10,000每平方微米的荧光基团的分子密度,为了实现最终的分辨率为20纳米的横向平面,约600个荧光团必须驻留在侧向投影的点扩散函数。这种分子密度高,可并发光开关荧光,多数不是在他们的黑暗状态,导致高背景噪声的事实。这些荧光发出微弱的荧光,或者他们可以自发地切换到完全没有激活照明的荧光状态。可以是自发的或产物可以通过成像激光诱导的非特异性激活。在分子的密度非常高的情况下,可以产生大量的非特异性激活的荧光基团的单分子图像的重叠,从而损害的能力,以实现高精度的定位。因此,最好采用光开关的荧光基团,表现出低暗态的排放和低的非特异性激活率。

图7中给出,是一个重要的概念,涉及在单分子的超分辨成像的空间分辨率影响最重要的因素之一。与分子密度的分辨率表示在图7中为一系列在一个测试模式中的黄色像素。成像功能,可能会对本样本中的分子密度减小(从底部到顶部的图7),并在逐渐降低的信号-噪声比(像素为单位的分数),这些功能变得不可解析,当平均分子分离方法的特征尺寸(在图7中的最上面一行)。因此,等式(5)中所描述的,为了实现N倍的尺寸D, ND -倍的像素越多,必须获得较高的分辨率。信号采集速率(每秒检测到的光子)必须增加的一个因素中的至少ND.这就需要有一个高ND倍,激发激光曝光所需的每个图像。

在时间分辨率,基于单分子的超分辨的方法不直接产生一个图像,而是用于映射确定从数千个别成像帧的特定的分子的本地化。在这种情况下,时间分辨率确定由数量的帧所需要的,以获得合适的图像的成像。此外,PALM和STORM成像的光开关荧光的性质可以产生颞成像速度的约束。荧光蛋白是极好的情况下,需要到一个特定的细胞器或生物分子组装的本地化用作基因编码的探头。然而不幸的是,荧光蛋白表现出相对缓慢的光控动力学相比,许多合成的探针,如Cy5和的Alexa Fluor 647。后者可以表现出高开关速度,使分辨率为约30纳米,这是几个数量级大于所得到的荧光蛋白的1毫秒成像周期。切换周期的速度,帮助确定单分子超分辨率显微镜的时间分辨率将是最终的限制,这种方法适应活细胞成像。

双色彩风暴成像

在荧光显微术的主要优点是容量乘以与一个以上的荧光基团标记的图像样本来生成图像的二,三,四种颜色,帮助解开的相对的组织和不同的生物结构或分子之间发生的相互作用。在两个或两个以上的荧光标记探针驻留在同一决议体积的情况下,他们可以被视为经典的共定位分析算法,以确定发射光谱之间的重叠程度(因此,体内分子间的相互作用产生有关潜在) 。的能力进行调查,在两个或两个以上的颜色是必不可少的,用于探测生物分子之间的相互作用,并提供了宝贵的洞察许多生物过程的性质,如果它可以成功地应用到超分辨率成像。

在荧光多色成像的基础在于找出一些光学分辨的探针可同时施加到试样的要求。风暴,原来的硫杂羰花青染料对的方法,当创建一个调色板,每个光开关的探针组成的组成的记者探头可以进行成像和关闭,以及活化剂的探针,用于激活记者耦合染料对通过吸收特定波长的光,其吸收光谱的重叠。例如,多达九个分辨的探针可形成一个组合配对的三个荧光报告基团(如Cy5标记,Cy5.5标记,和Cy7)具有不同的发射波长和三个活化剂的荧光基团具有不同的吸收光谱(其中包括的Alexa Fluor 405,CY2和Cy3)。利用这一战略在风暴中的第一个多色成像示威,利用DNA分子固定在表面和双色免疫荧光标记微管蛋白涂层坑标本成像。STORM成像能够实现横向分辨率为约25纳米,使用两个或三个不同激活每个配对的记者一样。使用一个单一的报告染料的主要优点是,因为本地化沿着相同的光学路径成像的荧光基团是来自于单独的通道对齐。

