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尼康显微镜:在多光子激发显微术的基本原理和应用

2013-10-16  发布者:admin 

双光子激发显微镜(也称为非线性的多光子双光子激光扫描显微镜)是一种替代共聚焦和去卷积显微镜三维成像,提供了明显的优势。特别是,双光子激发成像擅长的活细胞,尤其是在完整的组织,如脑切片,胚胎,整个器官,甚至整个动物。有效灵敏度的荧光显微镜,特别是与厚的样品,通常是有限的焦点外的喇叭形。此限制,大大降低了在共聚焦显微镜中,通过使用共焦针孔拒绝焦点外的背景荧光,并产生薄(小于1微米),unblurred的光学部分。另外,解卷积显微镜采用了常规的显微镜数字重建的图像,使用的测量的光学系统的点扩散函数。

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本文介绍了多光子激发的基本物理原理的描述,并讨论了其使用激光扫描显微镜的优点和局限性。为了说明这种技术的实用程序,并显示出一定的物理限制,实际的考虑因素突出。最后,选定的应用程序的双光子激发显微镜进行了讨论,以说明如何此技术允许实验,根本不可能被执行,否则。

进行任何光学切片实验之前,应认真考虑选择的技术是最适合提供答案的问题正在调查中。为了在相对厚的样品的荧光显微镜,双光子激发往往以提供最适合的解决方案,但互补的三维荧光显微镜的方法具有特别的好处,给他们每个人的优势,在某些实验。

利用激光共聚焦显微镜的针孔,以排除从检测出的离焦背景荧光。因此,这种技术允许三维成较厚的组织切片。然而,激发光产生荧光,从而产生整个试样的光漂白和光毒性,即使信号只从聚焦的平面内,收集。这种大的激发量能引起显着的漂白和光毒性的问题,尤其是在活体标本。此外,在共聚焦显微镜的穿透深度穿过波束路径的,由试样散射的激发和发射光子吸收激发能量是有限的。

解卷积技术通常提供最佳解决方案的样品外的焦点的背景相对较低的或整体信号电平低的试样。因为卷积方法采用传统的宽视场显微镜进行图像采集,激发强度一般保持在低水平。因此,反褶积通常是有效的活细胞成像单层的。重要的是要意识到,但是,许多所谓的反褶积方法是简单的非线性数据筛选不产生定量数据。只有真正的约束迭代卷积技术产生的量化的数据,可用于进一步的分析。然而,在宽视场荧光显微镜进行反褶积提供了有限的渗透到厚的样品,由于增加外的焦点的背景和光散射。此外,由于大量的计算需求,反褶积的图像无法提供即时反馈,在实验过程中。

双光子激发,在本文中进一步讨论的那样,提供了三维光学切片没有吸收(这将导致光漂白和光毒性)的焦点的平面的上方和下方。因此,该技术提供了更高的穿透深度共聚焦显微镜相比,可以降低光毒性活标本。因此,使用双光子激发显微镜,优先于其他技术,需要深入渗透到生活的组织或完整的动物标本的实验。然而,由于管的双光子激发的光物理是不同于常规荧光激发的,有害的影响偶尔观察物镜的荧光基团,这反过来又限制了该方法的适用性的薄样品的光学切片的双光子激发的。

双光子激发的原理

双光子激发在量子光学是一个比较老的理论概念。这是第一次提出由玛丽亚Göppert - 梅耶在她的博士论文和实验观察到的一些30年后,激光发明后不久。因此,相当理解的理论和实验研究的背景存在。来自在一个单一的量化后的事件的同时吸收两个光子的双光子激发的现象。由于光子的能量是它的波长成反比,必须具有两个吸收的光子的波长大约两倍所需的单光子激发。例如,荧光基团,通常可以吸收紫外光(波长约350纳米)也可以被激发的两个光子的近红外光(约700纳米波长),如果两者在同一时间到达的荧光基团(见图1)。在这种情况下,“同时”是指约10×E(-18)秒的时间间隔内。

