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徕卡显微镜:活细胞成像技术

2013-10-16  发布者:admin 

复杂和/或快速的细胞动力学的理解是探索生物过程的一个重要步骤。因此,今天的生命科学研究越来越注重动态过程,如细 ​​胞迁移,细胞,器官或整体动物形态学变化和生理(如细胞内的离子成分的变化)事件实时的活标本。解决这些具有挑战性的需求的方法之一是采用若干统称活细胞成像的光学方法。活细胞成像活细胞的动力学过程,而不是给细胞的当前状态的一个“快照” -允许调查将改编成电影的快照。活细胞成像提供了空间和时间信息的动态事件在单细胞,细胞网络(原位),甚至整个生物体(体内)。这些特点使活 ​​细胞成像技术,为细胞生物学,癌症研究,发育生物学和神经科学的解决问题的必要条件。

近年来,在电子,光学和分子生物学取得了重大进展,活细胞成像轻松访问科学家。

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活细胞成像采用的方法

显微技术应用于活细胞成像的范围也极其广泛。通常情况下,细胞的生长,细胞的聚集体或细胞的运动,观察到随着时间的推移,使用复合显微镜和对比相衬和微分干涉相差(DIC)的方法,如。此外,时间推移成像较大的标本,如开发的斑马鱼胚胎,广泛进行,通常是用立体显微镜或macroscopes的。高级荧光技术在过去的几十年中已成为越来越重要的。生物调查从平面到第三个维度共聚焦显微镜的应用的快速增长已经改变了观点。下面是一个简短的概述常用的应用技术。

离子成像 - 离子浓度的变化观察

通常执行的方法是钙,氯,镁离子成像()可以使用荧光染料或蛋白质,尤其是钙离子结合后,旨在改变其排放行为。这使研究人员能够观察到细胞中的离子浓度的动态变化。由于离子组成细胞的细胞质中确定许多重要功能的细胞,如神经细胞的兴奋性,基因转录和细胞运动(只是仅举几例)调节细胞内离子在空间和时间方面是生命科学的重大利益研究。另外,成像细胞内pH值水平或电压可以用特殊的荧光染料。一个特殊的成像技术离子浓​​度,pH值或电压变化比例成像方法。这些可以进行精确的测定,例如细胞内钙浓度的相对变化,而不是监测,因为它是在非比例的方法。

FRET - 量化的蛋白质 - 蛋白质相互作用

要动态检测蛋白质相互作用FRET(福斯特共振能量转移)和生物发光共振能量转移(BRET)事件可以在活细胞实验成像。FRET量化分子动力学,如蛋白质 - 蛋白质相互作用,蛋白质-DNA相互作用,蛋白质构象变化是一个有用的工具。FRET成像通常使用GFP(绿色荧光蛋白)的衍生物,特别是CFP和YFP(青色和黄色荧光蛋白,分别),这是每一个连接到感兴趣的蛋白质,使用分子生物学方法。CFP分子被激发荧光灯。尽快感兴趣的蛋白质紧密的空间接近(小于20 nm)的CFP将作为供体和转移的能量以光的形式发射到YFP的,作为受体。研究人员将观察转变,从从CFP发出蓝色荧光YFP发出的黄色荧光。在BRET的情况下,捐赠者是一个发光的分子(如荧光素衍生物)作为捐赠者,像荧光共振能量转移(FRET),GFP衍生物作为受体。

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 1:活细胞共聚焦图像拟南芥; endoplasmatic网:GFP标记的自体荧光绿色,红色,蓝色传输叶绿体。基于这样的图像,例如FRET或FRAP分析可以做到。

 

FRAP - 监控蛋白和囊泡贩运

适用于监控蛋白或囊泡运输的方法往往是光漂白(FRAP)后荧光恢复。在这里,荧光蛋白(GFP)的感兴趣的蛋白(即一种蛋白质,其运动是要监视)。一般情况下,整个小区是初步荧光蛋白可能在整个细胞丰富。目标区域的细胞,通常在神经细胞的轴突或树突细胞的过程,例如,暴露在高强度的光(通常为激光),并在该特定区域的荧光被破坏(漂白)。感兴趣的蛋白质是移动的,其他部位的细胞蛋白reinvade漂白区域以一定的速度,并在漂白区域的荧光恢复。这可以给研究人员深入到细胞内运输动力学。