双色超分辨率成像风暴

在图8中,提出了一系列的拍摄的图像在宽视场荧光(图8(a)和图8(b))和两色的单分子的超分辨(风暴)成像(图图8(c))。的检体是一个固定的制备粘附非洲绿猴肾细胞进行免疫染色用的染料对的Alexa Fluor 405和Cy5标记线粒体,以及以反白显示的微管网的Alexa Fluor 488和Cy5。在图像采集,使用405纳米和532纳米的激光脉冲交替序列依次激活探头。激活的探针,然后用657纳米激光照射的收集图像。分子本地化pseudocolored根据相应的激活激光(品红在405纳米和绿色为532纳米)。在水介质中染色细胞成像重建从约500,000本地化百分点。白盒中的宽视场图像(图8的(a)),相应的风暴图像的比较,与图8中的(三)在图8(b)对于已展开。请注意风暴如何清晰图像解析即使它们密密麻麻的线粒体和微管相比传统的宽视场荧光图像,可以更精确地确定其空间关系。

也可以实现彩色超分辨成像相结合,合成染料和荧光蛋白标签。例如,使用的组合rsFastLime(绿色荧光蛋白光控来自Dronpa的)和硫杂羰花青,Cy5标记,研究人员能够通过顺序光控荧光蛋白记者和合成染料标记的微管进行两色成像。多色成像单独使用荧光蛋白已被证明是更困难的,因为预活化的荧光蛋白的活化后的状态的另一个重叠的状态(由于非常广泛的吸收和发射光谱的发射光谱的这些探头)。第一个示范用荧光蛋白质与photoconvertable荧光蛋白标记,分别在固定的细胞肌动蛋白和粘着复合tdEos耦合绿色光控Dronpa的的两色成像。两个荧光基团依次成像,第一成像由Dronpa其次毕竟的tdEos分子光漂白tdEos。不幸的是,需要消耗一个探头成像前,不允许同时多色成像,从而提出了一种时间分辨多色成像的障碍。此问题被克服由最近开发蓝移Dronpa变型中,称为BS-Dronpa,和红色的光活化的荧光蛋白,PA-mCherry1的。配对bsDronpa Dronpa,或PA-mCherry1的PA-GFP,使两色同时成像。然而,仍然需要不断地开发新的荧光蛋白和合成染料photoswitches的方便快速的多色成像。

三维风暴成像

绝大多数生物结构的三维实体,从而表现出横向和轴向尺寸范围在几十微米或以上的功能,很容易解决的许多流行的成像方式在荧光显微镜。这种能力扩展到单分子的超分辨成像,精确地确定一个机制来激活荧光横向和轴向位置的境界是必要的。不幸的是,荧光团的轴向位置上的准确的信息是很难取得衍射受限的三维成像,因为焦平面附近的区域中的点扩散函数是对称的。的对称性,呈现Ž的确切位置的两个分子位于焦平面上方或下方的一对夫妇的纳米之间难以区分。此外,该点扩散函数也包含在焦平面附近的一个较大的区域(高达几百纳米)使其难以跨越的荧光有关的轴向位置的信息很少本地化分子居住的任何地方附近的宽视场显微镜的焦平面。

几个创新的解决方案已经被提出用于三维超分辨单分子成像,包括在两个不同的焦平面成像,干涉,倾斜的反射镜,和卷积的点扩散函数的傅立叶变换的一个更复杂的数学模型(如双螺旋点扩散函数),使用空间光调制器。然而,最简单和最直接的技术之一涉及荧光散光存在于作为Ž深度的函数的单分子发射器的基础上,确定的轴向位置。最初开发的辅助系统进行三维成像风暴,由弱柱面透镜成像光学列车定位在仪器配置。在操作中,为每个荧光的图像的形状(实际上,椭圆度)成为一个高度敏感的方法,它的焦平面的距离(沿z轴的)的图像的质心,而用于本地化的横向(x Ÿ)的位置。