因为取决于同时吸收双光子激发,由此产生的荧光与激发光强度的平方而变化。这种二次激发和发射之间的关系产生用双光子激发显微镜(在下面更详细讨论)相关联的许多显着的优点。为了产生显着的双光子吸收事件(两个光子的荧光团与在同一时间),光子密度必须是约一百万次,需要生成相同数量的单光子的吸收。其后果是非常高的激光功率需要产生显着的双光子激发荧光。这个功率电平是很容易实现对焦模式锁定(脉冲)激光器,其中的脉冲峰值期间的功率是高到足以产生显着的双光子激发的平均激光功率,同时保持相当低。在这种情况下,将所得的双光子激发态,并且发射发生进行常规的荧光实验时,所填充的是相同的单重态。因此,荧光发射的双光子激发后,在正常的单光子激发产生的发射完全一样。图1给出了雅布隆斯基示出一个单一的(紫外线)的光子同时吸收两个近红外光子(图1(b))(图1(a))的吸收,产生相同的激发态。

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另一个密切相关的非线性光学过程中,三光子激发,也可能被证明是有益的生物学实验。三光子激发发生在大致相同的方式作为双光子过程中,除了三光子必须同时与荧光团产生排放。由于吸收荧光的量子力学性能,所需的三光子激发的光子密度仅约十倍大于所需的双光子吸收(而不是另一个百万倍更大)的密度。三光子激发,因此,可以考虑一些实验中的一个有吸引力的选择。红外线激光(约1050纳米的波长)作为一个例子,可以制作三光子激发的紫外线吸收的荧光团(350纳米),并同时引起的吸收绿光的荧光基团的双光子激发(在525纳米) 。此外,可以采用三光子激发有用的成像区域扩展到深紫外光(例如,使用720纳米的光来激发荧光团,通常在240纳米的紫外线吸收)。这是一个有价值的传统显微镜的能力增强,因为低于约300纳米的紫外线的波长是非常有问题的常规光学显微镜。高阶非线性效应,如四光子的吸收,实验已证明,虽然这是不可能的,这些现象会发现任何立即在生物学研究中的应用。

双光子激发激光扫描显微镜

相当大的优势,在激光扫描显微镜中的双光子激发产生的基本的物理原理的吸收依赖于激发光强度的平方。在实践中,所产生的双光子激发一个单一的脉冲激光通过光学显微镜。由于激光束聚焦,光子变得更拥挤(其空间密度的增加),其中两个相互作用的同时,一个单一的荧光基团的增加的概率。的激光焦点沿光子拥挤到足以产生显着发生双光子激发的光路中的唯一位置。图2示意性地示出显微镜的试样在焦点中的荧光基团的含双光子激发产生。上述焦点,光子密度不够高,在同一瞬间通过一个单一的荧光基团的吸收截面内的两个光子。然而,在焦点处,光子是如此紧密地间隔开,这是未能发现它们两者同时一个单一的荧光基团的吸收横截面内。

在实践中,双光子激发显微镜不仅可能集中光子空间(通过聚焦光学显微镜),也通过集中时间(通过利用从锁模激光脉冲)。将合并的效果可以生成必要的双光子激发的光子强度,但脉冲的占空比(脉冲之间的时间除以脉冲的持续时间),10×E(-5)平均输入功率限制到低于10毫瓦,这仅仅是略大于共聚焦显微镜中使用的。虽然被认为是超短激光脉冲持续时间,通常为约100飞秒1皮秒(10×E(-13)到10×E(-12)秒)之间,在约10×E的荧光团的吸收事件相比(-18)秒,持续时间相对较长。

双光子激发的照明焦点狭窄的定位的基础的技术的最重要的优势,激光共聚焦显微镜。在共聚焦显微镜中,虽然整个试样激发荧光照明的音量,只在焦平面信号通过共焦针孔,允许无背景要收集的数据。与此相反,双光子激发产生荧光的焦平面上,由于没有产生的背景荧光,针孔不是必需的。共聚焦和双光子激发显微镜激发区域的这种戏剧性的差异可以证明,由成像的光漂白型态的每个方法。图3示出在xz重复扫描,在荧光素染色福尔瓦的膜一个单一的xy平面(图像平面)的方向上从所产生的光漂白柄。漂白的激光激发荧光团共聚焦系统的焦平面上(在图3(a)所示的白色的框)的上方和下方,有助于观察到这些广泛的领域。与此相反,只发生双光子激发的焦平面上,和漂白,因此只限于这方面的(图3(b))。

