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奥林巴斯显微镜:荧光寿命成像显微术(FLIM)

2013-10-16  发布者:admin 

观察生物材料(如蛋白质,脂质,核酸,和离子)的分布的组织和细胞的研究领域中,积极地使用多颜色用荧光染料染色。荧光观察的检测技术已经发展到一个单一的荧光染料分子的水平下最好的情况下,可以检测到。本节回顾荧光寿命成像显微镜(FLIM),一个新的荧光显微镜技术的几个重要方面。此外多色染色,还可以利用荧光寿命成像可视化的因素的影响,也就是说,在分子周围的环境的状态的染料分子的荧光寿命特性。

波长光谱

传统的荧光显微镜利用荧光染料,也就是标识基于荧光染料的光谱特性之间的差异的颜色属性。利用这种技术,可以同时使用五个或六个染料在从紫外光到近红外的波长范围内,在显微镜下没有颜色之间的混淆。

寿命谱

每一个荧光染料,有自己的生命周期,处于兴奋状态。通过检测寿命的差异,这是可以区分具有相同的荧光色,以及识别自体荧光的染料。此外,使用具有很长的使用寿命比通常使用的荧光染料的探针,可以通过以下方式获得高的信号噪声的图像。例如,铂粪卟啉有一生的毫秒量级,而普通的荧光染料的寿命是纳秒级。这种相对长寿命的荧光染料将很快被用作探针的DNA芯片上检测。

荧光寿命成像也使得有可能获得分子的信息,同时观察活细胞。荧光寿命的影响因素包括当两种蛋白质彼此接近时,离子强度,憎水性能,氧浓度,分子结合,能量转移和分子间的相互作用。然而,终生是独立的染料浓度,光漂白,光散射和激发光的强度。因此,荧光寿命成像,使我们能够进行精确的离子浓度测量和荧光共振能量转移(FRET)分析。

荧光寿命成像的方法有两种:时域方法和频域方法。

· 时域FLIM -通过脉冲激光激发后的延迟在某些情况下,荧光图像可以通过以下方式获得的图像增强器的门控操作。通过激光,脉冲持续时间为几百皮秒和纳秒级快门的激发态的寿命,因为通常是120纳秒,以纳秒为单位计量的寿命。一个高速栅极图像增强市售滨松光子学株式会社(日本滨松市)。在每个像素处的荧光寿命测量而不同的延迟时间,直到一个门打开,也可以通过以下方式获得。根据他们的一生中伪彩色的荧光寿命的图像显示。

· 频域FLIM -荧光寿命的计算通过测量荧光的相移和在其幅度的减少使用的检测器的增益调制器调制的激光作为激发光源时(为1200兆赫兹)。测量可以由激光扫描(光电倍增管)或使用的电荷耦合器件(CCD)。

flim figure1

应用

探头的周围环境检测到的事实,荧光寿命为敏感的氢离子浓度(pH),氧,和钙离子浓度的基础上。的绑定或分子之间的相互作用也可以结合测量FRET

钙离子浓度成像

当钙离子结合的Fura-2的荧光探针,例如,氟-3或钙绿,荧光寿命的荧光强度的变化。离子浓度测定用常规方法集中在强度上的变化。据的变化的钙离子浓度,染料之间的结合与非结合钙离子的变化的比率,这随后导致在试样中的测量点的荧光寿命的变化。除了钙离子探针,这种技术也适用于测量溶液pH和其他离子如钠离子和镁离子。

荧光共振能量转移(FRET

目前正在研究将进行FRET的绿色荧光蛋白(GFP)的变体(GFP用不同的荧光彩色)。荧光共振能量转移,使得它可以测量的荧光染料标记的一对两个蛋白之间的相互作用(关联或解离)。一个捐助荧光染料激发/发射波长较短的提供能量的到受体荧光染料的。激发态的供体染料的生存期是可变的,取决于受体(染料接收的能量)是否存在。基于生命周期的测量,因为这是没有必要考虑重叠的荧光在检测过程中,允许更好的定量。

临床影像

作为某些组织和cytodiagnostic标本有很强的自体荧光的探针,使用具有长寿命(以毫秒为单位)已尝试。长寿命的探针也可用于荧光原位杂交(FISH),可以同时使用的颜色的数量是有限的,因为使用该技术。血液中的氢离子浓度,以及氧和二氧化碳的压力,已经被测量荧光寿命的基础上,,虽然这样测量的仍然是不可能的,在显微镜下。