的三维的风暴成像达到接近50纳米600纳米的z方向的范围内未经扫描的试样,而执行扫描制度允许几微米深度的标本是约25纳米的轴向分辨率的同时横向分辨率成像。图9所示的(a)是一个三维的风暴系统的简化框图的光学列车的原则确定的椭圆率的基础上,其图像的荧光探针,通过引入到成像的柱面透镜的轴向坐标图路径。该系列的单分子的光学图的右侧的图像显示的荧光在各种Ž位置。在一个固定的猴肾细胞中的微管网络从一个三维风暴图像 x - Ý视图在图9(b)在轴向位置的信息编码,根据图9(d)图的彩色栏。在图9(b)中所示的白盒的放大该x - Ý区域在图9的(c),与相 ​​应的x - Ž视图图图9(d)中,以证明可以解决的,单个微管相当很好的轴向尺寸,使用暴风影音技术。

三维超分辨率成像风暴

单分子风暴型三维成像的另一种方法利用多焦点的平面成像,以实现轴向分辨率的衍射极限以下。通过同时成像在试样中的两个焦平面,激活的荧光团(一过聚焦和underfocused的)的图像可以被分析,以适应一个三维点扩散函数,以确定它们的空间坐标。光斑尺寸之比的轴向位置的单调函数,因此,可以定量评估。称为双平面轴向定位显微镜,这种技术是通过约800纳米,在z方向的成像能够不借助轴向扫描技术扫描和几微米之间。双平面成像的主要好处之一是,横向分辨率的图像的轴向位置无关。作为该方法的测试,证明的轴向尺寸,分辨率为75纳米的三维成像的荧光涂层的有孔玻璃珠,直径4微米。

使用宽视场显微镜与空间光调制器,以产生双螺旋的点扩散函数已被修改时,就可以实现使用单分子成像技术的三维精密定位。该仪器被配置为包括被称为f的图像处理部,其目的是产生的双螺旋的点扩散函数卷积的标准显微镜点扩散函数(所产生的单分子发射器)与在检测路径空间光调制器。此卷积乘以标准的显微镜图像的傅立叶变换的专门的点扩散函数(这是一个纯相位的功能)中的孔共轭平面。为一个单一的发射器所产生的点扩散函数包含两个主要的裂片,其与发射器的轴向位置旋转的角度取向。荧光团(焦平面的上方或下方)的轴向位置通过建立的校准曲线,可确定10至20纳米的精度(标准偏差),这对应于25至50纳米(即完整的轴向分辨率宽度半最大值; FWHM)。最复杂的方面的双螺旋显微镜的结构的液晶空间光调制器,这需要一些相匹配的辅助消色差透镜。

至目前为止,最高分辨率的示范单分子进行三维成像定位显微镜结合使用的干涉。称为iPALM,该方法能够实现约10纳米的垂直和横向尺寸20纳米的分辨率。纯设计的中心上的应用程序的干涉测量的差异在两个位置依赖途径所采取的单光子发射的试样后,分光镜复合,从而使光子本身可以干扰。其中最关键的环节iPALM连贯性,仪表校准和容忍的波动性荧光的特殊要求,满足条件使用一个专门的多相分光镜。此外,成像深度(Z)被限制到约200纳米。iPALM已被用来解决的轴向尺寸的膜,粘着斑,微管,内质网。不幸的是,任何商业为iPALM实现仪器的复杂性随着严格的校准程序可能交的限制了它的广泛应用。

活细胞STORM成像

能力进行时间分辨的图像序列捕获的活细胞和组织的荧光显微镜的标志成果之一,并可以实施与几乎所有的对比度或光学切片模式,包括宽视场,激光扫描共聚焦,旋转盘,总的内部反射和多光子显微镜。超分辨率显微镜将这种能力扩展到纳米级的分辨率无疑将提供令人兴奋的新的见解,许多发生在活细胞的基本流程和交互。即使单分子和聚焦的光点扩散工程超分辨率显微镜方法仍处于起步阶段,一些突破性的发展已经发生,显示未来时间的调查,使用这些方法的承诺。因此,示范视频率STED活神经元与60纳米的横向分辨率成像代表什么样的未来可能的一个极好的例子。