multiphotonintro figure3

许多有利影响,导致激发双光子显微镜技术的本地化。也许最重要的是,双光子激发显微镜的三维分辨率是相同的,以实现在一个理想的共聚焦显微镜。此外,因为没有聚焦在试样区域的吸收,更多的激发光穿过试样的焦点平面。其结果,大大增加了试样的渗透,一般是大于两次或三次未能用激光共聚焦显微镜。利用双光子激发(在图3中示出)的另一个好处是光漂白和光损伤的最小化 - 荧光显微镜,活细胞和组织中的两个最严重的局限性。虽然通过与光的相互作用引起的细胞损伤所知甚少,很显然,减小光损伤会导致受调查的生物标本的扩展的可行性。从实际经验中的证据的红色激发光本身并不影响细胞活力,并有可能大部分观测到的光损伤伴有双光子吸收,因此被限制到焦平面。

双光子激发显微镜不需要针孔取得三维的分辨率,允许灵活地检测的几何形状。检测退扫描和非退双光子激发的几何结构,如图4所示。在退扫描的几何形状,发出的光(图中以蓝色)作为激发光沿着相同的路径返回,撞击前扫描镜通过共焦针孔的检测器(图4(a))。在共聚焦显微镜中,必须利用这种几何形状,以消除检测聚焦发射。非退束路径提供多个配置的替代品:共轭平面检测器的布置定位后,立即的物镜(图4(b)条,并反映所发出的光通过一传递透镜放置在一个平面上的共轭到检测器的分色镜客观的后孔;由一个外部检测器直接从检体所发出的光可能会被收集,而不通过所述物镜(图4(c),或所发出的光由二向色反射镜被转移到一个电荷耦合器件(CCD)相机在中间像平面中,为了获得宽视场图像(图图4(d))。这后一种几何配置适用于快速数据采集系统中,采用双光子激发。

虽然这是可以用于双光子激发,以便充分利用这种技术的穿透深度,使用退扫描检测,建议使用一个非退的选择(外部检测器)。非退的路径使收集更多的散射光子,需要较少的光学元件,例如反射镜和透镜,并减少路径的长度,沿其在空气中的灰尘颗粒的荧光信号干扰。因此,使用非退的检测方法,用双光子激发的显着提高收集效率,并且是必不可少的最大深度渗透到活组织。

深切片机制

如上所述,双光子激发显微镜最强大的优势是它能够提供优越的光学切片厚的样品更大的深度比通过其它方法是可能的。,因此,重要的是要了解通过何种方式实现这种穿透深度增加。三个物理机制存在功能组合,让增加的效益,在厚厚的标本:

  • 无外的病灶吸收,使更多的激发光的光子,以达到所需的检体的水平。

  • 双光子激发经过红光和红外光散射比少光的蓝颜色(波长较短)。

  • 光散射的影响是不利的双光子显微镜,共聚焦显微镜比。

虽然功能组合,它是有用的,单独考虑的三种机制。双光子显微镜允许更大比例的激励照明达到,因为吸收的条件不能满足以外的​​区域的光线集中,并消除吸收聚焦在焦平面。在共聚焦显微镜中,激发光子被吸收的激励光路径的过程中遇到的任何荧光。其结果是,较少的光子到达的焦平面上,从而降低所产生的信号。如果样品含有荧光基团在整个在如图5所示的图像中,如图所示,这种效应变得更加明显。若丹明染色的聚合物薄膜样品,在该图中,本身就是非散射,但包含均匀分布的荧光团浓度高。

在图5中,在xz扫描的顶部是最靠近物镜,到试样(z轴向)为每个xz扫描的深度的函数绘制成的荧光强度。对于单光子激发机制(激光共聚焦显微镜,图图5(a)),强度呈现稳步下降,作为激发光被越来越多地吸收,因为它达到更深的焦平面的穿透深度。鲜明的对比,双光子吸收只发生在焦平面上,不吸收的激发光的光路中的物镜的焦平面之间的荧光团。因此,所有的激发能达到的焦平面上,保持恒定的试样的深度(在本例中的聚合物)的荧光信号。图5(b)示出的共聚焦和双光子激发的显着区别,图中,强度是相对恒定的穿透深度。