TIRF - 观察过程接近到细胞膜

观察位于或接近一个细胞的质膜的事件的一个特殊的技术是全内反射荧光显微镜(全内反射)。通过使用荧光染料的激发仅穿透细胞的60-250纳米的渐逝场中,全内反射荧光显微镜提供一个无与伦比的z轴分辨率,使中发生的事件或接近到质膜(例如分子运输到质膜)的成像,而不荧光分子在细胞内的相形见绌。

TIRF图像:半乳糖凝集素-3接近沿着肌动蛋白丝膜囊泡运输。

TIRFa_02  TIRFb_02

 2A:概述萤光图像,                                                           图 2B:概述图像与TIRF在C所示,标记的部分,

 

TIRF部分的时间序列
 2C:TIRF部分的时间序列,时间定在几秒钟内。首先沿着肌动蛋白丝(从底部向上)运输à半乳糖凝集素-3的囊泡(标YFP)膜(箭头),切换到另一个灯丝(88),移动到左侧(109),再次运送到右侧,再次切换灯丝,然后被输送向上(246次)。
YFP:红色; CFP:绿色;图像概览:20微米;截面:6微米,穿透深度TIRF:110纳米的尺度。Courtesy of Ralf Jacob, University of Marburg, Germany

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

光敏 - 监测基因表达和蛋白质运输

最近开发的方法,称为光敏选择性地标记在一个单元格或整个机体的某些地区或感兴趣的领域。对于使用光活化,尤其是设计的染料或荧光蛋白,如绿色荧光蛋白(paGFP)光活化的或枫。这些荧光荧光在其正常状态。然而,某些波长的光照射之后,这些荧光可以激活荧光像传统荧光。在许多情况下,这些蛋白质的基因融合到某些感兴趣的蛋白质的表达或传输然后,可以监测。然后可以应用如FRAP或粒子跟踪的方法,感兴趣的蛋白质,以进一步调查。

MPE - 深入调查过程中

现代生物学研究的要求真正在体内的调查,以配合“准体内”,在细胞培养实验。但它是很难,调查像鼠标生物体内部发生的进程。多光子激发显微镜(MPE)可更深入地渗透到组织中,因为近红外激发光的,具有较长的波长,相比,单光子激发的短波长的光用于减分散。MPE技术的非线性性质,限制了光漂白和光毒性在聚焦的区域。长期调查,这是极其有利的,因为无论是荧光蛋白和生物体遭受这些问题。使用适当的准备和微观设置,成像到几毫米到组织的报告。使得它适合用于光子操纵以及激发的精确定位。这种方法已经发现在神经生物学的广泛应用。

STED - 细胞动力学研究纳米尺度

受激发射损耗(STED)显微镜可以让科学家们调查超越光学分辨率极限的结构。这种技术使用荧光染料,被刺激的排放,以消除探测信号的财产。下降到50-70纳米的细胞结构已经成功地成像。提高分辨率是非常重要的为调查小细胞结构。特别是对那些谁想要看看共存事件,分辨率的提高可以产生更逼真的效果。随机STED的独立性,使成像速度非常快,相​​比其他的超分辨率技术。视频率STED收购已经实现,它允许实时细胞动力学研究。

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 3:STED活细胞成像单元标签技术:Vero细胞结构:EB3,瞬时转染;标签:俄勒冈绿488。

FLIM - 活细胞的空间测量

荧光寿命成像的优点在于,该数据是不依赖于信号强度。因此,它不是常见的文物,如漂白浓度变化的影响。使用时间相关单光子计数,FLIM的重建图像数据的单分子检测。在子纳秒荧光寿命的变化最小,可以注册和分析。该方法具有通用性外和细胞内环境改变,从而导致荧光寿命改变任何种类的调查。FLIM的FRET分析的发射强度是不敏感的,从而增加量化数据的精度。

CARS和SRS - 无标记方法振动对比

几乎所有活细胞的荧光成像方法基于荧光蛋白的基因表达。这涉及大量的技术工作和可观的费用。此外,外部基因的表达有可能发生变化的微环境,从而导致从生理的现实的变化的数据。相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜和共焦方法是非线性的,这是不依赖于荧光染料的受激拉曼散射(SRS)显微镜。这些标签免费的方法图像样本中的特定化学键的振动状态。的积累,在活的生物体中的特定化学键,如在轴突周围的髓磷脂的脂质,可以成像在高分辨率和出色的信号与噪声的质量,而不需要任何染色。

未来是定量

生物研究已经离开了年龄的描述性调查,并进入了一个时代的定量分析。新的活细胞成像技术发展的方向,更高的分辨率,无论是在空间和时间。技术的发展,现在集中在纳米范围内的单分子和分子反应为几皮秒的定量研究。