虽然单分子定位的超分辨技术已普遍认为需要太多时间在图像采集方面有多大的价值在活细胞成像,一些调查已经成功地证明了这种方法收集的时间数据。作为一个例子,细胞膜的微观结构监测通过跟踪光活化的GFP(PA-绿色荧光蛋白)融合的血凝素分子具有40纳米精度的运动。此外,在活细胞中的单粒子跟踪与纳米空间精度已被证明在一些场合,尽管这些研究是有限的跟踪只有一个或几个分子的同时,并没有用于创建超分辨率图。然而,使用光学荧光笔荧光蛋白可以在同一单元中进行跟踪,以获得高分辨率的信息从粒子径迹上的相关的蜂窝结构中的一个和两个色实验大量的蛋白质分子的运动。

活细胞单分子超分辨率成像

粘着斑复合物在活细胞中,用荧光蛋白tdEos photoconvertable超分辨率成像与单分子定位精度进行了演示。获得每25秒和60秒之间的图像帧速率(远远慢于许多传统的荧光成像方式是可能的),设有一个约60纳米的横向分辨率的数字视频可视化粘着斑逆行运输和伸长率,并允许不同的形态观察。如图10所示的单分子定位的图片,粘着蛋白的桩蛋白活的中国仓鼠卵巢细胞中表达的融合到tdEos。白色,黄色,和青色的箭头突出显示个别粘附配合物所观察到的图像捕获的时间过程(1105秒)的相互作用和伸长率。单分子超分辨成像显示中​​不可见的广角荧光,并透露自己的真实尺寸大得多的内部细节出现同质化的功能,在广角新生粘连。

活细胞成像中也得到了证实使用直接的的风暴(dSTORM)的,它依赖于一种自然发生的含硫醇剂(还原型谷胱甘肽)的存在下,在动物细胞中减少的状态,在毫摩尔浓度是本。,因为dSTORM利用常用的有机荧光基团(如Cy5标记的Alexa Fluor 488,ATTO 655)所表现出的的固有光控性能,是不要求精确的共轭的第二荧光激活。因此,dSTORM可以产生衍射极限的下方,使用与选定的合成荧光标记活细胞显着提高了分辨率的图像。该技术也被检查翻译用Cy5的Alexa Fluor 647标记的微丝在体外吸附在玻璃表面,应该很容易转换成应用程序与其他常见的生物大分子沿肌球蛋白II网络。其中,使用dSTORM在活细胞中的限制因素是在与合成的荧光基团标记的细胞内的目标的难度。然而,开发新的细胞透性的染料耦合混合贴标技术的进步,应该在未来的努力,进行活细胞成像实验使用dSTORM富有成效。

结论

迄今报告的风暴和相关技术令人印象深刻的决议并不代表单分子定位显微镜的极限。使用这些方法的空间分辨率的精度和密度的分子本地化,(提供仪器完全调整),残留的黑暗状态的荧光,荧光亮度从黑暗中的荧光自发活化率主要取决于决定状态下,标记效率,标签的大小。在有足够的探测亮度和分子密度的情况下,预期的分辨率几乎可以是任意高。例如,一个明亮的荧光探针如的Alexa Fluor 647预计将产生足够多的光子,使一个只有几纳米的定位精度,从而看好真实的分子级分辨率。但是,在这一级,探针的物理尺寸成为一个关键因素,所以,在理想情况下,将荧光团直接结合的生物分子还。幸运的是,一些新近开发的方法,使特定的附件小的有机荧光细胞的蛋白质通过基因编码方法,并提供了一​​个的标签策略可能支持分子级分辨率。

STORM成像,将有一个直接关系到成功的​​活细胞观察的另一个重要方面是数据采集速度。由于本征时间和空间分辨率之间的折衷,超分辨率成像一般是比较缓慢的。更具体地,构造风暴图像绘制在许多成像帧的检体中的宽视场视图累计本地化。因此,成像速度在风暴需要准备一个高分辨率的图像的帧的数量是有限的。相比之下,聚焦的光点扩散函数的工程技术,如STED,有限的时候需要扫描整个标本的一个小的焦点。因此,单分子技术有望比STED相关的方法要快,成像时,一个大的标本地区,但慢的时候成像面积小。目前,风暴的最高分辨率图像采集时间通常需要几分钟。然而,在60至70纳米的空间分辨率,时间分辨的图像的时间分辨率在活细胞中的几十秒钟的聚集。应该预期将改善与成像速度更快的相机,较高的激发功率,探头具有更快的光控率。