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第二个机制促进双光子激发,在较厚的试样的性能是“更红”的激发光在双光子激发显微镜患有的试样比“更蓝”中使用的常规激励的激励光的散射少。生物组织可以被认为是具有可变折射率的非均匀介质。通过这样的介质中传播的光被乘以在各个方向散射。在荧光显微镜中,激发光入射在试样上可以分散到不同程度才达到的焦平面上,因为它返回到检测器通过试样产生的荧光也可以进行散射。这些散射效应相结合,以减少收集到的荧光信号。

由于材料的不规则分布的生物样本内具有可变的属性,这是不可能的计算模型精确的散射行为。然而,最简单的近似瑞利散射的馏分,在这种系统中散射的光提供了一个最小的估计。在这种情况下,散射光量的第四功率的光的波长成反比。运用这一关系的估计,488纳米的光(光子)预计将进行约7倍超过800纳米(双光子)光散射。因此,这两种不同的散射附加有助于双光子激发的激光,可以达到的焦平面的量,进一步增加了试样的穿透深度。在实践中,所观察到的散射与组织结构相互作用总是大于由瑞利近似预测,但更长的时间(更红)波长较短(更蓝)波长小于总是分散的。荧光显微技术在检测阶段中,所发出的荧光是相同的无论是否利用单或双光子激发,因此产生,荧光发射的散射会影响这两种方法同样。

上面列出的第三个因素,是任何激发或荧光光散射不影响双光子技术信号采集显著,因为它在激光共聚焦显微镜。这种差异可以通过考虑在双光子激发显微镜的图像形成的物理解释。聚焦的吸收和散射的差异而缺乏既有助于增加激励光到达焦平面完整的组织深处,这第三个因素,实际上产生与双光子激发的提高图像的对比度。在图6中示出的物理方面造成这一。

multiphotonintro figure5

在共聚焦显微镜(参考图6)中,激发光(蓝色)被聚焦到试样(一),和从该焦斑的荧光(绿色)被捕获由物镜,通过干净通过针孔,并到达检测器的(二)。这种荧光是所需要的信号,但它的一些可以被分散,因为它传递通过试样(三)。这种散射的荧光不通过针孔,并因此丢失,未检测到。这些损失大大降低所检测到的荧光信号。作为激发光穿过试样,它可能被吸收(d)或散才达到的焦点(五)。如果它被吸收,它可以产生荧光。由于该荧光从焦点并不会出现,但不穿过针孔,所以它不被有效地检测。然而,聚焦荧光的一小部分可以被分散到针孔,然后被检测。此荧光将创建的背景雾,将大致恒定的图像,在图7和图8中给出的示例中所示。此雾降低了图像的动态范围,从而降低了图像的对比度。同样,散射的激发能产生荧光(五),该荧光也可以向背景灰雾(六)。

(红色)的激发光子的双光子激发的方法(也参见图6),可以散(克)在共焦系统中。然而,两个光子同时被散射的相同的试样的位置的概率基本上是零,因此,背景灰雾困扰厚的样品在共焦成像中不产生双光子激发。此外,更大的激发光的比例达到的焦平面(h和i),由于上面所讨论的前两个因素:降低出的离焦吸收和波长较长的双光子激发的光的散射减少。重要的是,所产生的荧光(绿色),则即使散射,由光电倍增管(j)条中被检测到的可能性增加,因为没有针孔存在来阻止它(十一)。这不敏感的病灶吸收散射效应和缺乏允许相当深度内标本保存完整的图像对比度。

multiphotonintro figure6

在图7(鲨鱼脉络丛用荧光素染色)的图像提供了共聚焦和双光子显微成像质量的比较。这些图像被收集在试样表面,这是允许从这个标本利用激光共聚焦显微镜图像的对比度足够的最大深度在80微米以下。虽然最亮的功能的信号电平可以很容易地在两种方法之间匹配的共聚焦图像(图7(a))中,整体图像的对比度大大降低背景灰雾的存在。双光子激发的图像(图7(b))相比较而言,显示出优异的强度对比。由于散射的荧光厚的生物标本中是显着的,使用退扫描检测,即使有一个“开放的”针孔,不足以获得双光子激发的优点。

为了实现的全部潜力,一个非退检测方案(参见图4),其中的荧光不返回通过扫描系统,因为它必须在共聚焦显微镜中,需要增加的荧光收集效率。使用图7中所示的相同的鲨鱼标本,采用退扫描(针孔“开放”)和非退扫描检测方法在图8中的图像的比较。每个检测的几何形状,在相同的成像光学元件的使用,包括二色镜,屏障过滤器和光电倍增管检测器。最初,将试样用上面提供了一定强度的对比度(图8(a))的最大深度(140微米)附近的退扫描检测成像。所有设置保持固定的,而在图8(b)中呈现的图像切换到非退检测,收集。很显然,这种非退图像完全饱和(最大显示亮度)在许多领域,展示了改进的信号采集与检测的几何形状。的激发条件,因为在这两种情况下是相同的,这个信号强度增加八倍可以完全归咎于收集散射的荧光光子,启用的非退检测的几何形状。以获得完整的范围内不饱和的图像(图8(c)图中所示),在光电倍增管的电压,从1000减少到750伏,这意味着该样品可以利用的非退检测装置,更深层的扫描。事实上,在该样品上可接受的成像穿透深度的组织,但并不限定于由物镜的工作距离。

图像分辨率

与双光子激发所获得的图像分辨率优于实现良好对准的共聚焦显微镜。较长的激发波长(例如,红色或红外线,代替紫外线或蓝色)的利用率,尽管双光子激发的一个有利方面,在一个较大的分辨光斑的实际结果。如果无法解析的共聚焦显微镜中的生物结构,同样没有解决在双光子激发激光扫描显微镜。虽然这一点是很好的理解经历了这些技术的显微镜,在生物医学研究领域的潜在用户通常认为双光子激发的优势,包括更高的分辨率。

成像厚标本

如前所述,双光子激发的更有效的厚的样品成像,由于三个因素的综合效果:聚焦吸收不足使更多的激发光,以达到预期的试样区域,红色的是激发光散荧光散射的影响较少的危害比共聚焦显微镜双光子显微镜。当利用长工作距离的光学元件和非退检测配置,往往是有限的穿透深度和图像质量的能力,有效地标记组织。引进荧光标签进入组织变得越来越困难,在更深处。利用绿色荧光蛋白(GFP)在转基因动物中的表达的实验是在体内,有可能提高双光子激发成像。转基因动物改进技术,特定器官和对动物蛋白的检测采用双光子激发荧光标记的发展提供了巨大的承诺。某些组织特征可能施加额外的限制穿透深度成像厚的标本,要么大量色素组织的特别关注,如动物肝脏,或高散射组织,如皮肤。

薄的样品成像

一般情况下,薄的样品成像并不一定有利于从双光子激发比传统的共聚焦显微镜的技术显着。这样做的原因是略有增加光在焦平面(在厚的样品的总的光漂白大大降低相比,现有技术中,如在图3中示出),可能会发生的。有应用程序,但是,其中的双光子激发是有利的,即使是薄的准备;一个实施例中的紫外线激发荧光团,如NADH(下面进一步讨论)的摄像。在此类实验中,由紫外线造成的损害更明显比双光子诱导漂白。在评估双光子激发的潜在好处,它始终是值得首先开展实验共聚焦显微镜。一旦知道期望的成像的共焦所施加的限制,然后很容易地确定是否完成实验的双光子激发的使用将是有利的。

吸收光谱

这是常见的双光子吸收光谱承担相应的单光子光谱的相似性很小。到目前为止取得的经验表明,大部分的荧光基团的功能相当好时,双光子激发的照明具有两倍的波长的荧光基团的单光子的吸收峰。对于本文的讨论范围之外的物理-化学的原因,具有非对称的化学结构的荧光基团倾向于坚持这种关系更加紧密地比对称的。例如,特征在于,一种非对称的荧光基团荧光蛋白(CFPGFPYFP,和其他),并在两倍的单光子激发波长强烈吸收。然而,对于双光子激发显微镜的能力被充分利用,荧光团的吸收光谱必须进行测量。这是相当多的挑战技术上比传统的单光子吸收光谱测量,只有少数的该信息的来源存在。作为利用显微技术增加,它是可能的双光子吸收光谱将变得更加普遍可用。

本地化的光化学

双光子激发的一个附加功能是在焦区的试样的光化学反应的启动。各种实验用的化学过程,涉及紫外线光致反应,可以被取代的双光子激发。反应的一类,染料的uncaging的,光化学诱导非荧光分子的荧光,可以启动单个细胞中,用双光子激发的组织。同样,生物刺激剂或抑制剂可以由相同的激发过程开锁。各种各样的潜在2光子激发的uncaging的方法有没有得到充分的发展,主要是由于产生光化学反应,其范围可以从毫秒到几秒的动力学限制。因此,物镜化合物可能扩散激发时间,它成为活跃的时间之间的试样内的几微米。尽管这一困难,该技术在一些有趣的生物学的应用很可能是有价值的,其中一些是在下面的章节中讨论。

激光光源

用于双光子激发显微镜的仪器要求几乎是相同的共聚焦显微镜的激光激发源的异常,这是相当大的差别。超快锁模激光器系统的两种类型的一般使用与当前的双光子激发显微镜:掺钛蓝宝石激光的Nd:YLF激光器。虽然这些系统可以从普通的电源插座供电,不需要冷却水,他们比小型风冷激光共聚焦显微镜采用相当昂贵。在Ti:蓝宝石激光器(700至1100纳米)的波长可调谐性更大的通用性比单波长的Nd:YLF激光器(1047纳米),和目前的商业模型,钛蓝宝石激光器的波长范围720至900覆盖纳米通过方便地实现计算机控制。激光照排系统的易用性和多功能性的进一步改善,在可预见的未来很可能继续。

激光功率

所需的激光功率,以激发荧光基团的含试样都有一个最佳的限制值。随着激光功率的增加,荧光强度的增加,荧光团的饱和度饱和度的条件下发生在足以导致显着的比例存在的荧光分子的激发,而不是基态(此功率级大约是单光子激发,在试样1毫瓦和50毫瓦的激光功率是在双光子激发的试样)。在高功率水平,额外的光子根本无法激发更多的荧光分子。任何超出饱和点的激发能量增加有助于增加的光损伤和光漂白。每个实验装置必须束扫描过程中施加的损害进行评估,重要的是要认识到琐碎的细胞活力测试(如酯酶活性或染料排斥)并不总是准确地反映细胞光损伤。对于许多实验,更严格的功能测试可以提供更多资料。作为例子,在最近发表的调查,确认仓鼠胚胎的生存能力通过续发展,而在另一种是通过维持正常的葡萄糖刺激的NAD(P)H的响应确认胰岛的生存能力。

作为双光子激发显微镜

一些最近发表的实验结果的例子说明常见的情况下,双光子激发提供优于聚焦成像。虽然在这个讨论中没有提供详细的实验,双光子激发造成的其光毒性降低的好处亮点聚焦,提高组织成像深度,启动本地化的光化学反应的能力。

双光子激发显微镜一般比激光共聚焦显微镜,最近的一项研究证明了利用仓鼠胚胎发育时间推移成像光毒性。在这个例子中,胚胎的发展要监视的连续10个小时以上,使用双光子激发的一个重要的线粒体染料。相比较而言,当聚焦的方法,正常胚胎发育停止后,只有几分钟的共聚焦激光曝光。研究人员得出的结论是双光子激发激光的波长较长的(1047纳米)允许胚胎存活率大大增加了时间。同样的调查还利用双光子激发显微镜无机磷酸盐仓鼠胚胎发育的影响进行评估。在这个实验中,生活仓鼠胚胎培养在不同量的无机磷酸盐,线粒体分布在6个小时的培养,使用双光子激发显微镜成像。进一步的胚胎发育,形态评估后进行27小时和51小时的文化。双光子照明非扰动的发展仓鼠胚胎从这些研究提供了明确的证据,而他们破坏并行共焦成像。

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两个已发表的研究利用无毒的双光子激发的性质,来执行在人体皮肤的体内成像。一项调查涉及从皮肤采集的自体荧光信号,在不同深度(0〜50和100〜150微米),利用激发波长范围从730到960纳米的详细的光谱。与反射光的共聚焦显微镜结合使用时,在相结合的手法从皮肤的相同区域中,提供详细的非破坏性的反射光,皮肤层的自体荧光图像。

双光子激发提供避免紫外线照射的光毒性作用的能力,在该光谱范围内的被激活的荧光物种。此功能特别有益的成像自然产生降低吡啶核苷酸[ NAD(P)H ]作为细胞呼吸指标。由于NAD(P)H具有小的吸收截面,一个低的量子产率,并吸收在紫外,它是难以激发和测量,并有可能造成相当大的光损伤。NAD(P)H成像已动用部分分化培养L6肌管细胞的病理生理研究。表现在细胞NAD(P)H图像的自体荧光图案主要反映在线粒体中的NADH圈点地区弥漫的细胞质信号。在分化的细胞中,荧光是线粒体本地化为列肌纤维之间的条痕,和伴随的荧光增加的葡萄糖浓度的增加,可见一斑。本研究证明了在糖代谢中的均匀性,和葡萄糖利用的动力学可以实时定义为一个单细胞,或可被平均在几个细胞。

在文献中已报道的其他领域,调查为中心对个人的β细胞的胰岛内NAD(P)H的定量双光子成像,这是一种准球形微约1000个细胞组成的器官。双光子技术的空间分辨率扩大的整体核苷酸成像,允许的细胞质和线粒体NAD(P)H的信号的分离。图9给出一个典型的图像于一个完整的胰岛β细胞的NAD(P)H的自体荧光,显示从细胞质和线粒体中的信号,后者是更明亮,有些点状。单细胞的轮廓是可见的,如细胞核,这两者出现暗。在这些区域的胰岛β细胞的细胞质和线粒体信号由分离葡萄糖和丙酮酸的代谢详细检查成为可能。

目前的模型对葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)建议进一步沿信号转导通路的代谢产物刺激了类似的事件,导致胰岛素分泌的信号级联,虽然的丙酮酸会加强GSIS,但不会诱发自身的胰岛素分泌。利用双光子激发成像的NAD(P)H,细胞质和线粒体信号分离,所述研究表明,β-细胞代谢丙酮酸,虽然瞬时。这样一个短暂的线粒体反应表明两个独立的模型,目前正在研究:要么线粒体丙酮酸运输或三元周期后期丙酮酸代谢过程中被抑制。利用双光子激发技术,生活胰岛被反复扫描,以产生数据采样的时间间隔是通过生物 ​​化学的方法无法得到的。此类型的重复成像根本不能使用共聚焦显微镜进行,因为通过光漂白和紫外线光引起的光损伤的限制。

由于双光子激发显微镜利用锁模激光器(脉冲),它可以很容易地扩展到组合与荧光寿命成像。基于纳秒荧光衰减时间的图像提供的信息是独立的荧光浓度。一个潜在的应用是利用荧光寿命成像,荧光共振能量转移(FRET)效率两个探针之间取得一个明确的值在最近的一项调查,双光子激发的寿命成像显微镜的NAD(P)H的定量测定在不同的亚细胞的NAD(P)H +浓度。NADH水平,在细胞核内调节辅阻遏芽期耐冷性,这是在细胞周期调控的参与者和改造转录途径。通过双光子激发显微镜的NAD(P)H和寿命成像的结合使用,它表明,在细胞核中的自由的NADH水平密切对应的半最大浓度为CTBP绑定。

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双光子激发的技术可以结合范围广泛的其他建立的生物物理技术,包括荧光相关光谱(FCS)和荧光漂白后恢复(FRAP)。这些技术中的每一个通常利用固定单光子(连续波)激光。FCS技术确定的职业数量和荧光探针固定光束的焦点体积内的扩散特性,并已成功地应用在分子间的相互作用和扩散研究。通过控制激光焦点区域,然后通过观察荧光恢复荧光漂白,FRAP已经来研究宏观的荧光分子扩散。这两种FCS和FRAP技术已被广泛使用,以调查对培养的细胞膜荧光探针的扩散特性的。迄今为止,这些技术的复杂性限制了它们的应用程序,在体外系统中,细胞培养模型。定量数据时,需要从任一方法,在双光子激发显微镜定义良好的激发体积是一个优势。此外,FCS和FRAP可以预期在比单光子激发的研究双分子动力学,在厚的活组织,而采用双光子是非常有价值的。

深试样的渗透与双光子激发获得允许在体内成像,虽然成像时必须克服一系列的挑战生活的动物。可通过双光子激发体内荧光成像通过手术的开孔在活的动物的皮肤,或通过“窗口”盖玻片放置到动物。另外一个活的动物工作的并发症是荧光标记标本的难度相当大。一个发表的研究报告,使用的Ca2 +指示剂在活老鼠的神经元特异性标记,允许监测神经功能,采用双光子激发技术。绿色荧光蛋白(GFP)的荧光标记特定器官和蛋白质在转基因动物中的表达肯定会导致额外的应用程序的双光子激发,在体内成像。由于活标本的可能性,将在成像过程中移动,体内研究的大多数当前与麻醉动物,成像率增加,以限制这个运动的效果。它很可能是未来的技术进步,如直接安装到活体的小型化双光子显微镜,将允许在自由活动动物的体内成像。

一些研究人员采用批量装载钙指示剂结合的双光子激发显微镜映射的神经元在小鼠脑片的微型电路。他们的方法是触发信号的神经元,然后发起所谓的“跟随者”的神经元连接的钙信号映射。确定新皮层是由众多的正是组织的微电路。确定的追随者属于几个区分解剖类和它们的位置,可以预测在不同的动物。

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一个潜在的非常强大的应用程序的双光子激发显微三维分辨光致笼化合物,简称为的uncaging例如,定量的双光子激发钙的uncaging了许多技术的焦点。正如先前所讨论的,光化学的uncaging的反应通常是相当慢(范围从毫秒到秒),它允许物镜化合物的激发时,它成为活跃的时间之间的试样内扩散超过几微米。的扩散不存在某些应用中,如“标记”的的细胞uncaging膜无常荧光分子中的一个问题。一组调查人员已经成功地使用双光子激发光解释,结合激光共聚焦显微镜,追踪海胆胚胎细胞系的发展。

更快的反应的uncaging分子已被成功地利用由其他研究人员在调查的的兴奋剂uncaging,它们采用双光子激发的地图神经元受体。在这些研究的过程中,光化学的uncaging的扩大利用出笼兴奋剂控制的位置,在成像介质的双光子激发的三维性质。细胞膜附近开锁兴奋剂,它刺激受体在靠近,通过膜片钳细胞的过程中被检测到的。在这种类型的成像,测量兴奋性反应,而不是发射光子映射图像。作为具体的例子,连同用于信号检测的全细胞钳的的的uncaging MNI-谷氨酸成功映射谷氨酸受体。标本培养海马神经元和海马CA1锥体神经元的急性片制剂。进行这项研究的研究人员能够获得优异的侧向和轴向的全宽度半最大值(FWHM)为0.6和1.4毫米的直径,分别切片中的制剂,指示快速的uncaging反应时间。进一步确定,蘑菇棘丰富的α-氨基-3 -羟基-5 -甲基-4 -异唑丙酸(AMPA)型谷氨酸受体,这些受体的分布是高度相关的脊柱几何。

结论

双光子激发显微厚的完整的组织标本,如动态的活细胞成像提供了巨大的效用。该技术使得有可能多次实验中,不能执行传统的成像,或将无法提供所需的信息。依托锁模(脉冲)激光照射产生足够的光子密度的焦点,双光子激发只发生在焦平面。局域激发的好处是,排放量被限制在狭窄的焦点区域,提供切片的能力,而不使用一个针孔。此外,激发区域有限,因为光损伤主要限于焦量,降低了光毒性。

双光子激发显微镜虽然不产生更高的分辨率比共聚焦显微镜的图像,但是它允许使用厚的样品的穿透深度增加。的更大的穿透深度是可能的,部分原因是打开针孔几何形状的双光子显微镜,聚焦的激发光的吸收的情况下,减少散射的激发光(因为它的波长)。为了充分利用深度渗透,必须使用非退扫描检测几何形状影响散射荧光光子收集效率急剧增加。双光子激发的优点,被清楚地确定,并允许进行的实验将是不可能的,利用共聚焦显微镜。由于这种技术的好处从可预测的技术改进和成本降低,并且变得更加流行的,它被预期,将实现越来越多的令人振奋的实验结果。